本發(fā)明涉及一種鑒定的方法，具體涉及一種鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法，尤其涉及一種基于微波輔助提取技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，在國(guó)家食藥監(jiān)局、衛(wèi)生行政部門和公安機(jī)關(guān)的合力管控下，麻醉藥品和精神藥品的生產(chǎn)、銷售、使用環(huán)節(jié)得到有力監(jiān)控，2014年《國(guó)家藥物濫用監(jiān)測(cè)年度報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，醫(yī)療用麻醉藥品、精神藥品濫用情況均處在下降趨勢(shì)。然而，游離于國(guó)家管制的精麻藥品之外的新精神活性物質(zhì)(如抗精神分裂癥用藥)對(duì)公共健康構(gòu)成了一定的現(xiàn)實(shí)威脅，此類藥物在法律層面上講不屬于毒品范疇，卻能夠影響人的思維、情感和意志等心理過(guò)程，繼而改變個(gè)體的行為及活動(dòng)，長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生耐藥性和依賴性，過(guò)量使用易引起中毒，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。在涉及藥物輔助犯罪如麻醉?yè)尳?、迷奸案件時(shí)，常需對(duì)所涉藥物進(jìn)行認(rèn)定，藥物在體內(nèi)代謝快，而此類案件中，受害人往往報(bào)案間隔長(zhǎng)，到案時(shí)藥物的血、尿濃度常不能檢出而無(wú)法提供有價(jià)值的信息。因此，解決這一難題的唯一途徑可通過(guò)富角蛋白檢材分析，檢測(cè)指甲或毛發(fā)中常見(jiàn)的抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物，提供精麻藥物的濫用、非法使用的證據(jù)。

富角蛋白檢材是目前法庭科學(xué)領(lǐng)域的新型生物樣品，泛指指甲或毛發(fā)這種生物硬質(zhì)檢材，其取材方便無(wú)創(chuàng)、易保存運(yùn)輸、目標(biāo)物穩(wěn)定、檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)，能反映較長(zhǎng)攝藥史等優(yōu)點(diǎn)使其成為攝毒、涉藥案件的熱門檢材和研究焦點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前對(duì)于指甲樣品中的藥物提取方法主要為化學(xué)手段(如酸水解、堿消化、醇浸提)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)指甲釋放效率的研究，化學(xué)手段在指甲分析中存在反應(yīng)條件劇烈、總釋放效率低、方法精密度差等缺點(diǎn)，不適用于指甲這種硬質(zhì)檢材的分析。本實(shí)驗(yàn)室跳過(guò)化學(xué)法處理生物檢材的思維定勢(shì)，首創(chuàng)物理法(冷凍研磨聯(lián)合超聲浴技術(shù)，已獲專利ZL201210007109.9)分析指甲中的用藥相關(guān)標(biāo)志物。通過(guò)始終處于-196℃的冷凍研磨技術(shù)，保證用藥相關(guān)標(biāo)志物在提取過(guò)程中不被破壞或分解，并利用粉碎后的微米級(jí)指甲粒徑，從細(xì)胞水平增加了硬質(zhì)生物檢材與提取劑的接觸面積，有效提高指甲中用藥相關(guān)標(biāo)志物的分析效能、準(zhǔn)確度及精密度。但冷凍研磨聯(lián)合超聲浴技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)(>3小時(shí))，需要特殊設(shè)備(如抗超低溫研磨管、恒定頻率超聲浴裝置)，成本較高(冷凍時(shí)需要用到大量液氮)。

微波輔助提取技術(shù)是一種利用微波自有的穿透性、選擇加熱特性、非電離性、極低的熱慣性等特殊性質(zhì)進(jìn)行小分子提取的新技術(shù)，并逐漸成為近年來(lái)樣品前處理的熱點(diǎn)技術(shù)。在微波場(chǎng)中，對(duì)微波吸收能力的差異，使基質(zhì)中的待提取物從基質(zhì)中分離，并進(jìn)入介電常數(shù)低于基質(zhì)的提取劑中。對(duì)生物基質(zhì)而言，微波能會(huì)打開(kāi)并破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動(dòng)而引起分子運(yùn)動(dòng)的形式將其中的小分子釋放出來(lái)。

