本發(fā)明涉及藥殘檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水產(chǎn)品中殘留新霉素的提取與凈化方法。

背景技術(shù)：

新霉素是氨基糖苷類抗生素的代表，是目前我國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中常用的獸藥之一，常用于防治魚病，也添加到飼料中促進(jìn)生長發(fā)育。但它可在動(dòng)物組織內(nèi)形成殘留，通過食物鏈危害人類健康。因此，新霉素等抗生素在水產(chǎn)品中殘留的危害日益受到全世界的重視。歐盟規(guī)定氨基糖苷類(鏈霉素、新霉素)不宜作飼料添加劑。歐盟、美國、日本和我國規(guī)定，動(dòng)物性食品肌肉中新霉素的最大殘留限量(MRLs)為0.5mg/kg；韓國規(guī)定動(dòng)物性食品肌肉中的MRLs為0.25mg/kg。

由于新霉素在組織中殘留量較低，目前常用檢測方法有微生物法、比色法、液相色譜法等。在檢測新霉素含量時(shí)，需要將新霉素從組織中提取出來。傳統(tǒng)的新霉素的提取與凈化方法主要是固相萃取方式，雖然固相萃取具有較好的普遍適應(yīng)性，但是由于水產(chǎn)品具有蛋白質(zhì)基質(zhì)比較復(fù)雜的問題，至今沒有合適的固相萃取方式應(yīng)用到水產(chǎn)品中新霉素的提取與凈化方式研究。

因此，目前亟需一種高效、穩(wěn)定、操作簡單、適用于將新霉素從水產(chǎn)品組織中提取與凈化的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)品中殘留新霉素的提取與凈化方法。本發(fā)明方法以CNBr—Actived Sepharose 4B為固相附著物，將抗體通過共價(jià)鍵連接到CNBr—Actived Sepharose 4B上制備酶聯(lián)免疫親和柱，并優(yōu)化酶聯(lián)免疫親和柱的凈化條件，以此為新霉素凈化措施，較固相萃取柱具有更穩(wěn)定，回收率高，可以多次重復(fù)使用的優(yōu)勢，可以顯著地減少批間和批內(nèi)差異，同時(shí)凈化過程相對簡單，且凈化過程中不需要使用大型儀器，組裝，凈化方式簡單易掌握。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種水產(chǎn)品中殘留新霉素的提取與凈化方法，包括如下步驟：

1)新霉素提?。?/p>

將水產(chǎn)樣品可食部分切塊后混勻，充分勻漿；然后放置于離心管中，按每1g水產(chǎn)樣品計(jì)，加入9-11mL樣品提取液，振蕩4-6min，組織分散0.5-1.5min，之后2-6℃下8000-12000r/min離心8-12min；其中，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6；殘?jiān)性偌尤?-11mL樣品二次提取液，按第一次提取方法處理后，將兩次所得的上清液合并，加入9-11mL正己烷靜置8-12min，除去正己烷層，上清液中加入14-16mL稀釋液，制得提取液。

2)新霉素凈化：

提前將酶聯(lián)免疫親和柱放于室溫下恢復(fù)至常溫，用磷酸鹽緩沖液平衡活化18-22min；將所得的提取液以0.9-1.1mL/min的流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，隨后用淋洗液淋洗酶聯(lián)免疫親和柱，棄去洗出液，充分去除淋洗液，依次用有機(jī)試劑和無機(jī)酸洗脫液以0.4-0.6mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液。

酶聯(lián)免疫親和柱借助于抗原抗體的特異性結(jié)合，作為凈化原理，穩(wěn)定性好，回收率高，凈化效果好，操作簡單，可以多次重復(fù)使用。但是也存在技術(shù)缺陷：抗體的耐受性相比于化學(xué)凈化材料要弱很多，水產(chǎn)品中新霉素的提取無法像傳統(tǒng)方法那樣采用較為強(qiáng)烈的無機(jī)酸處理。本發(fā)明對新霉素的提取以及酶聯(lián)免疫親和柱凈化條件進(jìn)行了改進(jìn)，從而克服了上述技術(shù)缺陷。

