本發(fā)明屬于快速分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法及定量分析方法。

背景技術(shù)：

茶葉是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品，也是我國傳統(tǒng)的出口商品，由于具有獨特的芳香氣味，同時含有多種對人體有益的物質(zhì)，已成為世界上最受歡迎的飲品之一。然而，在茶葉種植過程中，病蟲害較多，為了減少病蟲草對茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，在生產(chǎn)過程中不可避免的使用各種農(nóng)藥，這些農(nóng)藥最終可能會殘留在茶葉中，給人類健康帶來嚴重威脅。許多國家和相關(guān)機構(gòu)已規(guī)定了茶葉中多種農(nóng)藥最大殘留量(MRLs)，從而保證消費者的健康以及國際貿(mào)易的順利進行。因此，為了保障茶葉質(zhì)量安全的最后一道防線，建立簡單有效、高靈敏度的分析方法用于茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測是十分必要的。

在茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測中，茶葉中大量的色素、甾醇、生物堿、茶多酚等基質(zhì)組分不僅會降低檢測結(jié)果的靈敏度和選擇性，而且還會對色譜柱、離子源和檢測器等造成極大的損害。因此，在進行儀器分析前，通常需要采用合適的樣品前處理技術(shù)避免基質(zhì)對目標物分析的干擾，提高檢測結(jié)果的準確性。目前，文獻上已報道過多種茶葉樣品的前處理方法，如凝膠滲透色譜(GPC)、固相萃取(SPE)、分散固相萃取(DSPE)、基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)、固相微萃取(SPME)等，然而這些方法通常較為繁瑣，使得檢測方法耗時過長。因此，發(fā)展簡便、高效的樣品前處理技術(shù)用于農(nóng)藥殘留的檢測是尤為關(guān)鍵的，能夠有效地保證茶葉中農(nóng)藥殘留檢測分析方法的建立。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法及定量分析方法，提取液中茶葉基質(zhì)的含量大大減少，凈化處理效果好，且農(nóng)藥的回收率基本不受影響，大大提高了樣品前處理的效果，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)對農(nóng)藥進行分離檢測，大大提高了農(nóng)藥的分離效率，檢測靈敏度和準確性高，且方法具有很好的重現(xiàn)性。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法，包括如下步驟：

1)提?。簩⒉枞~浸泡于水中，加入乙腈(ACN)提取茶葉中農(nóng)藥殘留，然后加入醋酸鈉(NaOAc)進行鹽析，使乙腈和水進行相分離，所得上層乙腈層即為茶葉提取液；

2)凈化：將步驟1)所得茶葉提取液中加入活性炭(AC)、N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)和硫酸鎂(MgSO₄)進行凈化，然后經(jīng)固液分離后，所得上清液即為茶葉凈化液，可以作為快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液。

按上述方案，所述茶葉預先進行勻質(zhì)化處理。

按上述方案，所述茶葉與水的質(zhì)量比在0.2-1范圍內(nèi)。

按上述方案，所述浸泡時間為5min以上，優(yōu)選5-80min。

按上述方案，所述乙腈的體積與茶葉的質(zhì)量的比例范圍為(2.5-10)mL：1g；提取時間在0.5-10min范圍內(nèi)。

按上述方案，所述醋酸鈉與水的質(zhì)量比在0.25-1.00范圍內(nèi)。在鹽析過程中，本發(fā)明加入NaOAC取代傳統(tǒng)的無機鹽，其與傳統(tǒng)的QuEChERS提取方法相比較，效果十分突出。傳統(tǒng)的QuEChERS方法在提取過程中通常同時加入硫酸鎂(MgSO₄)和NaOAC(或NaCl)，而NaOAC的量加入較少(與水的比例在0.1左右)，我們將醋酸鈉的量提高了2.5-10倍，茶葉提取液中的茶葉基質(zhì)較傳統(tǒng)方法少了很多，而對茶葉中殘留農(nóng)藥的提取效率沒有影響。