盡管微波輔助提取技術(shù)已在生物檢材分析中有所應(yīng)用，但由于提取劑受熱后會(huì)轉(zhuǎn)化為氣相，使得提取裝置內(nèi)壓力增大，故生物檢材的微波輔助提取技術(shù)通常需要耐高壓設(shè)備；同時(shí)提取劑往往不能直接分析，需增設(shè)二次提取步驟，間接降低了提取效能，增加了方法的不確定度。本專利方法不同于其他提取技術(shù)，采用含特定緩沖鹽的水基質(zhì)為釋放劑/提取劑，在常壓下進(jìn)行微波加熱，無(wú)需特殊耐壓裝置，集釋放、提取于一體，提取后可直接進(jìn)樣分析，運(yùn)用于富角蛋白檢材中能有效減少預(yù)處理時(shí)間和有機(jī)溶劑的使用量；此外，微波加熱的特點(diǎn)大大避免了樣品局部受熱的不均勻性，從而降低藥物分解概率，同時(shí)提高指甲中藥物的釋放效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有鑒定精麻藥物的方法中存在的樣品局限性問(wèn)題，提供一種基于微波輔助提取和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速分析指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法。待分析檢測(cè)的抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物分別為喹硫平、7-羥基喹硫平、氯氮平、去甲氯氮平、氟哌啶醇、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑、艾司唑侖、三唑侖、α-羥基三唑侖、阿普唑侖、羥基阿普唑侖、地西泮、去甲地西泮、硝西泮、7-氨基硝西泮、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、唑吡坦、多慮平、阿米替林、卡馬西平等。該方法可簡(jiǎn)便、快速地從指甲基質(zhì)中提取抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物，滿足法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域攝毒、涉藥相關(guān)案件的鑒定和偵破的需要。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供一種鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法，包括以下步驟：

步驟1：將待檢測(cè)指甲和氘代內(nèi)標(biāo)溶液一同置于聚四氟乙烯離心管內(nèi)，用微波爐進(jìn)行微波加熱處理；

步驟2：往步驟1處理得到的混合物中加入分析改性劑后，進(jìn)行渦旋、離心分離處理，得到不含指甲基質(zhì)的上層清液；

步驟3：對(duì)步驟2中得到的上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，對(duì)待檢測(cè)指甲中的抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物進(jìn)行確證。

在上述提供的方法中，其中所述的方法還包括對(duì)指甲鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括對(duì)指甲依次用去離子水和丙酮浸洗各兩次。指甲在各浸洗液中浸洗時(shí)間一般各為2～3min。

在上述提供的方法中，其中所述的微波輔助提取的時(shí)間控制在3-5min，提取兩次，微波功率為450-800W。優(yōu)選地，微波加熱處理時(shí)間為3min，微波功率為700W。

優(yōu)選地，上述步驟2中分析改性劑為甲醇。

本發(fā)明另一方面提供一種鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法在鑒定精麻藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明提供了一種鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法，該方法開(kāi)創(chuàng)性的在常壓下利用微波進(jìn)行輔助，提取固化/硬質(zhì)生物檢材中痕量抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物，并利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行符合國(guó)際與歐盟標(biāo)準(zhǔn)的確證分析，方法反應(yīng)條件溫和，總釋放效率高，精密度高，特異性強(qiáng)，選擇性強(qiáng)；并且本發(fā)明方法，無(wú)需過(guò)夜，無(wú)需特殊設(shè)備，耗時(shí)短，簡(jiǎn)便快速。

