技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于超分子識(shí)別方法技術(shù)領(lǐng)域，涉及杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸的選擇性識(shí)別的方法。

背景技術(shù)：

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)大分子的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)，不僅參與人體中酶、激素、肽和其它重要功能蛋白的合成過程，而且與人體各項(xiàng)生理活動(dòng)和新陳代謝都息息相關(guān)，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成不可或缺的重要成分，參見：1）A. Isidro-Llobet, M. Alvarez, F. Albericio. Chem. Rev.2009, 109 , 2455?2504; 2）F. J. Sardina, H. Rapoport.Chem. Rev. 1996, 96 , 1825?1872。人體內(nèi)可參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸有20種，根據(jù)其側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)可分為5類，非極性脂肪族氨基酸、極性中性氨基酸、含芳香環(huán)的氨基酸、堿性氨基酸和酸性氨基酸，其中非極性脂肪族氨基酸、極性中性氨基酸和含芳香環(huán)的氨基酸都為中性氨基酸。對特定種類氨基酸的選擇性識(shí)別在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值，因而對特定種類氨基酸的選擇性識(shí)別與檢測的研究一直受到科學(xué)家的極大關(guān)注，參見：1）A. Acharya, B. Ramanujam, J. P. Chinta, C. P. Rao. J. Org. Chem. 2011，76 , 127?137; 2）X.-Q. Chen, Y. Zhou, X.-J. Peng, J.-Y. Yoon. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 2120?2135; 3）N. Hayashi, S. Jin, T.Ujihara.Tetrahedron Lett. 2015, 56 , 5557?5560。目前已有的報(bào)道中多為陰離子大環(huán)對堿性氨基酸的選擇性識(shí)別，參見：1）C. Li, J. Ma, L. Zhao, Y. Zhang, Y. Yu, X. Shu, J. Li, X. Jia, Chem. Commun.2013, 49 , 1924?1926; 2）N. Douteau-Guével,A. W. Coleman,J.-P. Morel,N. Morel-Desrosiers, J. Chem. Soc., Perkin Trans.21999,629?633。然而對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的研究還鮮有報(bào)道。

杯吡啶是一類富含吡啶陽離子的環(huán)狀化合物，具有良好的水溶性以及和陰離子客體鍵合的潛能。該化合物可以以3-溴甲基吡啶為原料簡便高效的進(jìn)行合成，參見：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa, Chem. Commun.1998, 181?182。然而，基于杯吡啶的超分子應(yīng)用還鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析，提供一種杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法，并利用該方法實(shí)現(xiàn)了對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu和對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的檢測。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

1）將杯吡啶、芘四磺酸四鈉鹽溶解于水中后混合均勻得到溶液，所述杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽濃度分別為0.004 mmol/L和0.001 mmol/L，而后對該溶液在室溫下進(jìn)行熒光測試；

2）將20種天然氨基酸分別加入到上述溶液中，氨基酸濃度為1 mmol/L，所述氨基酸包括中性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸，堿性氨基酸組氨酸、精氨酸、賴氨酸和酸性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸。加入氨基酸一分鐘后對所得溶液再分別在室溫下進(jìn)行熒光測試；

3）將步驟(2)中加入氨基酸后導(dǎo)致杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液的熒光信號(hào)發(fā)生變化的氨基酸以及這些氨基酸和杯吡啶的混合物分別溶解于氘水中混合均勻得到不同的溶液，而后對這些氘水溶液在室溫下分別進(jìn)行核磁共振氫譜測試；所述氨基酸和杯吡啶的濃度均為5 mmol/L。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別方法在對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu和對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸檢測方面的應(yīng)用。其中所述的對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu的檢測指的是：當(dāng)Glu-Glu加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)。所述的對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的檢測指的是：當(dāng)α-酮戊二酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)。

本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下：

杯吡啶作為大環(huán)主體，可以選擇性地與酸性氨基酸鍵合，對中性氨基酸和堿性氨基酸沒有鍵合作用；其中杯吡啶和酸性氨基酸的結(jié)構(gòu)如下所示：

當(dāng)中性氨基酸或堿性氨基酸中的組氨酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)并未發(fā)生變化，仍為弱熒光發(fā)射信號(hào)，表明上述氨基酸和杯吡啶無鍵合。

當(dāng)堿性氨基酸中的賴氨酸、精氨酸或酸性氨基酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)；對上述氨基酸以及上述氨基酸-杯吡啶的氘水溶液分別進(jìn)行核磁共振氫譜表征，結(jié)果顯示賴氨酸和精氨酸在杯吡啶存在的情況下氨基酸上所有氫原子的化學(xué)位移和其單獨(dú)存在時(shí)相比并未發(fā)生位移變化，表明堿性氨基酸中的賴氨酸、精氨酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)導(dǎo)致芘四磺酸四鈉鹽產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化并非是杯吡啶和賴氨酸、精氨酸鍵合造成的，賴氨酸、精氨酸和杯吡啶無鍵合；而酸性氨基酸在杯吡啶存在的情況下氨基酸上所有氫原子的化學(xué)位移和其單獨(dú)存在時(shí)相比有明顯的位移變化，表明酸性氨基酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)導(dǎo)致芘四磺酸四鈉鹽產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化是杯吡啶和酸性氨基酸鍵合造成的，酸性氨基酸和杯吡啶有鍵合。