按上述方案，所述活性炭(AC)與茶葉的質(zhì)量比為0.01-0.5；所述N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)與茶葉的質(zhì)量比為0.1-2；所述硫酸鎂(MgSO₄)與茶葉的質(zhì)量比為0.2-2；凈化時間優(yōu)選0.2-2min?；钚蕴康奈侥芰軓?，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常在凈化茶葉時不采用活性炭，以避免活性炭對其中的農(nóng)藥殘留進行吸附，從而影響對茶葉中農(nóng)藥殘留的準確測定。本發(fā)明中意外嘗試了加入少量活性炭作為吸附劑之一，發(fā)現(xiàn)并不影響農(nóng)藥殘留的回收，反而會優(yōu)先吸附茶葉中其他物質(zhì)，最終凈化效果非常突出。

本發(fā)明在上述快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法的基礎(chǔ)上，進一步提供一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的定量分析方法，即將快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液采用標準曲線法經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行定量分析。具體包括如下步驟：

(1)按照本發(fā)明所述前處理方法，制備快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液；

(2)采用空白基質(zhì)匹配的校準曲線，將若干種農(nóng)藥在茶葉的空白基質(zhì)中配制成一系列濃度的標準混合溶液，并用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，然后以每一種農(nóng)藥以其濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標，繪制每種農(nóng)藥的線性標準曲線；

(3)將本發(fā)明所得快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，分別根據(jù)出峰時間和定性定量離子對確定農(nóng)藥具體類別，并將其峰面積分別代入對應農(nóng)藥的標準曲線，從而得到待測液中農(nóng)藥的含量。

按上述方案，所述標準曲線的濃度線性范圍在1-1000μg/kg。

按上述方案，所述若干種農(nóng)藥為1-69種，包括有機磷、有機氯、有機氮、菊酯類、苯基吡唑類等農(nóng)藥。

按上述方案，所述標準溶液的配制方法為：采用不含待測農(nóng)藥的空白茶葉樣品按照本發(fā)明所述前處理方法處理，得空白茶葉基質(zhì)；然后采用該空白茶葉基質(zhì)將若干種農(nóng)藥配制成一系列濃度的標準混合溶液，標準混合溶液中每種農(nóng)藥的濃度均在線性范圍內(nèi)。

按上述方案，所述氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測條件：采用中等極性的毛細管色譜柱進行分離，采用適當?shù)某绦蛏郎氐姆椒?，串?lián)質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式檢測。最優(yōu)選地，分離使用熔融石英毛細管色譜柱Rtx-5MS，30m×0.25mm id，膜厚0.25mm(Restek，Pennsylvania，USA)；氣相色譜升溫程序如下：在40℃保持4min，之后以25℃/min的速度升至125℃，再以10℃/min的速度升至300℃，保持6min，溶劑切除時間為7min；采用不分流模式進樣，進樣體積1μL；選用純度為99.999％的氦氣作為載氣，載氣流速為1.0mL/min；選用純度為99.999％的氬氣作為碰撞氣；進樣口、連接口和離子源溫度分別為250℃、250°℃和230℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明在QuEChERS的提取過程中，單獨使用乙酸鈉(NaOAc)取代傳統(tǒng)的QuEChERS方法中的無機鹽誘導相分離，得到的乙腈提取液中茶葉基質(zhì)的含量大大減少，且農(nóng)藥的回收率基本不受影響，大大提高了樣品前處理的效果；

(2)本發(fā)明在QuEChERS的凈化過程中，首次使用活性炭(AC)和N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)作為吸附劑用以去除茶葉提取液中的基質(zhì)干擾物，對茶葉的ACN提取液進行凈化，大部分的農(nóng)藥的回收率都在70-120％之間，同時活性炭比傳統(tǒng)的QuEChERS吸附劑GCB和C₁₈具有更好的去除色素的效果，大大提高了提取液凈化的效果；

(3)與石墨化炭黑相比，活性炭具有比傳統(tǒng)的QuEChERS吸附劑(GCB和C₁₈)更好的去除色素的效果，且價格非常便宜，大大降低了樣品分析的成本，在茶葉農(nóng)藥殘留分析中具有廣泛的應用前景；

(4)本申請所述的前處理方法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)對農(nóng)藥進行分離檢測，大大提高了農(nóng)藥的分離效率，并建立了茶葉中可能含有的絕大多數(shù)農(nóng)藥快速、有效的多殘留分析方法，檢測靈敏度和準確性高，且方法具有很好的重現(xiàn)性，并能成功應用于市場上多種茶葉農(nóng)殘的分析檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述前處理方法實施例1與傳統(tǒng)三種QuEChERS提取方法對比例1-3分別的得到的綠茶提取液(a)和凈化液(b)的顏色對照圖。

