本發(fā)明涉及醫(yī)療器械和檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的平臺系統(tǒng)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移往往與腫瘤的分型和分期、腫瘤的治療效果、有無復(fù)發(fā)、以及患者預(yù)后密切相關(guān)。目前，臨床最常用的影像學(xué)檢查手段包括超聲(US)，計(jì)算機(jī)斷層顯像(CT)，磁共振顯像(MRI)和正電子發(fā)射斷層顯像(PET)。但影像檢測腫瘤最低檢出直徑至少為2-3mm,即小于該直徑范圍的腫瘤通過影像學(xué)檢查往往不能被發(fā)現(xiàn)，且對檢查結(jié)果的判別也會受到不同醫(yī)生主觀判斷的影響。并且在進(jìn)行X片、CT等檢查的過程中，患者需要暴露于一定劑量的射線中，存在一定的健康危害或健康隱患。另外，多數(shù)影像學(xué)檢查費(fèi)用昂貴，存在一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及醫(yī)療保險(xiǎn)問題。血漿中的腫瘤標(biāo)志物也應(yīng)用于腫瘤輔助性診斷參考和腫瘤隨訪觀察指標(biāo)，但是這些標(biāo)志物為非特異性標(biāo)記物，準(zhǔn)確率差，不能作為腫瘤診斷的依據(jù)。某些病理生理狀態(tài)可能引起一些標(biāo)志物的在血液中的水平不穩(wěn)定，從而造成結(jié)果檢出錯(cuò)誤。同時(shí)，不是所有組織來源的腫瘤均具有可用于腫瘤輔助診斷的、足夠可靠的、特異的標(biāo)志物。而且部分腫瘤由于生長部位的限制難以獲得組織病理診斷；腫瘤在未形成轉(zhuǎn)移灶之前，無法知曉腫瘤是否進(jìn)入血液或潛在轉(zhuǎn)移。鑒于目前常規(guī)腫瘤檢查手段的不足，臨床醫(yī)生不但需要更為準(zhǔn)確的用于腫瘤本身性質(zhì)評估的數(shù)據(jù)，更急需可以精準(zhǔn)評估腫瘤治療療效準(zhǔn)確性與有效性的可靠參數(shù)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是由原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，其作為一種實(shí)時(shí)“液體活檢”手段反映了腫瘤是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，大量研究結(jié)果提示，血液中血環(huán)腫瘤細(xì)胞與癌癥的發(fā)生發(fā)展都有直接關(guān)系，檢測和分析外周血中的單個(gè)或少量循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇，對腫瘤的早期診斷、腫瘤診斷的分期和分型、手術(shù)前評估和手術(shù)后輔助性治療的指導(dǎo)與評價(jià)、評估患者對治療(化療藥物和放療)反應(yīng)、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、對腫瘤治療效果的實(shí)施監(jiān)測、指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)治療、腫瘤耐藥性的監(jiān)控、預(yù)后判斷和預(yù)測的準(zhǔn)確性和有效性的評估非常關(guān)鍵。因此，研發(fā)一種無需復(fù)雜操作且非侵襲性檢測的可以血液準(zhǔn)確檢測腫瘤細(xì)胞的方法(液體活檢)在臨床上尤其是精準(zhǔn)醫(yī)療有著極其重要的意義。但是，相比較外周血中存在的大量白細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞僅為外周血中的稀有細(xì)胞，檢測起來非常困難。目前，CTCs的檢測和鑒定方法眾多，包括各種熒光原位雜交技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及其各種改進(jìn)的技術(shù)等等。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization)，簡稱FISH。是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布。然而，目前需要通過人工觀察計(jì)數(shù)的方式來檢測，如，張玉娟，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的方法學(xué)建立和改良及在實(shí)體瘤中的監(jiān)測應(yīng)用研究，《中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》2014/11醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯E072-11一文中，就是采用人工觀察來檢測血液中的CTC數(shù)量。