本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是一種卡式蛋白芯片及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白芯片技術(shù)作為近年來發(fā)展起來的一種多指標(biāo)并行檢測的新興技術(shù)，具有高通量，高信息量的特點，在科研和臨床診斷領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但是，由于技術(shù)上、成本上的因素，限制了其實際應(yīng)用，尤其是在臨床診斷領(lǐng)域還沒有得到應(yīng)有的推廣。目前，低成本、不用復(fù)雜昂貴設(shè)備、靈敏準(zhǔn)確、能迅速作一次多元檢測、操作簡便適用于快速床邊檢測（POCT）的低密度蛋白芯片是蛋白芯片領(lǐng)域的一個重要的研究和發(fā)展方向。

近20年來，以側(cè)向流免疫層析技術(shù)、滲濾法、斑點法為代表，研發(fā)生產(chǎn)用于疾病監(jiān)測和診斷的免疫檢測試劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于快速床邊檢測（POCT），隨著酶顯色、膠體金、膠體硒、熒光微球、化學(xué)發(fā)光、量子點和其他更靈敏的標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，快速檢測領(lǐng)域標(biāo)記技術(shù)呈現(xiàn)多樣化趨勢；由于這些技術(shù)的成熟應(yīng)用及其在快速檢測方面應(yīng)用的優(yōu)勢以及實用性，它們也同樣被應(yīng)用于蛋白芯片的研究和開發(fā)。

目前，這類型以免疫層析技術(shù)、滲濾法、斑點法技術(shù)為基礎(chǔ)，以POCT應(yīng)用為目標(biāo)的蛋白芯片產(chǎn)品在技術(shù)及應(yīng)用上已經(jīng)有了較大進(jìn)展，但仍存在有以下缺點：（1）產(chǎn)品質(zhì)量比較容易產(chǎn)生波動，不易進(jìn)行質(zhì)量控制；（2）同一個產(chǎn)品檢測以單一目標(biāo)為主，最多同時檢測2-3個指標(biāo)，多目標(biāo)檢測容易產(chǎn)生相互干擾；（3）所進(jìn)行的實驗基本只能進(jìn)行定性，不能進(jìn)行定量實驗；（4）對于多目標(biāo)體系，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系調(diào)整難度大。而傳統(tǒng)的載玻片、硅片等作為芯片片基類型的蛋白芯片又存在操作復(fù)雜或生產(chǎn)要求高、成本高等因素在應(yīng)用上受到很多限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種卡式蛋白芯片及其應(yīng)用，基于這種卡式結(jié)構(gòu)和反應(yīng)液體垂直方向由下向上的反向擴(kuò)散導(dǎo)流層析設(shè)計，可以設(shè)計出多種檢測模式和加樣模式，滿足對不同類型檢測的需求，同時該設(shè)計具有快速檢測的特性和可以同時進(jìn)行多指標(biāo)檢測的特性，適用于床邊多指標(biāo)快速檢測（POCT）。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片，包括了外殼殼體、加樣口、結(jié)果判讀窗口、功能墊、反應(yīng)膜、多孔材料和吸收墊，外殼殼體表面開設(shè)有加樣口和結(jié)果判讀窗口，功能墊設(shè)置于加樣口下方并與外殼殼體底部的多孔材料相連，反應(yīng)膜下側(cè)面與多孔材料相互貼合，結(jié)果判讀窗口下方嵌入設(shè)置有吸收墊，吸收墊設(shè)置于反應(yīng)膜兩側(cè)或環(huán)繞于四周周側(cè)。

其中，功能墊由加樣過濾墊和多層標(biāo)記物墊中的一種或多種疊合組成，加樣過濾墊為玻璃纖維，標(biāo)記物墊為含有示蹤標(biāo)記物標(biāo)記的抗原或抗體的玻璃纖維或無紡布。

優(yōu)選的，加樣過濾墊內(nèi)包埋固定有干擾消除劑，干擾消除劑為抗紅細(xì)胞抗體或抗IgM抗體，示蹤標(biāo)記物為熒光微球、量子點、膠體金或酶中的一種。

