本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒和同型半胱氨酸濃度的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

同型半胱氨酸α,γ-裂解酶(homocysteineα,γ-lyases,HCYase,EC4.4.1.11)是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴酶，又稱L-蛋氨酸γ-裂解酶，屬于γ蛋白家族。能催化L-蛋氨酸及同型半胱氨酸的α,γ-消除反應(yīng)及γ-取代反應(yīng)，催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β消除反應(yīng)及β-取代反應(yīng)。催化此類(lèi)反應(yīng)的酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，命名為蛋氨酸裂解酶(Methioninelyase)，如今將它命名為蛋氨酸γ-裂解酶并在多種生物中發(fā)現(xiàn)，如惡臭假單抱桿菌、陰道毛滴蟲(chóng)、氣單抱菌屬、擬南芥等。雖然來(lái)源不同，HCYase的分子量大都在170kDa左右，由四個(gè)分子量大小在40-48KD的同型亞基組成；具有磷酸吡哆醛依賴性，蛋白的紫外吸收除了在280nm有吸收峰外還會(huì)在420nm處出現(xiàn)一個(gè)與磷酸吡哆醛結(jié)合的特征峰。

HCYase在生物體內(nèi)含硫氨基酸的代謝中發(fā)揮重要作用，并被開(kāi)發(fā)成為新型抗腫瘤藥物及同型半胱氨酸血癥的診斷試劑，其作用機(jī)理及在治療上的潛在應(yīng)用價(jià)值引起了人們的極大關(guān)注。另外它在原蟲(chóng)體內(nèi)含硫氨基酸的代謝中發(fā)揮重要作用，可以其為靶位開(kāi)發(fā)抗寄生蟲(chóng)藥物。

蛋氨酸是一種必需氨基酸，是機(jī)體主要的甲基提供者。蛋氨酸依賴是腫瘤細(xì)胞特有的，表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞無(wú)法在去除蛋氨酸的環(huán)境中生長(zhǎng)。蛋氨酸依賴在人腫瘤患者中廣泛存在，幾乎所有人類(lèi)腫瘤細(xì)胞的蛋氨酸代謝都有改變：正常 細(xì)胞、非蛋氨酸依賴的腫瘤細(xì)胞、蛋氨酸依賴的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋氨酸濃度依次降低，而蛋氨酸濃度保持恒定是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。HCYase可以催化L-蛋氨酸的α,γ-裂解反應(yīng)，生成α-丁酮酸，甲硫酸和氨，能有效降低蛋氨酸濃度。與傳統(tǒng)化療方法相比，HCYase作為新型抗腫瘤藥物具有腫瘤特異性高，毒副作用小等特點(diǎn)，顯示出巨大的臨床應(yīng)用潛力。

自McCully于1969年提出高同型半胱氨酸與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的觀點(diǎn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞這一問(wèn)題展開(kāi)了大量的研究。近年來(lái)研究確認(rèn)，高同型半胱氨酸血癥與作為人類(lèi)第一殺手的動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿中Hcy濃度每減少3μmol/L，缺血性心臟病發(fā)生率減少11％，卒中發(fā)生率減少19％。同型半胱氨酸在臨床上可作為心血管疾病，尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化癥和心肌梗死的重要危險(xiǎn)指標(biāo)，其濃度的升高程度與疾病的危險(xiǎn)性成正比。因此，研究一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)方法具有重要意義。

2000年，Tan報(bào)導(dǎo)了一種用酶生化反應(yīng)測(cè)定同型半胱氨酸的方法。HCYase催化同型半胱氨酸分解為α-丁酮酸，硫化氫和氨，分解產(chǎn)物硫化氫與熒光素N,N-二丁基亞苯基二胺(DBPDA)在FeCl₃的酸性環(huán)境下形成色素酚噻嗪氯化物類(lèi)化合物，后者在660nm處定量測(cè)定并且其吸光率和樣本中HCY的含量成正比。但是此法需要在微量熒光檢測(cè)儀上檢測(cè)，不適合臨床診斷檢測(cè)的應(yīng)用和推廣。而且此法由于在FeCl₃的酸性條件下顯色，考慮到HCYase和熒光素顯色劑DBPDA不能穩(wěn)定保存在酸性環(huán)境中，因此使用此方法的試劑盒大多是三試劑，操作繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：基于上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種同型半胱氨酸診斷試劑盒和同型半胱氨酸濃度的測(cè)定方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的一個(gè)技術(shù)方案是：一種同型半胱氨酸濃度的測(cè)定方法，在(2-羧乙基)膦鹽酸鹽作用下，氧化型同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為游離型同型半胱氨酸，在同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的作用下，生成α-丁酮酸、氨和硫化氫；氨在谷氨酸脫氫酶的作用下，使NADH轉(zhuǎn)化為NAD⁺，通過(guò)測(cè)定NADH在340nm處的吸光率來(lái)定量同型半胱氨酸的濃度。

一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，包括試劑Ⅰ和試劑Ⅱ兩部分，其中試劑Ⅰ含有還原型輔酶Ⅰ(NADH)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、α-酮戊二酸、表面活性劑、緩沖液、穩(wěn)定劑；試劑Ⅱ含有HCYase、磷酸吡哆醛(PLP)、緩沖液、穩(wěn)定劑。

進(jìn)一步地，每升試劑Ⅰ溶液中各組分的含量為：

每升試劑Ⅱ溶液中各組分的含量為：

進(jìn)一步地，每升試劑Ⅰ溶液中各組分的含量為：

每升試劑Ⅱ溶液中各組分的含量為：

進(jìn)一步地，表面活性劑為曲拉通X-100、B66、吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、甜菜堿、十六烷基三甲基溴化銨中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，穩(wěn)定劑為疊氮鈉、疊氮鋰、PC300、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸二鈉中的一種或幾種。