其中，步驟1)中，主要目的是從水產(chǎn)品中提取新霉素，生物樣品具有基底復(fù)雜，含有大量蛋白、脂肪和其它干擾成分，不去除的因素，這些因素將嚴(yán)重影響目標(biāo)物的測定結(jié)果。新霉素的提取過程中，低溫離心，正己烷脫除等是去除提取液中脂肪的主要方式。而相較于脂肪樣品中的蛋白質(zhì)對后期酶聯(lián)免疫親和柱的凈化影響很大，傳統(tǒng)的脫除蛋白質(zhì)的方法主要是各種有機(jī)酸及有機(jī)試劑，如三氯乙酸(TCA)，濃鹽酸(HCl)，乙腈等脫除蛋白質(zhì)，經(jīng)過離心，調(diào)節(jié)pH后進(jìn)行固相萃取柱凈化。這樣的方法對于強(qiáng)極性的新霉素回收率較低并且穩(wěn)定性不足。同時(shí)樣品提取過程中的有機(jī)酸等對酶聯(lián)免疫親和柱結(jié)合的抗體具有較大的危害性，因此本發(fā)明為適應(yīng)酶聯(lián)免疫親和柱的前處理的需求，改進(jìn)了新霉素的提取方法。

步驟2)為凈化方法，酶聯(lián)免疫親和柱具有很多適合作為新霉素凈化的優(yōu)點(diǎn)，如特異性高，可以重復(fù)使用，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明針對傳統(tǒng)固相萃取方式的不足和抗原抗體結(jié)合方式自身的優(yōu)點(diǎn)，利用酶聯(lián)免疫親和柱作為水產(chǎn)品中新霉素的凈化方式；根據(jù)制備好的酶聯(lián)免疫親和柱，利用優(yōu)化的提取方法從水產(chǎn)樣品中提取新霉素，并通過酶聯(lián)免疫親和柱凈化，建立一種水產(chǎn)品中新霉素的提取與凈化方法。用去離子水淋洗，甲醇和檸檬酸依次洗脫的方式確立了凈化方法。

作為優(yōu)選，所述樣品提取液為濃度為2wt％的磺基水楊酸溶液。

作為優(yōu)選，所述磺基水楊酸溶液的配制方法如下：稱取EDTA-Na2于燒杯中，按固液比1.5g/800mL加入去離子水，30-40℃超聲處理18-22min；隨后添加磺基水楊酸在攪拌狀態(tài)下溶解，避光保存。

作為優(yōu)選，所述樣品二次提取液為去離子水。

作為優(yōu)選，所述稀釋液為去離子水。

作為優(yōu)選，所述淋洗液為去離子水，且淋洗液的用量為4-6mL。

作為優(yōu)選，所述樣有機(jī)試劑為甲醇，所述無機(jī)酸洗脫液為檸檬酸洗脫液；且有機(jī)試劑的用量為1.5-2.5mL，無機(jī)酸洗脫液的用量為5-7mL。

作為優(yōu)選，檸檬酸洗脫液的配制方法為：準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.01g溶于800mL去離子水里，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.5；隨后定容到1000mL，常溫超聲18-22min備用。

作為優(yōu)選，所述酶聯(lián)免疫親和柱的制備方法如下：

稱取0.2gCNBr—Actived Sepharose 4B浸泡膨脹20-28h，然后用60mL的1mmol/L的HCl洗滌14-16min，隨后用偶聯(lián)緩沖液洗滌，得到凝膠；將該凝膠與含有5mL的偶聯(lián)緩沖液與0.6mL純化的抗體混合液混合，在室溫下?lián)u晃震蕩2.5-3.5h，隨后轉(zhuǎn)移到柱中，至少用5倍體積的偶聯(lián)緩沖液洗去未結(jié)合的抗體。其中，抗體是能與新霉素特異性反應(yīng)的抗體。