其中，反應(yīng)膜為具有上下通孔的膜材料，多孔材料為玻璃纖維、無紡布或尼龍膜中的一種，吸收墊為純棉絨漿濾紙、海綿或高分子吸水紙的一種。

優(yōu)選的，純棉絨漿濾紙克重為270g/m³，吸水量大于950g/m³。

優(yōu)選的，功能墊中還包括輔助反應(yīng)墊，輔助反應(yīng)墊為包埋固定有金屬鹽、蛋白質(zhì)或表面活性劑的玻璃纖維或無紡布。

本發(fā)明還公開了一種卡式蛋白芯片的應(yīng)用，上述的卡式蛋白芯片，應(yīng)用步驟如下：

a.在反應(yīng)膜上按照預(yù)設(shè)的位置分別固定所需檢測抗原或抗體，形成相應(yīng)的檢測陣列；

b.從加樣口加入待測樣本或待測樣本和稀釋液；

c.待測樣本或待測樣本和稀釋液通過功能墊，并經(jīng)多孔材料向上擴(kuò)散層析，到達(dá)反應(yīng)膜表面，在反應(yīng)膜上與檢測陣列發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進(jìn)行檢測結(jié)果讀取。

優(yōu)選的，步驟d還包括：等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，從結(jié)果判讀窗口加入示蹤標(biāo)記反應(yīng)液，待檢測點形成標(biāo)記免疫復(fù)合物后，通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進(jìn)行檢測結(jié)果讀取。

優(yōu)選的，步驟d還包括：在進(jìn)行檢測結(jié)果讀取之前，加入洗滌液洗去未結(jié)合在待測點上的反應(yīng)物。

其中，示蹤標(biāo)記反應(yīng)液為熒光微球、量子點、膠體金或酶標(biāo)記物標(biāo)記的抗原或抗體溶液。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.與傳統(tǒng)的側(cè)向流免疫層析蛋白芯片技術(shù)相比，該方法的主要特點是多孔性介質(zhì)在蛋白芯片反應(yīng)膜的正下方，反應(yīng)膜下側(cè)面與多孔材料相互貼合，反應(yīng)膜上的蛋白芯片點樣位點全部都在多孔性介質(zhì)的貼合范圍內(nèi)，待測樣本和反應(yīng)試劑在多孔性介質(zhì)中垂直方向由下向上的反向擴(kuò)散導(dǎo)流層析，最終均一地到達(dá)反應(yīng)膜，各反應(yīng)點之間并不會產(chǎn)生相互干擾，并在檢測點上進(jìn)行免疫反應(yīng)，降低了因側(cè)向流免疫層析芯片前后反應(yīng)區(qū)的不均一性,后反應(yīng)區(qū)會受到前反應(yīng)區(qū)干擾等因素引起的精密度變差以及漏診概率，更好的符合多指標(biāo)同時定性、定量準(zhǔn)確檢測的需求。

2.與傳統(tǒng)的玻片作為載體的蛋白芯片技術(shù)相比，本發(fā)明可以克服載玻片法蛋白芯片操作相對復(fù)雜的缺點，操作更加簡單，不需要儀器，最簡化的只要一次加樣就可以完成檢測，更加適用于床邊快速檢測。

3.與滲濾法蛋白芯片相比，可以預(yù)先將蛋白探針標(biāo)記物、抗干擾輔助成分、全血過濾組分等內(nèi)容放置于反應(yīng)結(jié)構(gòu)體系內(nèi)，簡化使用者在操作過程中的操作步驟。

4.經(jīng)過合理設(shè)計的卡式蛋白芯片對于標(biāo)記物、添加物和底物的加樣方式也可靈活選擇，除了通過加樣口加入樣本外，通過對功能墊進(jìn)行設(shè)計，增設(shè)過濾墊、多層標(biāo)記物墊和輔助反應(yīng)墊擴(kuò)展檢測類型，也可以通過結(jié)果判讀窗口進(jìn)行檢測劑添加，有利于反應(yīng)體系的調(diào)整，使反應(yīng)體系能更容易避開不同反應(yīng)物之間的干擾達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明卡式蛋白芯片的斷面圖。

圖2為本發(fā)明卡式蛋白芯片的俯視圖。

圖3為本發(fā)明卡式蛋白芯片中功能墊6的局部示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例3中使用蛋白芯片的斷面圖。

