本發(fā)明涉及聯合多個蛋白抗體，并利用免疫組織化學超敏型二步法，去檢測食管鱗癌患者標本的表達情況，進而預測患者預后的試劑盒。

背景技術：

食管鱗狀細胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)，簡稱食管鱗癌，在我國是一種常見的上消化道惡性腫瘤，在國人的惡性腫瘤死亡率中位居第四位。全世界每年40余萬的新發(fā)食管鱗癌病例中，一半以上發(fā)生在我國，我國也是世界上公認的食管鱗癌第一高發(fā)國。上世紀70年代，在全國范圍內實施了惡性腫瘤普查，確立河北磁縣、河南林縣、山西陽泉、四川鹽亭、廣東潮汕和江蘇淮安等地區(qū)為中國食管鱗癌六大高發(fā)區(qū)。

準確預測食管鱗癌患者的預后對于臨床進一步的治療和隨訪具有重要意義。然而，目前除了國際TNM分期外還沒有一種簡便有效的方法可以更加準確地預測食管鱗癌患者的預后。然而，TNM分期預測患者的預后比較繁瑣，需要準確地評價腫瘤的浸潤深度、轉移淋巴結的個數、腫瘤有無遠處轉移等，況且國際TNM分期的制定缺少大量國人食管鱗癌的病例資料，因此在評價我國患者的預后時適用性比較差，而本發(fā)明所采用的3個指標聯合預測患者預后的試劑盒比單個指標檢測具有更高的預測效果，同時也明顯高于TNM分期的預測能力，并且本發(fā)明所基于的免疫組織化學超敏型二步法是一種成熟可靠、可在基層醫(yī)院廣泛使用的方法。本試劑盒中3種蛋白抗體的背景介紹如下：

CD105標記的血管密度，代表的是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)：腫瘤血管生成。血管的生成是腫瘤生長的關鍵，實體瘤的進行性生長依賴于其誘導產生的血管網的建立，血管的形成確保了腫瘤代謝的進行，對腫瘤增殖必不可少。

esVEGFR2，即可溶性內源性血管內皮生長因子2，最初是作為淋巴管生成的特異性抑制分子被發(fā)現的。我們前期研究發(fā)現，在食管鱗癌中，無論是采用RT-PCR，還是免疫組化等方法，esVEGFR2的表達都與患者的生存率存在顯著負相關關系，并且與患者的淋巴結轉移、臨床分期之間的相關關系有統(tǒng)計學意義。

MYC基因是較早發(fā)現的一種癌基因。MYC在細胞周期變化、細胞的生長代謝、基因的不穩(wěn)定性、刺激血管生成、細胞惡性轉化、分化及凋亡中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。MYC的表達和效能受眾多癌基因、抑癌基因及其他調節(jié)因素(如生長因子)的影響，彼此之間互相制約、互相協同。MYC的異常表達發(fā)生在很多人類腫瘤中，其異常表達是癌變過程中較早出現的分子改變，與腫瘤的啟動及癌性程度密切相關。

雖然上述每種蛋白均具有預測食管鱗癌患者預后的能力，但把3種蛋白聯合起來預測食管鱗癌患者的預后則具有更強的判斷效能，甚至高于國際公認的TNM分期的預測能力。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種基于免疫組織化學方法的3個蛋白抗體聯合預測食管鱗癌患者預后的試劑盒。

其中，上述的免疫組織化學方法主要是檢測中性福爾馬林固定和石蠟包埋的標本。

其中，上述試劑盒主要包括抗3種蛋白的抗體，分別是抗CD105蛋白、抗esVEGFR2蛋白和抗MYC蛋白抗體。

其中，上述試劑盒中的檢測試劑，分別是山羊血清，0.01M檸檬酸鹽修復液，3％H₂O₂，Polymer增強劑，Polymer聚合物，DAB顯色試劑，PBS溶液。

附圖說明

圖1是CD105蛋白在不同表達人群的Kaplan-Meier生存曲線(P＝0.000)。圖2是esVEGFR2蛋白在不同表達人群的Kaplan-Meier生存曲線(P＝0.009)。圖3是MYC蛋白在不同表達人群的Kaplan-Meier生存曲線(P＝0.035)。圖4是3種蛋白聯合后，判斷該人群的Kaplan-Meier生存曲線(P＜0.001)。圖5是ROC曲線(注：3種蛋白聯合后形成的曲線下面積最大，為0.723)。