然而，人工觀察的方式非常不方便，成本高，而且不確定因素多，對人員的要求高，人為誤差極大，難以實(shí)現(xiàn)臨床批量和精準(zhǔn)檢測、以及標(biāo)準(zhǔn)化檢測，極大地限制了其實(shí)際臨床應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了全自動(dòng)化掃描和分析檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的設(shè)備、裝置和方法。本發(fā)明全自動(dòng)化掃描和分析檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的設(shè)備，它包括：a、全自動(dòng)正置熒光顯微鏡，熒光顯微鏡上配置有4種熒光濾色鏡，4種熒光濾色鏡分別是紅色、綠色、橙色、藍(lán)色熒光濾色鏡；b、顯微鏡單細(xì)胞自動(dòng)掃描與圖像分析系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含掃描裝置、相機(jī)、計(jì)算機(jī)以及圖像控制及分析軟件，所述軟件包含紅光曝光時(shí)間控制模塊、綠光曝光時(shí)間控制模塊、橙光曝光時(shí)間控制模塊、藍(lán)光曝光時(shí)間控制模塊和細(xì)胞識別模塊。其中，所述熒光顯微鏡為全自動(dòng)正置熒光顯微鏡ZEISSAxioImagerZ2。其中，所述熒光顯微鏡上的物鏡設(shè)置為10倍增強(qiáng)反差型平場熒光物鏡PA(Plan-APOCHROMAT)鏡頭。其中，所述顯微鏡圖像自動(dòng)掃描與分析系統(tǒng)為Metafer3.10.2系統(tǒng)。其中，所述紅光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制紅光的最低曝光時(shí)間為0.04s。其中，所述綠光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制綠光的最低曝光時(shí)間為0.8s。其中，所述橙光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制橙光的曝光時(shí)間為自動(dòng)曝光。其中，所述藍(lán)光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制藍(lán)光的最低曝光時(shí)間為0.0026s。其中，所述細(xì)胞識別模塊設(shè)置為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)識別模塊，具體是設(shè)置為用于識別CD45染色陰性，大小為10～150μm，并且EpCAM陽性或CK-18陽性及8號染色體數(shù)目二倍體或非二倍體的細(xì)胞或者EpCAM陰性或CK-18陰性但8號染色體數(shù)目非二倍體的細(xì)胞。也就是說，本發(fā)明檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的3個(gè)指標(biāo)是：1、CD45染色陰性；2、細(xì)胞大小為10～150μm；3、可以是①EpCAM陽性或CK-18陽性，8號染色體數(shù)目可以是二倍體或非二倍體；也可以是②EpCAM陰性或CK-18陰性但8號染色體數(shù)目非二倍體。本發(fā)明還提供了一種檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，包括前述的設(shè)備和檢測試劑；所述檢測試劑包括人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒和CK,EpCAM-iFISHCTC檢測試劑盒。本發(fā)明還提供了一種全自動(dòng)化掃描和分析檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，步驟如下：取待檢樣本，用前述的設(shè)備進(jìn)行掃描和分析，即可。優(yōu)選地，步驟如下：(1)取待檢血液樣本和前述檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置；(2)用人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒和CK,EpCAM-iFISHCTC檢測試劑盒處理待檢血液樣本，制片，再用檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的設(shè)備進(jìn)行掃描和分析，即可。綜上，本發(fā)明檢測設(shè)備、檢測裝置、檢測方法可以有效、準(zhǔn)確檢測CTC，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化、批量和標(biāo)準(zhǔn)化檢測，確保CTC檢測的質(zhì)量控制和保證、誤差小，成本低廉，臨床應(yīng)用前景非常優(yōu)良。本發(fā)明的系統(tǒng)只要是用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測和研究均適合本發(fā)明，不限于以下所描述的CTC檢測方法，包括其他所有用于該設(shè)備和系統(tǒng)所進(jìn)行的CTC檢測和研究。