圖5為本發(fā)明實施例4中使用蛋白芯片的斷面圖。

主要部件符號說明：

1：外殼殼體，2：吸收墊，3：反應(yīng)膜，4：多孔材料，5：加樣口，6：功能墊，7：結(jié)果判讀窗口，61：加樣過濾墊，62：標(biāo)記物墊，63：輔助反應(yīng)墊，621：上層標(biāo)記物墊，622：下層標(biāo)記物墊。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實施例1

如圖1-3所示，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片，包括了外殼殼體1、吸收墊2、反應(yīng)膜3、多孔材料4、加樣口5、功能墊6和結(jié)果判讀窗口7。

結(jié)構(gòu)設(shè)計：

外殼殼體1表面開設(shè)有加樣口5和結(jié)果判讀窗口7，功能墊6設(shè)置于加樣口5下方并與外殼殼體1底部的多孔材料4相連，結(jié)果判讀窗口7下方嵌入設(shè)置有吸收墊2，吸收墊2設(shè)置于反應(yīng)膜3的兩側(cè)或環(huán)繞于四周周側(cè)，反應(yīng)膜3下側(cè)面與多孔材料4相互貼合。

功能墊6由加樣過濾墊61、多層標(biāo)記物墊62和輔助反應(yīng)墊63中的一種或多種疊合組成，加樣過濾墊61為選擇性包埋固定有干擾消除劑的玻璃纖維，干擾消除劑包括了抗紅細(xì)胞抗體、抗IgM抗體，標(biāo)記物墊62為含有示蹤標(biāo)記物標(biāo)記的抗原或抗體的玻璃纖維或無紡布，示蹤標(biāo)記物為熒光微球、量子點、膠體金或酶中的一種，輔助反應(yīng)墊63為包埋固定有金屬鹽、蛋白質(zhì)或表面活性劑的玻璃纖維或無紡布。

反應(yīng)膜3為具有上下通孔的膜材料，多孔材料4為玻璃纖維、無紡布或尼龍膜中的一種，吸收墊2為純棉絨漿濾紙、海綿或高分子吸水紙的一種。

其中，純棉絨漿濾紙規(guī)格為克重270g/m³，吸水量大于950g/m³。

使用方法：

a.在反應(yīng)膜3上按照預(yù)設(shè)的位置分別固定所需檢測抗原或抗體，形成相應(yīng)的的檢測陣列；

b.從加樣口5加入待測樣本或待測樣本和稀釋液；

c.等待待測樣本或待測樣本和稀釋液通過功能墊6，經(jīng)多孔材料4向上反向擴(kuò)散、導(dǎo)流層析與反應(yīng)膜3上載有的檢測陣列發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，選擇性從結(jié)果判讀窗口7加入洗滌液；通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進(jìn)行檢測結(jié)果讀取。

實施例2

本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在血液篩查4項檢測中的應(yīng)用，檢測對象為乙肝表面抗原HBsAg、人類免疫缺陷病毒抗體HIV-Ab、丙型肝炎抗體HCV-Ab、梅毒螺旋體抗體TP-Ab。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構(gòu)如實施例1所述，功能墊6包括了加樣過濾墊61和標(biāo)記物墊62，兩者材質(zhì)均為玻璃纖維，標(biāo)記物墊62中包含有標(biāo)記了熒光微球的表面抗體HBsAb1*、標(biāo)記了熒光微球的重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*、標(biāo)記了熒光微球的重組丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、標(biāo)記了熒光微球的重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag1*四種膠體金結(jié)合物；多孔材料4為玻璃纖維，反應(yīng)膜3為不帶襯底的硝酸纖維素膜，以陣列形式固定乙肝表面抗體HBsAb2，重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag2、重組丙型肝炎抗原HCV-Ag2、重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag2；