圖2為實施例2所采用的凈化液、所得凈化液與對比例4和5所得凈化液的顏色對照圖。

圖3a為實施例2所采用的凈化液、所得凈化液與對比例4和5所得凈化液吹干的顏色對照圖；圖3b為實施例2實施例2所得凈化液與對比例4和5所得凈化液的基質(zhì)干重對比。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實施例。

下述實施例中活性炭(AC)比表面積為427m²/g，但本發(fā)明并不限于該種活性炭，只要是比表面積高于100m²/g的活性炭，均可用于本發(fā)明。

下述實施例中，69種農(nóng)藥標準品(1000μg/mL，丙酮或甲醇)均購自農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究所(天津)，用色譜純丙酮配制成10μg/mL的69種農(nóng)藥的混合溶液，在后續(xù)實驗中，將其加入樣品溶液得到所需要的濃度。所有的標準溶液在-20℃冰箱中避光保存，實驗證明，在該條件下，所有農(nóng)藥標準品可穩(wěn)定保存至少兩個月。

下述實施例中，GC-MS/MS分析在島津GCMS-TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀上進行，配有EOC-20i自動進樣器(Kyoto，Japan)；數(shù)據(jù)采集和分析通過GC-MS工作站的軟件(Shimadzu,Kyoto,Japan)完成；分離是在熔融石英毛細管上進行，型號是Rtx-5MS，30m×0.25mm id，膜厚0.25mm(Restek，Pennsylvania，USA)；進樣量1μL。

下述實施例中，GC-MS/MS分析步驟的具體條件如下：氣相色譜升溫程序如下：在40℃保持4min，之后以25℃/min的速度升至125℃，再以10℃/min的速度升至300℃，保持6min，溶劑切除時間為7min；采用不分流模式進樣，進樣體積1μL；選用純度為99.999％的氦氣作為載氣，載氣流速為1.0mL/min；選用純度為99.999％的氬氣作為碰撞氣；進樣口、連接口和離子源溫度分別為250℃、250℃和230℃。但本發(fā)明并不限定氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的實驗條件和儀器參數(shù)。

實施例1

一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法，

1)提取步驟：稱取4.0g勻質(zhì)化的茶葉樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，然后加入20mL乙腈，渦旋1min；再加入4.0g NaOAc渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min，乙腈和水相分離，所得上清液乙腈層即為茶葉提取液(如圖1a所示)；

2)凈化步驟：取實施例1中的1mL茶葉提取液，加入10mg活性炭(AC)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)和150mg的硫酸鎂(MgSO₄)，渦旋1min后離心，收集上清液即為茶葉凈化液(圖1b)，可以作為快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液。

與傳統(tǒng)QuEChERS提取方法的比較，對照例1-3如下：

對照例1：NaCl和MgSO₄提?。悍Q取4.0g勻質(zhì)化的茶葉樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈，渦旋1min；然后加入1.0g NaCl和4.0g MgSO₄渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min，取出上清液即為提取液，作為對照例1。

對照例2：NaOAc和MgSO₄提?。悍Q取4.0g勻質(zhì)化的茶葉樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈，渦旋1min；然后加入1.0g NaOAc和4.0g MgSO₄渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min，取出上清液即為提取液，作為對照例2。

對照例3：NaOAC(1％乙酸)和MgSO₄提?。悍Q取4.0g勻質(zhì)化的茶葉樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈(含1％乙酸)，渦旋1min；然后加入1.0g NaOAc和4.0g MgSO₄渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min，取出上清液即為提取液，作為對照例3。

本實施例1所得提取液、對照例1-3所得提取液分別如圖1a所示，很明顯本實施例步驟1)所得提取液顏色更淺。

將對照例1-3所得提取液分別用100mg PSA、10mg AC和150mg MgSO₄進行凈化，所得凈化液分別如圖1b所示，并與本實施例所得凈化液進行比較，可知：本實施例采用改進的QuEChERS提取方法在后續(xù)凈化過程中可以將色素顏色全部除去，為無色透明溶液；而對照例這三種方法只能去除部分色素，凈化液仍帶有淺黃色。