封蓋：用封閉緩沖液靜置浸泡中4℃過夜。

洗滌：用不同pH的溶液至少洗滌柱子三個(gè)循環(huán)，每次至少5倍體積溶液，每個(gè)循環(huán)應(yīng)包括含有不同pH的溶液中；固定抗體的凝膠柱用0.01mol/L PBS緩沖液平衡；然后轉(zhuǎn)移到一個(gè)于頂部和底部放置擋板的SPE柱中，收集流出液，用紫外分光光度計(jì)測定，用偶聯(lián)緩沖液沖洗該柱，直到流出液在280nm的紫外吸光度為0，然后用0.01mol/L PBS緩沖液沖洗，并在4℃下存儲(chǔ)在0.01mol/L含有0.02％NaN3的PBS中待用。

作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)緩沖液為含有0.1mol/L碳酸氫鈉和0.5mol/L氯化鈉的溶液，其pH為8.3；所述封閉緩沖液為0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液；所述不同pH的溶液分別為pH為4.0且含有0.1mol/L醋酸鹽和0.5mol/L NaCl的溶液、pH為8.0且含有0.1mol/L的Tris–HCl和0.5mol/L NaCl的溶液。

與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明的提取方式較為溫和，相比于傳統(tǒng)的酸處理提取方式?；腔畻钏嵩谇疤幚磉^程中具有與三氯乙酸等傳統(tǒng)提取試劑相似的效果，并且對于抗體的活性影響較小，提高了柱子的重復(fù)使用性。

2.本方法制備的酶聯(lián)免疫親和柱具有專一性，針對新霉素作為抗原，利用抗原抗體的特異性結(jié)合作為凈化原理，具有很好的專一性。

3.由于酶聯(lián)免疫親和柱是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合的方式作為凈化原理，具有高特異性的特點(diǎn)?？朔藗鹘y(tǒng)固相萃取方式特異性不高的問題，可以顯著的減少批間批內(nèi)差異，使檢測靈敏度有了較大提高。

4.以甲醇與檸檬酸結(jié)合的方式進(jìn)行洗脫，由適量甲醇對柱子填料適度變性，檸檬酸進(jìn)行洗脫；相比于傳統(tǒng)的有機(jī)試劑洗脫方式可以有效的降低對柱子的傷害程度，提高柱子的重復(fù)使用次數(shù)。

5.該凈化系統(tǒng)具體操作與固相萃取方式一致，操作簡單易行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過HPLC進(jìn)行檢測，具有較好的系統(tǒng)性和準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明過程中酶聯(lián)免疫親和柱的凈化原理圖；

圖2為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-FLD檢測的色譜圖；

圖3為酶聯(lián)免疫親和柱最大柱容量檢測圖；

圖4為酶聯(lián)免疫親和柱最大重復(fù)使用次數(shù)測定圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(包括G1311AQuatPμmp四元泵、G1316AColμmn柱溫箱、熒光檢測器)；高速冷凍離心機(jī)，BR4i，法國Jouan公司；高速組織搗碎機(jī)，T-18digital ultraturrax，IKA公司；精密pH計(jì)，PHS-3C，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超純水系統(tǒng)，UNIQUE-R20，北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司；電子分析天平(精度0.0001g)，BS-224-S，德國賽多利斯公司；尼龍針頭濾器，0.45μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；自動(dòng)進(jìn)樣瓶，棕色，螺紋口，隔墊，美國Agilent公司。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)，Burdick&Jackson公司，色譜純；芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)，Sigma公司，色譜純；氫氧化鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑公司，優(yōu)級(jí)純；正己烷，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，分析純；新霉素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司，分析用標(biāo)準(zhǔn)品；硼酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純；磷酸二氫鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑公司，分析純；EDTA-Na2，Solarbio公司，分析純；磺基水楊酸，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司，分析純；甘氨酸，Solarbio公司，分析純；檸檬酸，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