附圖說(shuō)明

圖1是微波輔助提取處理前指甲的激光顯微-表面形貌3D圖。

圖2是微波輔助提取處理后指甲的激光顯微-表面形貌3D圖。

圖3是微波輔助提取處理前指甲的掃描電子顯微鏡圖。

圖4是微波輔助提取處理后指甲的掃描電子顯微鏡圖。

圖5是微波輔助提取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的總離子流色譜圖。

圖6是對(duì)照實(shí)驗(yàn)中堿消化提取法的總離子流色譜圖及部分抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的抽離子色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法做進(jìn)一步說(shuō)明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但實(shí)施例的內(nèi)容并不限制本發(fā)明創(chuàng)造要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種快速鑒定指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的方法，先將待檢測(cè)指甲和內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4一同置于eppendorf離心管內(nèi)進(jìn)行微波加熱處理；將微波處理后得到的混合物加入甲醇，渦旋，并進(jìn)行離心分離；取離心分離后混合物的上層清液，對(duì)上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。具體步驟如下：

1)樣品預(yù)處理

對(duì)于攝毒、藥物者指甲處理前須進(jìn)行有機(jī)溶劑脫污染預(yù)處理。

對(duì)指甲的預(yù)處理按以下步驟進(jìn)行：將指甲樣品用5mL去離子水洗滌三次，每次3分鐘；再用5mL丙酮溶液清洗兩次，每次2分鐘。預(yù)處理過(guò)的指甲，在自然晾干后剪成細(xì)小碎片，待鑒定使用。將微波輔助提取前的指甲樣品取其中兩份，一份進(jìn)行激光顯微-表面形態(tài)分析，另一份噴金后，進(jìn)行掃描電鏡，并記錄下掃描電子顯微鏡圖。

2)抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的提取

本實(shí)施例中采取微波輔助提取法提取指甲中的衡量抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物。

步驟具體為：取剪碎后的指甲樣品，準(zhǔn)確稱取20mg，置于eppendorf離心管中，加入內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4100μL，置于微波爐，700W加熱處理兩次，每次3分鐘，中間間隔5分鐘以使體系冷卻。取出后靜置恢復(fù)至室溫，加入400μL甲醇，渦旋，12000r/min離心30s。取上清液200μL直接進(jìn)樣。微波輔助提取后，指甲結(jié)構(gòu)被破壞，指甲中的分析物得以釋放出來(lái)。取微波輔助提取后的指甲兩份，一份進(jìn)行激光顯微-表面形態(tài)分析，另一份噴金后，進(jìn)行掃描電鏡，并記錄下掃描電子顯微鏡圖。

3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

本實(shí)施例中液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜反應(yīng)條件如下：

a.液相色譜條件

色譜柱：ResteckAllure PFPP五氟苯基柱(100mm×2.1mm，5μm)，前接Zorbax Extend-C18Narrow-bore保護(hù)柱(2.1×12.5mm，5μm)。流動(dòng)相由20mmol/L乙酸銨緩沖液(A)與含20mmol/L乙酸銨的甲醇溶液(B)所組成，流動(dòng)相A和B組分的體積比在0～1min之間為40:60，在1～1.5min之間為40:60變至15:85，在1.5～4.5min之間為15:85，在4.5～5min之間為15:85變至5:95，在5～7.5min之間為5:95，在7.5～9min之間為5:95變至40:60；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

b.串聯(lián)質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式/ESI+，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式/MRM檢測(cè)。離子噴霧電壓(IS)：5kV；碰撞氣氮?dú)?CAD)：5psi(1psi≈6.9kPa)，氣簾氣(CUR)：30psi；霧化氣(GS1)：40psi，輔助氣(GS2)：60psi；離子源溫度(TEM)：500℃。

各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，選用兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行定性分析，其中第一對(duì)離子對(duì)用于定量分析。微波輔助提取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的總離子流圖如附圖5所示。

表1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)