具體實施方式

我們收集了124例2000-2006年的食管鱗癌患者的手術標本存檔蠟塊。下面結合附圖實施例作進一步詳細描述。

免疫組織化學超敏型二步法步驟如下：

標本經連續(xù)切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，用超敏型二步法檢測目的蛋白的表達。具體方法如下：

(1)切片經0.01M檸檬酸鹽修復液抗原修復、3％H₂O₂滅活內源性過氧化物酶、山羊血清封閉后，分別與CD105、esVEGFR2和MYC抗體4℃孵育過夜；

(2)切片與Polymer增強劑和Polymer聚合物分別孵育后，DAB顯色；

(3)切片經蘇木素復染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片；

(4)切片在完成上述每步后均經PBS溶液洗滌。

所有的免疫染色切片經2位病理醫(yī)師采用盲法獨立評分。CD105標記的微血管評分方法為血管密度，參照傳統(tǒng)方法，首先在100倍鏡下由表皮到基底選取組織內血管最多的區(qū)域，通過圖像采集儀在400倍鏡下計數血管密度(MVD)，計算其MVD均值。任何棕黃染色細胞或細胞群，即使未顯示管狀結構也計算為1個MVD值。其cut-off值根據平均血管密度確定。其它兩個蛋白評分方法為腫瘤細胞漿中出現棕黃色顆粒被認為是陽性信號。染色強度分為4級：0，陰性；1，弱染色；2，中度染色；3，強染色。陽性細胞百分數分為5級：0，0～5％；1，6～25％；2，26～50％；3，51～75％；4，≥76％。每個標本的總分數是由腫瘤細胞染色強度和腫瘤細胞陽性百分數兩部分的乘積得出的，范圍是0～12。為了方便統(tǒng)計，我們把所有病例分為低表達和高表達2組，1代表低表達組，2代表高表達組，其cut-off值根據X-tile軟件確定。esVEGFR2：0～8分為低表達組，9～12分為高表達組；MYC：0～4分為低表達組，6～12分為高表達組。

3個指標聯合起來判斷食管鱗癌患者預后的方程式如下：

Y＝α×A+β×B+γ×C，其中α、β、γ為系數，通過Cox回歸可以得出數值，故方程式變?yōu)閅＝1.204×A+0.641×B+0.517×C。A、B、C為該例標本中3個蛋白的表達狀態(tài)，1代表低表達，2代表高表達。計算出每例標本的Y值后按照從小到大的順序排列，其中位于中間位置的病例對應的Y值為cut-off值，即3.566。小于等于該值的病例為低危組，高于該值的病例為高危組，這樣分成2組后再進行單因素統(tǒng)計分析。此外，也可以通過繪制ROC曲線去比較每個蛋白形成的曲線下面積(AUC)的大小。

數據的統(tǒng)計學處理：

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數據。各蛋白的表達與患者的生存時間的關系使用Kaplan-Meier生存分析；預測影響患者預后的獨立危險因素使用Cox比例風險回歸模型；每種蛋白預測食管鱗癌患者預后的效能使用ROC曲線；P＜0.05被認為有統(tǒng)計學顯著性。

結果顯示：

3個蛋白的表達都與食管鱗癌患者的TNM分期及淋巴結轉移狀態(tài)密切相關。3蛋白單獨及聯合的單因素及多因素Cox風險回歸模型預測患者的獨立危險因素如下：

3個蛋白聯合具有更強的食管鱗癌預后預測能力，同時也是獨立的預后因子。

3個蛋白聯合后形成的ROC曲線面積是最大的，同時也具有較高的敏感性和特異性。

3個指標聯合后得到的ROC曲線下面積是0.723，均大于每種指標單獨評價時所形成的ROC曲線下面積，甚至高于TNM分期所形成的曲線下面積(0.697)，同時3個指標聯合后預測食管鱗癌患者的預后，也具有較高的敏感性和特異性(分別為55.2％和89.5％)。因此說CD105、esVEGFR2、MYC聯合后評價食管鱗癌患者的預后具有更高的預測價值，并且比TNM分期更好操作及適用性更強。

評價臨床上個體食管鱗癌患者的預后信息時，只需把所得到的該患者3個蛋白表達的免疫組化分數對應的表達狀態(tài)數值(1代表低表達，2代表高表達)套入公式Y＝1.204×A+0.641×B+0.517×C中，就可以得出Y值，然后與我們確定的cut-off值3.566比較，小于該值的患者屬于低危組(5年生存率為54.70％)，大于該值的患者屬于高危組(5年生存率為9.40％)。