實(shí)施例1

1)新霉素提取：

將水產(chǎn)樣品可食部分，切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿；然后稱取1.0g放置于離心管中，加入10mL樣品提取液，振蕩5min，組織分散1min，之后4℃下10000r/min離心10min；其中，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5；殘?jiān)性偌尤?0mL去離子水，按第一次提取方法處理后，將兩次所得的上清液合并，加入10mL正己烷靜置10min，除去正己烷層，上清液中加入15mL去離子水，制得提取液。

其中，所述磺基水楊酸溶液的配制方法如下：稱取EDTA-Na2于燒杯中，按固液比1.5g/800mL加入去離子水，35℃超聲處理20min；隨后添加磺基水楊酸在攪拌狀態(tài)下溶解，避光保存。

2)新霉素凈化：

提前將酶聯(lián)免疫親和柱放于室溫下恢復(fù)至常溫，用磷酸鹽緩沖液平衡活化20min；如圖1所示過程，將所得的提取液以1mL/min的流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，隨后用5mL去離子水淋洗酶聯(lián)免疫親和柱，棄去洗出液，充分去除去離子水，依次用2mL甲醇和6mL檸檬酸洗脫液以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液。上樣完畢，用磷酸鹽緩沖液對酶聯(lián)免疫親和柱充分平衡復(fù)活，4℃保存。

其中，檸檬酸洗脫液的配制方法為：準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.01g溶于800mL去離子水里，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.5；隨后定容到1000mL，常溫超聲20min備用。

所述酶聯(lián)免疫親和柱的制備方法如下：

特異性抗體的純化：過蛋白A柱，提前將蛋白A柱到室溫下放置一段時(shí)間；取-20攝氏度凍存的血清預(yù)先在-4攝氏度凍融，以體積比1:10溶于已經(jīng)配好的20mM磷酸鈉緩沖液中。

平衡：用5mL一磷酸鈉緩沖液沖洗柱子，保持1mL/min的速度，共用10mL。

上樣：用3mL上樣1mL,1mL/min。

再平衡：用5mL磷酸鈉緩沖液沖洗柱子，保持1mL/min的速度，共用5mL。

洗脫：選用5mL取檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫柱子，保持1mL/min.，共用3mL。

用10mL離心管接好洗脫下的抗體,在離心管中大約加入700uL pH9.0的Tris-HCL調(diào)節(jié)pH；另外取大離心管接平衡及上樣的液體，用來以后測蛋白濃度。蛋白用透析袋透析，透析后凍干。

稱取0.2gCNBr—Actived Sepharose 4B浸泡膨脹24h，然后用60mL的1mmol/L的HCl洗滌15min，隨后用偶聯(lián)緩沖液洗滌，得到凝膠；將該凝膠與含有5mL的偶聯(lián)緩沖液與0.6mL純化的為兔抗新霉素-BSA抗體混合液混合，在室溫下?lián)u晃震蕩2.5-3.5h，隨后轉(zhuǎn)移到柱中，至少用5倍體積的偶聯(lián)緩沖液洗去未結(jié)合的抗體。

封蓋：用封閉緩沖液靜置浸泡中4℃過夜。

洗滌：用不同pH的溶液至少洗滌柱子三個(gè)循環(huán)，每次至少5倍體積溶液，每個(gè)循環(huán)應(yīng)包括含有不同pH的溶液中；固定抗體的凝膠柱用0.01mol/L PBS緩沖液平衡；然后轉(zhuǎn)移到一個(gè)于頂部和底部放置擋板的SPE柱中，收集流出液，用紫外分光光度計(jì)測定，用偶聯(lián)緩沖液沖洗該柱，直到流出液在280nm的紫外吸光度為0，然后用0.01mol/L PBS緩沖液沖洗，并在4℃下存儲(chǔ)在0.01mol/L含有0.02％NaN3的PBS中待用。