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為EpCAM(+)，二倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖2為EpCAM(+)，三倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖3為EpCAM(+)，四倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖4為EpCAM(+)循環(huán)腫瘤栓圖。圖5為EpCAM(-)，三倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖6為EpCAM(-)，四倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖7為EpCAM(-)，≥5倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖8為EpCAM(-)循環(huán)腫瘤栓圖。圖9為CK18(+)，四倍體的循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖。圖10為CK18(+)循環(huán)腫瘤栓圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明全自動(dòng)化掃描和分析檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的設(shè)備以及用該設(shè)備檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的方法1、本發(fā)明系統(tǒng)的組成I、全自動(dòng)正置熒光顯微鏡(蔡司)ZEISSAxioImagerZ2表1全自動(dòng)正置熒光顯微鏡序號數(shù)量部件11主機(jī)21鹵素?zé)魺羰?1電動(dòng)6位反射光模塊轉(zhuǎn)盤41插片固定器51反射光組件61可調(diào)中的視場光闌插件71熒光防護(hù)屏81照相鏡筒91增強(qiáng)反差型平場熒光物鏡40×(NA0.75)101增強(qiáng)反差型平場熒光物鏡10×(NA0.3)111增強(qiáng)反差型平場熒光物鏡20×(NA0.5)12210倍視場23mm目鏡132目鏡罩141聚光鏡154熒光濾色鏡座161C型照相接口1×x171白平衡濾光片181濾色鏡支架1910鹵素?zé)襞?01長壽命金屬鹵化物熒光光源211RS232控制線長壽命金屬鹵化物熒光光源221RS232控制線231全自動(dòng)玻片掃描系統(tǒng)及其軟件模塊Ⅱ、顯微鏡單細(xì)胞圖像自動(dòng)掃描與分析系統(tǒng)采用Metafer3.10.2系統(tǒng)，其包含掃描臺，電動(dòng)機(jī)控制卡，操控手柄，自動(dòng)校正玻片，CoolCube400萬像素單色CCD，系統(tǒng)升級軟件包，熒光原位雜交軟件模塊，防止自動(dòng)斷電保護(hù)開關(guān)，計(jì)算機(jī)以及圖像控制及分析軟件，圖像控制及分析軟件包括細(xì)胞識別模塊、紅光曝光時(shí)間控制模塊、綠光曝光時(shí)間控制模塊、橙光曝光時(shí)間控制模塊、藍(lán)光曝光時(shí)間控制模塊。其中，細(xì)胞識別模塊設(shè)置為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)識別模塊，具體是設(shè)置為用于識別CD45染色陰性，細(xì)胞大小為10～150μm，并且EpCAM陽性或CK-18陽性及8號染色體數(shù)目二倍體或非二倍體的細(xì)胞或者EpCAM陰性、CK-18陰性但8號染色體數(shù)目非二倍體的細(xì)胞。紅光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制紅光的最低曝光時(shí)間調(diào)節(jié)為為0.04s(秒)；綠光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制綠光的最低曝光時(shí)間調(diào)節(jié)為0.8s；橙光曝光時(shí)間控制模塊設(shè)置為控制橙光的曝光時(shí)間調(diào)節(jié)自動(dòng)曝光；藍(lán)光最低曝光時(shí)間控制設(shè)置為控制藍(lán)光模塊的曝光時(shí)間調(diào)節(jié)為0.0026s；2、本發(fā)明系統(tǒng)及其使用和CTC的檢測方法試劑盒：人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒(型號SEH-011，購自Cytelligen)；CK,EpCAM-iFISHCTC檢測試劑盒(型號FSH-002，購自Cytelligen)；體腔積液或腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒和檢測試劑盒(購自Cytelligen)(1)血液采集方法：1.1采血人在CTC檢測專用采血管上標(biāo)簽空白處標(biāo)注好病人姓名、編號、采集日期、采血人姓名。