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入120μL病人血清待測樣本；

c.室溫下反應(yīng)20分鐘，待測樣本中的反應(yīng)物質(zhì)由功能墊6順次通過加樣過濾墊61和標(biāo)記物墊62，血清樣本中可能存在的反應(yīng)物質(zhì)HBsAg或HIV-Ab或HCV-Ab或TP-Ab與標(biāo)記物墊62中相應(yīng)的熒光微球標(biāo)記的抗原或抗體形成熒光微球標(biāo)記的第一步免疫復(fù)合物HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ab～TP-Ag1*，熒光微球標(biāo)記的第一步免疫復(fù)合物隨溶液經(jīng)多孔材料4向上擴(kuò)散，均勻地擴(kuò)散、層析到達(dá)反應(yīng)膜3表面，在反應(yīng)膜3的相應(yīng)檢測點進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成第二步固定化的熒光微球免疫復(fù)合物HBsAb2～HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ag2～HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ag2～HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ag2～TP-Ab～TP-Ag1*；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，未結(jié)合的血清樣本以及未結(jié)合的熒光微球結(jié)合物通過反應(yīng)膜3的側(cè)向?qū)游?被吸收墊2吸收，通過肉眼判讀結(jié)果，也可以采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例3

如圖4所示，為了提高檢測的效果，本實施例是在實施例2的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構(gòu)如實施例1所述，功能墊6包括了加樣過濾墊61和標(biāo)記物墊62,其中標(biāo)記物墊62包括了上層標(biāo)記物墊621和下層標(biāo)記物墊622，上層標(biāo)記物墊621中包含有標(biāo)記了熒光微球的表面抗體HBsAb1*、標(biāo)記了熒光微球的重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*，下層標(biāo)記物墊622中包含有標(biāo)記了熒光微球的重組丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、標(biāo)記了熒光微球的重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag1-Au兩種熒光微球結(jié)合物，這樣的組合結(jié)構(gòu)，減少了4種結(jié)合物在試劑制備時的相互干擾，提高了試劑的穩(wěn)定性和反應(yīng)性。

在反應(yīng)步驟d中，等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，從結(jié)果判讀窗口7加入100μL洗滌液，未結(jié)合的血清樣本和熒光微球標(biāo)記物以及洗滌液，通過反應(yīng)膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收；

通過肉眼判讀結(jié)果，效果比實施例2的結(jié)果更優(yōu)，信噪比更高，也可以采用配套的蛋白芯片膠體金讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例4

如圖5所示，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在雙抗體夾心法檢測4種心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物中的應(yīng)用，檢測對象是D-Dimmer、BNP、S100B、LP-PLA2 4種心腦血管疾病相關(guān)標(biāo)志物。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構(gòu)如實施例1所述，其中功能墊6只包括有加樣過濾墊61，在加樣過濾墊61中，包埋固定了抗人紅細(xì)胞單抗，多孔材料4為玻璃纖維，反應(yīng)膜3為尼龍膜，以陣列形式分別固定4種心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物抗體。

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入80μL病人全血待測樣本，全血樣本中的紅細(xì)胞與加樣過濾墊61中固定的抗人紅細(xì)胞單抗形成紅細(xì)胞免疫復(fù)合物，被截留在加樣過濾墊61中，樣本中的血清進(jìn)入多孔材料4中，全血樣本加樣結(jié)束后，從加樣口5再加入100μL 樣本稀釋液，樣本稀釋液與樣本一同進(jìn)入多孔材料4中；

c.室溫下反應(yīng)20分鐘，待測樣本中的心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物由多孔材料4向上擴(kuò)散、層析，均勻地擴(kuò)散、層析到達(dá)反應(yīng)膜3表面，在反應(yīng)膜3的相應(yīng)檢測點固定的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物免疫復(fù)合物；

d.從結(jié)果判讀窗口7加入100μL標(biāo)記有熒光微球的4項心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物抗體溶液，在反應(yīng)膜3上的相應(yīng)抗體位形成熒光免疫復(fù)合物，再加入100μL磷酸鹽緩沖液PBST進(jìn)行洗滌，未結(jié)合的血清樣本和熒光標(biāo)記物以及洗滌液，通過反應(yīng)膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收，通過采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例5

在實施例2或?qū)嵤├?的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將熒光微球替換為辣根過氧化物酶，最后步驟加入顯色劑，也可以完成蛋白芯片的檢測。

實施例6

在實施例2或?qū)嵤├?的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將熒光微球替換為膠體金，也可以完成蛋白芯片的檢測。