為了進一步驗證本實施例與對照例1-3中所得提取液和凈化液中基質(zhì)含量的差別，分別取5mL提取液和凈化液用N₂吹干后，比較其中基質(zhì)的干重，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：本發(fā)明采用改進的QuEChERS提取方法所得提取液中基質(zhì)干重明顯低于對照例三種提取液，經(jīng)AC、PSA、MgSO₄吸附劑除雜凈化后的干重更是大為減少，干重含量不到對照例1-3所得凈化液的10％。

表1

實施例2

一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法，凈化步驟如下：

取實施例1中的1mL茶葉提取液，加入10mg活性炭(AC)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)和150mg的硫酸鎂(MgSO₄)，渦旋1min后離心，收集上清液即為茶葉凈化液(圖2)，可以作為快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液。

與傳統(tǒng)QuEChERS凈化方法進行比較，對照例4-5如下：

對照例4：取實施例1中的1mL茶葉提取液，加入10mg石墨化炭黑(GCB)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)和150mg的硫酸鎂(MgSO₄)，渦旋1min后離心，收集上清液即為茶葉凈化液，作為對照例4。

對照例5：取實施例1中的1mL茶葉提取液，加入10mg C₁₈、100mg N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)和150mg的硫酸鎂(MgSO₄)，渦旋1min后離心，收集上清液即為茶葉凈化液，作為對照例5。

如圖2所示，實施例2與對比例4、5的不同之處在于實施例2使用了活性炭凈化，而對比例4和5中分別使用了GCB和C₁₈凈化，很明顯：實施例2所得凈化液中色素幾乎被吸附完全，而對比例4和5所得凈化液樣品還有較深的顏色。

同時，用稱重法進一步比較實施例2和對照例4、5的凈化效果：取等量上述凈化液(5mL)用N₂吹干后，吹干后基質(zhì)殘留如圖3所示，實施例2所得凈化液中基質(zhì)殘留最小，僅為30％左右，而對比例4和5所得凈化液的基質(zhì)殘留量有50％左右。

最后，我們也對69種農(nóng)藥的添加回收率進行了考察，如表2所示。結(jié)果表明：實施例2中大部分農(nóng)藥的回收率都在70-120％之間，可以滿足分析檢測的要求。因此，在凈化過程中選擇適量的AC，可以達到比傳統(tǒng)QuEChERS吸附劑更好的除基質(zhì)效果，同時不會對農(nóng)藥的回收率產(chǎn)生較大的影響。

表2

實施例3

目前，在茶葉種植過程中使用到的農(nóng)藥種類很多，本發(fā)明建立了通用的快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法，本實施例選擇了69種常用農(nóng)藥(包括有機磷、有機氯、有機氮、菊酯類、苯基吡唑類等)用于該方法的考察。為了獲得更高的選擇性和靈敏度，本實施例采用農(nóng)藥的標準溶液對該檢測方法中的GC-MS/MS分析中農(nóng)藥的前體離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量進行了優(yōu)化，對每種農(nóng)藥優(yōu)化了兩個離子對，分別用于定性、定量分析，優(yōu)化的結(jié)果如表3所示。

表3. 69種農(nóng)藥的保留時間、定性定量離子對以及碰撞電壓

實施例4

為了驗證本發(fā)明所提供的快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法在實際應用中的可行性，本實施例對其線性、檢出限(LODs)、定量限(LOQs)、精密度等參數(shù)進行了考察。在GC-MS/MS分析中，基質(zhì)效應會嚴重影響分析物定量分析的結(jié)果，為了避免基質(zhì)效應，本實施例采用空白基質(zhì)匹配的校準曲線。標準曲線的建立過程如下：

1)稱取4.0g勻質(zhì)化的空白茶葉樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈，渦旋1min；然后加入4.0g NaOAc渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min使乙腈和水相分離，得到提取的上清液，即為茶葉提取液；取1mL茶葉提取液至2mL離心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，渦旋1min后離心，收集上清液，即得空白茶葉基質(zhì)；

2)采用該空白茶葉基質(zhì)將69種農(nóng)藥配制一系列濃度的標準混合溶液，其中每一個標準混合溶液中每種農(nóng)藥的濃度均在1-1000μg/kg范圍內(nèi)，然后以每一種農(nóng)藥以其濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標，建立每種農(nóng)藥的線性標準曲線。