其中，所述偶聯(lián)緩沖液為含有0.1mol/L碳酸氫銨和0.5mol/L氯化鈉的溶液，其pH為8.3；所述封閉緩沖液為0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液；所述不同pH的溶液分別為pH為4.0且含有0.1mol/L醋酸鹽和0.5mol/L NaCl的溶液、pH為8.0且含有0.1mol/L的Tris–HCl和0.5mol/L NaCl的溶液。

3)衍生反應(yīng)：

取0.6mL乙腈于1.5mL EP管中，加入步驟2)得到的酶聯(lián)免疫親和柱洗脫液0.4mL，再加入80uL 2.5mol/L的Tris溶液，充分混勻作為衍生液備用。取0.4mL的硼酸緩沖液加入棕色液相進(jìn)樣瓶中，加入上面得到衍生液0.5mL，加入0.1mL的芴甲氧羰酰氯衍生溶液，輕微振蕩均勻，反應(yīng)15min，加入60μL的甘氨酸溶液終止反應(yīng)，待上機(jī)分析。

4)高效液相分析：

色譜柱：Agilent Clipse Plus-C18，5μm，250mm×4.6mm(內(nèi)徑)；色譜柱溫度25度；流動(dòng)相：乙腈和水(90：10)，流動(dòng)相流速：1.0mL/min；

色譜分析：

分別注入20μL濃度為200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品提取溶液于液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。

5)結(jié)果計(jì)算：

樣品中新霉素的含量按公式⑴計(jì)算。

式中：

X——樣品中新霉素含量，單位為納克每千克(ng/kg)；

C_s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中新霉素含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；

A——試樣液中新霉素的峰面積；

V——樣品提取物溶液體積，單位為毫升(mL)；

As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中新霉素的峰面積；

m——樣品重量，單位為克(g)。

實(shí)施例2

取從利群超市(青島)中購買的大菱鲆可食部分，切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿，取1.00g(精確到0.01g)于50mL離心管中。準(zhǔn)確稱取魚肉1.0g(精確到0.01g)，放置于50mL的聚丙烯離心管中，加入10mL的2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，之后4度下10000r/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)50mL的離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5左右。殘?jiān)性偌尤?0mL2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，4度下10000r/min離心10min，所得上清液合并，加入10mL的正己烷靜置10min，除去正己烷層，上清液中加入15mL去離子水稀釋。

樣品提取液經(jīng)過酶聯(lián)免疫親和柱凈化，樣品提取液以0.5mL/min流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，用5mL去離子水淋洗，2mL甲醇，6mL檸檬酸(0.1M pH1.5)洗脫，收集洗脫液，衍生后用HPLC-FLD檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

實(shí)施例3

取從利群超市(青島)中購買的大菱鲆可食部分，切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿，取1.00g(精確到0.01g)于50mL離心管中。準(zhǔn)確稱取魚肉1.0g(精確到0.01g)，放置于50mL的聚丙烯離心管中，加入10mL的2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，之后4度下10000r/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)50mL的離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5左右。殘?jiān)性偌尤?0mL去離子水，振蕩5min，高速組織分散1min，4度下10000r/min離心10min，所得上清液合并，加入10mL的正己烷靜置10min，除去正己烷層。

樣品提取液經(jīng)過酶聯(lián)免疫親和柱凈化，樣品提取液以0.5mL/min流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，用5mL去離子水淋洗，2mL甲醇，6mL檸檬酸(0.1M pH1.5)洗脫，收集洗脫液，衍生后用HPLC-FLD檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

實(shí)施例4

取從利群超市(青島)中購買的大菱鲆可食部分，切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿，取1.00g(精確到0.01g)于50mL離心管中。準(zhǔn)確稱取魚肉1.0g(精確到0.01g)，放置于50mL的聚丙烯離心管中，加入10mL的2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，之后4度下10000r/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)50mL的離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5左右。殘?jiān)性偌尤?0mL2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，4度下10000r/min離心10min，所得上清液合并，加入10mL的正己烷靜置10min，除去正己烷層，上清液中加入15mL去離子水稀釋。