實施例7

在實施例2的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，功能墊6除了包括加樣過濾墊61和標(biāo)記物墊62外，增加了輔助反應(yīng)墊63，輔助反應(yīng)墊63材質(zhì)為玻璃纖維，包埋固定有NaCl以及Tween-20，適當(dāng)增加反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度以及表面活性劑濃度，提高了蛋白芯片檢測效果。

實施例8

本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在雙抗體夾心法檢測垂體腺瘤涉及激素的應(yīng)用，檢測對象泌乳素(PRL)，生長激素(GH)，促甲狀腺素(TSH)，黃體生成素(LH)，卵泡促激素(FSH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構(gòu)如實施例1所述，其中功能墊6包括了加樣過濾墊61和標(biāo)記物墊62，其材質(zhì)是玻璃纖維，其中標(biāo)記物墊62包括了上層標(biāo)記物墊621和下層標(biāo)記物墊622，在加樣過濾墊61中，包埋固定了抗人紅細(xì)胞單抗，上層標(biāo)記物墊621中包含了量子點標(biāo)記的PRL抗體和量子點標(biāo)記的GH抗體，下層標(biāo)記物墊622中包含了量子點標(biāo)記的TSH抗體和量子點標(biāo)記的LH抗體，多孔材料4為無紡布，反應(yīng)膜3為尼龍膜，以陣列形式分別固定6種垂體腺瘤涉及激素的抗體。

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入80μL病人全血待測樣本，全血樣本中的紅細(xì)胞與加樣過濾墊61中固定的抗人紅細(xì)胞單抗形成紅細(xì)胞免疫復(fù)合物，被截留在加樣過濾墊61中，樣本中的血清順次通過標(biāo)記物墊62進(jìn)入多孔材料4中，同時，上層標(biāo)記物墊621和下層標(biāo)記物墊622中的量子點標(biāo)記的PRL抗體、量子點標(biāo)記的GH抗體、量子點標(biāo)記的TSH抗體和量子點標(biāo)記的LH抗體隨著血清也進(jìn)入多孔材料4中，全血樣本加樣結(jié)束后，從加樣口5再加入100μL 樣本稀釋液，樣本稀釋液與樣本血清一同進(jìn)入多孔材料4中；

c.室溫下反應(yīng)20分鐘，待測樣本中的PRL、GH、TSH、LH與量子點標(biāo)記的相應(yīng)抗體形成免疫復(fù)合物由多孔材料4向上擴(kuò)散，均勻地向上擴(kuò)散、層析到達(dá)反應(yīng)膜3表面，在反應(yīng)膜3的相應(yīng)檢測點與固定的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成量子點標(biāo)記的夾心免疫復(fù)合物，待測樣本中的FSH、ACTH向上擴(kuò)散、層析到達(dá)反應(yīng)膜3表面，在反應(yīng)膜3的相應(yīng)檢測點固定的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成不帶量子點的免疫復(fù)合物；

d.從結(jié)果判讀窗口7加入100μL示蹤標(biāo)記反應(yīng)液，示蹤標(biāo)記反應(yīng)液中包含量子點標(biāo)記的FSH抗體、量子點標(biāo)記的ACTH抗體，在反應(yīng)膜3上的相應(yīng)抗體位形成量子點標(biāo)記的夾心免疫復(fù)合物，再加入100μL磷酸鹽緩沖液PBST進(jìn)行洗滌，未結(jié)合的血清樣本和量子點標(biāo)記物以及洗滌液，通過反應(yīng)膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收；通過采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

在傳統(tǒng)免疫檢測中當(dāng)PRL、GH、TSH、LH與FSH、ACTH同時檢測時，往往會出現(xiàn)其中某些激素檢測失真，經(jīng)大量分析后發(fā)現(xiàn)，檢測樣本中PRL、GH、TSH、LH所需要進(jìn)行的反應(yīng)條件相近，而FSH、ACTH的最優(yōu)反應(yīng)條件與其他四項不同，進(jìn)而產(chǎn)生相互干擾，本實施例通過分次添加標(biāo)記物的方式可以減少多項檢測中出現(xiàn)的相互干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。