如表4所示，69種農(nóng)藥在1-1000μg/kg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸系數(shù)的平方(R²)大于0.9929；并且，以信噪比的3倍和10倍計算出69種農(nóng)藥的檢出限和定量限分別在0.1-1.8μg/kg和0.4-5.9μg/kg的范圍內(nèi)。

表4 69種農(nóng)藥在綠茶樣品中的線性范圍、線性方程、回歸系數(shù)的平方(R²)、檢出限(LODs)和定量限(LODs)

實施例5

為了評價本發(fā)明所提供的快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法的準確性，本實施例對該方法的回收率進行了考察。具體步驟如下：

1)稱取4.0g勻質(zhì)化的空白茶葉樣品于50mL離心管中，添加了低(10μg/kg)、中(50μg/kg)、高(200μg/kg)三個濃度的69種農(nóng)藥作為分析物，放置30min后，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈，渦旋1min，然后加入4.0g NaOAc渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min使乙腈和水相分離，得到提取的上清液，即為茶葉提取液；

2)取1mL步驟1)所得茶葉提取液至2mL離心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，渦旋1min后離心，收集上清液，所得上清液即為茶葉凈化液，可以作為快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液；

3)將步驟2)所得待測液在同樣條件下進GC-MS/MS分析，分別根據(jù)出峰時間和定性定量離子對確定農(nóng)藥具體種類，將每種農(nóng)藥所得峰面積分別代入實施例4對應的線性方程中，計算得到待測樣品中每種農(nóng)藥的濃度；然后通過計算的值除以添加的值即可以得到農(nóng)藥的添加回收率，結(jié)果如表5所示。

另外，我們以一天內(nèi)單獨配制4組平行樣品進行實驗，根據(jù)得到的檢測結(jié)果計算出日內(nèi)相對標準偏差；以連續(xù)4天單獨配制的樣品進行實驗，根據(jù)得到的檢測結(jié)果計算出日間相對標準偏差，結(jié)果如表6所示。

由表5所知：本發(fā)明所述方法中大部分農(nóng)藥的回收率在70～120％，RSDs低于13.9％；其中，少數(shù)幾種農(nóng)藥如亞胺硫磷、蠅毒磷、苯醚甲環(huán)唑、久效磷、嘧霉胺等由于極易被AC吸附，故回收率偏低。由表6可知：本方法得到的日內(nèi)相對標準偏差低于9.9％，日間相對標準偏差低于13.9％，說明本發(fā)明建立的快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法重現(xiàn)性良好。

表5.茶葉中69種農(nóng)藥在低、中、高三個濃度水平下的平均加標回收率和RSD％(n＝4)

表6.方法的日內(nèi)及日間精密度

實施例6

一種快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法，本實施例對4個綠茶和4個紅茶實際樣品(所有實際樣品來自湖北省各地區(qū)的超市及市場)進行分析，每個實際樣品的具體步驟均如下：

1)稱取4.0g勻質(zhì)化的茶葉實際樣品于50mL離心管中，加入10mL純水浸泡30min，加入20mL乙腈，渦旋1min。然后加入4.0g NaOAc渦旋1min，隨后以5000r/min的速度離心5min使乙腈和水相分離，得到提取的上清液，即為茶葉提取液；

2)取1mL步驟1)所得茶葉提取液至2mL離心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，渦旋1min后離心，收集上清液；所得上清液即為茶葉凈化液，可以作為快速測定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測液；

3)將步驟2)所得待測液在同樣條件下進GC-MS/MS分析，分別根據(jù)出峰時間和定性定量離子對確定農(nóng)藥具體類別，將每種農(nóng)藥所得峰面積分別代入實施例4對應的線性方程中，計算得到待測液中每種農(nóng)藥的濃度，并換算成茶葉實際樣品中每種農(nóng)藥的濃度。

結(jié)果如表7所示，在8個茶葉實際樣品中都檢測出一定量的農(nóng)藥殘留，檢出率最高的農(nóng)藥是溴蟲腈、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯。

表7.實際茶葉樣品的檢出情況

注：n.d.表示未檢出。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。