樣品提取液經(jīng)過酶聯(lián)免疫親和柱凈化，樣品提取液以0.5mL/min流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，用5mL去離子水淋洗，2mL甲醇，6mL檸檬酸(0.1M pH1.5)洗脫，收集洗脫液，衍生后用HPLC-FLD檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

對不同加標(biāo)濃度的樣品檢測

將陰性樣品大菱鲆可食部分經(jīng)過處理后，確定不同加標(biāo)濃度。樣品準(zhǔn)確稱取1g(精確到0.1g)加入10mL 2％磺基水楊酸提取后，隨后用10mL去離子水提取，混合樣品提取液調(diào)節(jié)pH7.5加入15mL去離子水稀釋，用10mL正己烷去除脂肪后，用酶聯(lián)免疫親和柱凈化后HPLC檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以十倍信噪比確定樣品的定量限為400ng/g,以三倍信噪比確定檢測限為200ng/g，此檢測限顯著低于新霉素在水產(chǎn)品中的限量500ng/g。

酶聯(lián)免疫親和柱的穩(wěn)定性和重復(fù)性

對7根新制備的酶聯(lián)免疫親和柱，每個(gè)批次3個(gè)平行進(jìn)行驗(yàn)證。對加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果進(jìn)行HPLC檢測分析，將其數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性檢驗(yàn)，P>0.05，說明沒有顯著性差異。

通過對同一批柱子持續(xù)加標(biāo)準(zhǔn)品溶液上樣，檢測酶聯(lián)免疫親和柱的柱容量，結(jié)果如圖3所示，酶聯(lián)免疫親和柱的柱容量超過1400ng，符合樣品凈化過程中上樣水平。

將同一批次制備的酶聯(lián)免疫親和柱4℃條件下分別儲(chǔ)存2,4,8周，進(jìn)行凈化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均沒有顯著變化，說明儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。對同一酶聯(lián)免疫親和柱進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，驗(yàn)證重復(fù)使用效率，以回收率大于75％作為有效標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果顯示每個(gè)酶聯(lián)免疫親和柱至少可以重復(fù)使用36次，結(jié)果如圖4所示顯示了良好的重復(fù)使用性能。

實(shí)際樣品的檢測驗(yàn)證

選取比較有代表性水產(chǎn)樣品作為實(shí)際樣品檢測對象。將水產(chǎn)品可食部分(從利群超市(青島)中購買)充分勻漿，采取加標(biāo)濃度1.2mg/Kg,0.6mg/Kg,0.4mg/Kg，取1.00g(精確到0.01g)于50mL離心管中。加入10mL的2％磺基水楊酸，振蕩5min，高速組織分散1min，之后4度下10000r/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)50mL的離心管中，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5左右。殘?jiān)性偌尤?0mL去離子水，振蕩5min，高速組織分散1min，4度下10000r/min離心10min，所得上清液合并，加入10mL的正己烷靜置10min，除去正己烷層，上清液中加入15mL去離子水稀釋。

樣品提取液經(jīng)過酶聯(lián)免疫親和柱凈化，樣品提取液以0.5mL/min流速通過酶聯(lián)免疫親和柱，用5mL去離子水淋洗，2mL甲醇，6mL檸檬酸(0.1M pH1.5)洗脫，收集洗脫液，衍生后用HPLC-FLD檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果如表-1所示。結(jié)果顯示，

表-1六種水產(chǎn)樣品加標(biāo)后經(jīng)酶聯(lián)免疫親和柱凈化后回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差

^a樣品肌肉組織^b數(shù)據(jù)由三次平行結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示

本發(fā)明所闡述的水產(chǎn)品中新霉素的提取與凈化方法具有專一性強(qiáng)，針對新霉素強(qiáng)極性的特點(diǎn)，選取酶聯(lián)免疫親和柱作為凈化方式，通過優(yōu)化凈化條件，具有較好的回收率；并且該酶聯(lián)免疫親和柱多次重復(fù)使用的有點(diǎn)，可以充分降低在使用過程中成本。

本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。