本發(fā)明的有益效果是：(1)建立了液體雙試劑檢測(cè)人血清中同型半胱氨酸的試劑盒，可以在全自動(dòng)或半自動(dòng)生化分析儀上操作，無(wú)需另外配置熒光檢測(cè)儀，便于大量樣本的檢測(cè)；

(2)HCYase法檢測(cè)人血清中同型半胱氨酸的方法不會(huì)受到樣本中的丙酮酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的干擾，此法的價(jià)格比其他檢測(cè)同型半胱氨酸的方法 的價(jià)格更低廉，利于同型半胱氨酸檢測(cè)項(xiàng)目的推廣。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明制備的試劑盒的線性范圍圖；

圖2是本發(fā)明制備的試劑盒與同型半胱氨酸循環(huán)酶法檢測(cè)臨床樣本的相關(guān)性圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。

1.制備檢測(cè)人血清中HCY含量的試劑盒

R1試劑：在1L 100mM Tris-HCl緩沖液中，添加10KU/L GLDH、5mM TCEP、0.5mM NADH、15mMα-酮戊二酸、0.01％曲拉通X-100、0.05％疊氮鈉，攪拌均勻即為R1試劑。

R2試劑：在1L 100mM Tris-HCl緩沖液中，添加20KU/L HCYase、0.05mM PLP、0.05％疊氮鈉，攪拌均勻即為R2試劑。

同型半胱氨酸校準(zhǔn)品：在3mM HCl溶液中，加入28μM HCY

檢測(cè)方法：

以日立7080生化分析儀為例：測(cè)定波長(zhǎng)是340nm，測(cè)定方法是動(dòng)力學(xué)法。樣品量20uL，R1試劑220uL，R2試劑30ul，校準(zhǔn)方式是線性測(cè)定，反應(yīng)方向是向上。校準(zhǔn)品與R1混合后，在反應(yīng)第16點(diǎn)讀取吸光度值A(chǔ)1，加入R2，在31點(diǎn)讀取吸光度值A(chǔ)2，計(jì)算吸光度差值δA＝A2-A1。取待測(cè)樣本，同法測(cè)定樣本的吸光度差值，將其代入公式HCY含量(μmmol/L)＝(測(cè)定管吸光度差值/校準(zhǔn)管吸光度差值)×校準(zhǔn)品中HCY的含量，即可計(jì)算得出待測(cè)樣本中的HCY的含 量。

2.線性范圍檢測(cè)：取臨床高值混合血清(60μmol/L)用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，得到4個(gè)濃度的稀釋血清，每個(gè)濃度的稀釋血清重復(fù)檢測(cè)3次，取其均值，將實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行直線回歸分析。如圖1統(tǒng)計(jì)分析顯示該方法的回歸方程為：y＝0.988x-0.377R²＝0.999P<0.05,該方法在3-60μmol/L內(nèi)線性較好(見(jiàn)表1)。

表1：本發(fā)明試劑盒線性范圍

3.本發(fā)明試劑盒與同型半胱氨酸測(cè)定試劑盒(酶循環(huán)酶法)檢測(cè)臨床樣本的相關(guān)性檢測(cè)

在3～60μmol/L內(nèi)選擇50例臨床樣本，分別用本法與同型半胱氨酸測(cè)定試劑盒(酶循環(huán)酶法)(紹興美迪康公司)檢測(cè)，得到本法與酶循環(huán)法的回歸方程為：y＝0.913x+1.110R²＝0.996P<0.05(見(jiàn)圖2)。

4.本發(fā)明試劑盒抗干擾性實(shí)驗(yàn)

取新鮮混合血清，分成7等份，然后取6等份分別添加不同的干擾物質(zhì)，干擾物質(zhì)的濃度如表2所示。對(duì)照組以浙江紹興美迪康生物科技有限公司銷(xiāo)售的同型半胱氨酸測(cè)定試劑盒(酶循環(huán)法)，實(shí)驗(yàn)組以本發(fā)明中實(shí)施例1制備的試劑盒為檢測(cè)試劑，分別檢測(cè)血清中的HCY含量。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)血清中的不同干擾物質(zhì)結(jié)果見(jiàn)表2。相對(duì)偏差(％)＝(干擾樣本的測(cè)定均值-對(duì)照組無(wú)干擾樣本的測(cè)定均值)/對(duì)照組無(wú)干擾樣本的測(cè)定均值×100％

表2本發(fā)明試劑盒與對(duì)照組試劑盒抗干擾性能比較

由上述表2結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明試劑盒對(duì)丙酮酸、血氨、甲硫氨酸、半胱氨酸等物質(zhì)沒(méi)有明顯的干擾，而對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果受到丙酮酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的干擾。這說(shuō)明本發(fā)明試劑盒在抗干擾方面優(yōu)于市場(chǎng)在售試劑盒，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

本發(fā)明利用同型半胱氨酸α,γ-裂解酶配制的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑，檢測(cè)同型半胱氨酸的線性范圍在3-60μmol/L。在此線性范圍內(nèi)，本發(fā)明試劑與同型半胱氨酸(酶循環(huán)法)試劑相關(guān)性良好。而且本發(fā)明方法有效減小了丙酮酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等物質(zhì)的干擾影響，從而提高了檢測(cè)同型半胱氨酸的準(zhǔn)確度。本發(fā)明的試劑盒可以在全自動(dòng)或半自動(dòng)生化儀完成檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)其他同型半胱氨酸檢測(cè)方法低廉，有利于試劑的市場(chǎng)推廣。

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。