由于采血管內(nèi)有負(fù)壓，黃帽不可打開。1.2采血時(shí)，為避免上皮細(xì)胞污染，請用紅帽采血管先采集約2mL棄之(也可安排在其它采血后再用CTC專用采血管繼續(xù)采血)。1.3為避免干擾，抽取受檢者餓血，病人抽血處消毒處理，一次性采血針一頭插入靜脈，另一頭插入采血管黃色橡皮塞內(nèi)，在管內(nèi)有負(fù)壓，血液會自動(dòng)流入采血管，液面到達(dá)管上黃色標(biāo)線時(shí)，可停止采血，拔出采血針。1.4采血完成后，立即采血管頭尾顛倒10次，充分混勻防止凝血，室溫避光保存。血樣采集后，采血人將采血管放入采血箱內(nèi)，避免運(yùn)送途中震蕩，以免腫瘤細(xì)胞受損，在48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)制片：按照“人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒”和“CK，EpCAM-iFISHCTC檢測試劑盒”操作說明書對血液樣本進(jìn)行制片。(3)檢測取片子置于熒光顯微鏡載物臺上，啟動(dòng)顯微鏡圖像自動(dòng)掃描與分析系統(tǒng)，控制掃描的光和時(shí)間，自動(dòng)掃描并讀取信息篩選循環(huán)腫瘤細(xì)胞，掃描結(jié)束后生成編號.MSD(掃描信息，圖像庫)和編號.MSX(全分辨率視場)數(shù)據(jù)文件。以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來說明本發(fā)明的有益效果：實(shí)施例1采用本發(fā)明系統(tǒng)及方法進(jìn)行臨床檢測1、臨床資料100例腫瘤患者的臨床資料性別平均年齡男(61例)50.52女(39例)49.87部分患者的詳細(xì)資料2、檢測采用實(shí)施例1的裝置、試劑盒，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測。3、檢測結(jié)果檢測結(jié)果如圖1～10和表2所示：表2100例腫瘤病人循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，采用本發(fā)明設(shè)備和系統(tǒng)可以有效檢測血液中的人循環(huán)腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化檢測。實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明檢測設(shè)備、方法的準(zhǔn)確性檢驗(yàn)1、方法選擇13個(gè)樣本，分別采用本發(fā)明自動(dòng)檢測方法以及傳統(tǒng)人工檢測方法檢測：1.1本發(fā)明方法：采用實(shí)施例1的裝置、試劑盒，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測。1.2傳統(tǒng)方法：采用實(shí)施例1的試劑盒，按照如下方法檢測：1.2.1調(diào)節(jié)顯微鏡PA10×鏡頭，置放標(biāo)本至載物臺，調(diào)節(jié)焦距，直至能清晰地看見細(xì)胞。1.2.2鏡頭調(diào)節(jié)至40×紅色通道下，將載物臺上標(biāo)本框右下角移至光路中，視野內(nèi)顯示標(biāo)本框左上角。1.2.3選定第一個(gè)視野，從左至右平行移動(dòng)視野，至右側(cè)邊緣時(shí)，在視野底部切線上選擇一參照物(參照物可為細(xì)胞、雜質(zhì)、氣泡等)，向下移動(dòng)視野，使標(biāo)志物落在視野的頂部切線上(剛好看不見參照物)，由右向左平行移動(dòng)視野至左側(cè)邊緣后再選擇參照物，向下移動(dòng)視野。如此反復(fù)本項(xiàng)步驟至讀片結(jié)束。如果過程中看到CD45陰性的細(xì)胞，通過確定8號染色體數(shù)目，再依次調(diào)到藍(lán)光、綠光下觀察，根據(jù)CTC判定標(biāo)準(zhǔn)判斷該細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞。2、結(jié)果檢測結(jié)果如下表所示：表3分別采用本發(fā)明自動(dòng)檢測方法以及傳統(tǒng)人工檢測方法的結(jié)果由上表可以看出，在判斷待檢測樣本是否有CTC這一指標(biāo)上，本發(fā)明自動(dòng)檢測方法與傳統(tǒng)人工檢測方法的檢測結(jié)果是完全一致的；在CTC個(gè)數(shù)方面，發(fā)明自動(dòng)檢測方法與傳統(tǒng)人工檢測方法的檢測結(jié)果也幾乎一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確檢測CTC。綜上，本發(fā)明檢測設(shè)備、檢測裝置、檢測方法可以有效、準(zhǔn)確檢測CTC，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化檢測，誤差小，方法簡便，成本低，臨床應(yīng)用前景非常優(yōu)良。當(dāng)前第1頁1 2 3