實(shí)施例2

采用美容指甲鉗沿服藥患者指甲邊緣剪下后，保存于潔凈干燥的牛皮紙包中，于室溫下避光保存。指甲樣品用5mL去離子水洗滌三次，每次3分鐘；再用5mL丙酮溶液清洗兩次，每次2分鐘。室溫下晾干。將預(yù)處理過(guò)的指甲剪成細(xì)小碎片。取指甲碎片樣品，準(zhǔn)確稱取20mg，置于eppendorf管中，加入內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4100μL，置于微波爐，700W加熱處理兩次，每次3分鐘，中間間隔5分鐘以使體系冷卻。取出后靜置恢復(fù)至室溫，加入400μL甲醇，渦旋，12000r/min離心30s。取上清液200μL直接進(jìn)樣。將樣品進(jìn)行上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：在20mg指甲粉末中檢出11750pg/mg濃度的卡馬西平，368pg/mg濃度的氯氮平和174pg/mg濃度的去甲氯氮平。

實(shí)施例3

采用美容指甲鉗沿服藥患者指甲邊緣剪下后，保存于潔凈干燥的牛皮紙包中，于室溫下避光保存。指甲樣品用5mL去離子水洗滌三次，每次3分鐘；再用5mL丙酮溶液清洗兩次，每次2分鐘。室溫下晾干。將預(yù)處理過(guò)的指甲剪成細(xì)小碎片。取指甲碎片樣品，準(zhǔn)確稱取20mg，置于eppendorf管中，加入內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4100μL，置于微波爐，700W加熱處理兩次，每次3分鐘，中間間隔5分鐘以使體系冷卻。取出后靜置恢復(fù)至室溫，加入400μL甲醇，渦旋，12000r/min離心30s。取上清液200μL直接進(jìn)樣。將樣品進(jìn)行上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為：20mg指甲粉末中檢出5590pg/mg濃度的卡馬西平，2240pg/mg濃度的氯氮平和1705pg/mg濃度的去甲氯氮平，檢出氟哌啶醇的濃度大于檢出限，小于定量限；檢出地西泮的濃度大于檢出限，小于定量限，去甲地西泮無(wú)法檢出。

實(shí)施例4

采用美容指甲鉗沿同一服藥患者指甲邊緣剪下后，保存于潔凈干燥的牛皮紙包中，于室溫下避光保存。指甲樣品用5mL去離子水洗滌三次，每次3分鐘；再用5mL丙酮溶液清洗兩次，每次2分鐘。室溫下晾干。將預(yù)處理過(guò)的指甲剪成細(xì)小碎片。取剪碎的指甲碎片樣品，準(zhǔn)確稱取20mg，置于eppendorf管中，加入內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4100μL，置于微波爐，700W加熱處理兩次，每次3分鐘，中間間隔5分鐘以使體系冷卻。取出后靜置恢復(fù)至室溫，加入400μL甲醇，渦旋，12000r/min離心30s。取上清液200μL直接進(jìn)樣。將樣品進(jìn)行上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為：20mg指甲中檢出阿立哌唑的濃度約為51.8～168.9pg/mg，脫氫阿立哌唑的濃度約為2340～9000pg/mg。

實(shí)施例5對(duì)照試驗(yàn)

由于堿消化法能夠完全解構(gòu)指甲結(jié)構(gòu)，理論上認(rèn)為該樣品處理方法對(duì)指甲中目標(biāo)物的釋放最為完全，因此選用堿消化法與本發(fā)明的微波輔助提取方法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。采集一定數(shù)量的指甲，分別采用堿消化和微波輔助提取法處理，并對(duì)堿消化法與本發(fā)明提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果列于表2。實(shí)驗(yàn)表明，堿消化法反應(yīng)條件劇烈，對(duì)部分抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物尤其是苯二氮卓類物質(zhì)的原藥具有分解作用，難以檢出(見(jiàn)附圖6，6(A)為使用堿消化提取法的抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的總離子流色譜圖，6(B)、(C)、(D)分別為佐匹克隆、硝西泮和氯硝西泮的抽離子色譜圖)。本發(fā)明的微波輔助提取方法提取步驟簡(jiǎn)便快速、提取分析物分解較少，適合于實(shí)際案列中判斷指甲中抗精神分裂癥用藥體內(nèi)分析標(biāo)志物的快速鑒定，且操作簡(jiǎn)便、成本低。

表2對(duì)照試驗(yàn)中堿消化法與本發(fā)明提取方法的比較

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。