對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu的檢測指的是：當(dāng)Glu-Glu加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)。對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的檢測指的是：當(dāng)α-酮戊二酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)。

本發(fā)明公開的杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法所具有的積極效果在于：

杯吡啶對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的介質(zhì)是中性生理pH值水溶液；杯吡啶對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的表征方法高效簡便；利用杯吡啶對酸性氨基酸的選擇性識(shí)別實(shí)現(xiàn)了對生物活性物質(zhì)酸性氨基酸縮合成的肽和酸性氨基酸代謝產(chǎn)物熒光傳感檢測的應(yīng)用。因而，杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸的選擇性識(shí)別在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。

【附圖說明】

圖1為杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽、杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽—氨基酸水溶液的熒光光譜圖,其中杯吡啶濃度為0.004 mmol/L，芘四磺酸四鈉鹽濃度為0.001 mmol/L，氨基酸濃度為1 mmol/L，氨基酸包括谷氨酸、天門冬氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸；

圖2為谷氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—谷氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖，其中谷氨酸和杯吡啶濃度都為5 mmol/L；

圖3為天門冬氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—天門冬氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖，其中天門冬氨酸和杯吡啶濃度都為5 mmol/L；

圖4為精氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—精氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖，其中精氨酸和杯吡啶濃度都為5 mmol/L；

圖5為賴氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—賴氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖，其中賴氨酸和杯吡啶濃度都為5 mmol/L；

圖6為在杯吡啶存在的情況下，谷氨酸（附圖中縮寫為Glu）、天門冬氨酸（附圖中縮寫為Asp）、精氨酸（附圖中縮寫為Arg）和賴氨酸（附圖中縮寫為Lys）上各個(gè)氫質(zhì)子的化學(xué)位移變化值圖；

圖7為隨著酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu的加入，杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖，其中杯吡啶的濃度為0.004 mmol/L，芘四磺酸四鈉鹽的濃度為0.001 mmol/L；

圖8為隨著酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的加入，杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖，其中杯吡啶的濃度為0.004 mmol/L，芘四磺酸四鈉鹽的濃度為0.001 mmol/L。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中芘四磺酸四鈉鹽、20種氨基酸、Glu-Glu和α-酮戊二酸有市售。杯吡啶是以3-溴甲基吡啶為原料簡便高效的進(jìn)行合成的，參見：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa, Chem. Commun. 1998, 181?182。

實(shí)施例1

一種杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

1）將杯吡啶、芘四磺酸四鈉鹽溶解于水中后混合均勻得到溶液，所述杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽濃度分別為0.004 mmol/L和0.001 mmol/L，而后對該溶液在室溫下進(jìn)行熒光測試；

2）將20種天然氨基酸分別加入到上述溶液中，氨基酸濃度為1 mmol/L，所述氨基酸包括中性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸，堿性氨基酸組氨酸、精氨酸、賴氨酸和酸性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸。加入氨基酸一分鐘后對所得溶液再分別在室溫下進(jìn)行熒光測試；

3）將上述加入氨基酸后導(dǎo)致杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液的熒光信號(hào)發(fā)生變化的氨基酸以及這些氨基酸和杯吡啶的混合物溶解于氘水中混合均勻得到溶液，所述氨基酸和杯吡啶的濃度均為5 mmol/L，而后對這些氘水溶液在室溫下分別進(jìn)行核磁共振氫譜測試。

實(shí)施例2：

一種杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法：

1）杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸的選擇性識(shí)別通過熒光光譜手段表征，圖1為杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽、杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽—氨基酸水溶液的熒光發(fā)射光譜圖，其中杯吡啶濃度為0.004 mmol/L，芘四磺酸四鈉鹽濃度為0.001 mmol/L，氨基酸濃度為1 mmol/L，氨基酸包括酸性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸，堿性氨基酸組氨酸、精氨酸、賴氨酸和中性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸；圖中顯示，當(dāng)中性氨基酸或堿性氨基酸中的組氨酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)并未發(fā)生變化，仍為弱熒光發(fā)射信號(hào)，表明上述氨基酸和杯吡啶無鍵合；當(dāng)堿性氨基酸中的賴氨酸、精氨酸或酸性氨基酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)發(fā)生明顯的變化，由弱熒光發(fā)射信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)；

2）杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸的選擇性識(shí)別通過核磁波譜表征，圖2為谷氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—谷氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖；圖3為天門冬氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—天門冬氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖；圖4為精氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—精氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖；圖5為賴氨酸（附圖中標(biāo)記為a）和杯吡啶—賴氨酸（附圖中標(biāo)記為b）氘水溶液的核磁共振氫譜圖，其中氨基酸和杯吡啶的濃度都為5 mmol/L；圖6為在杯吡啶存在的情況下，谷氨酸（附圖中縮寫為Glu）、天門冬氨酸（附圖中縮寫為Asp）、精氨酸（附圖中縮寫為Arg）和賴氨酸（附圖中縮寫為Lys）上各個(gè)氫質(zhì)子的化學(xué)位移變化值圖，圖中顯示，賴氨酸和精氨酸在杯吡啶存在的情況下氨基酸上所有氫原子的化學(xué)位移和其單獨(dú)存在時(shí)相比并未發(fā)生位移變化，表明堿性氨基酸中的賴氨酸、精氨酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)導(dǎo)致芘四磺酸四鈉鹽產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化并非是杯吡啶和賴氨酸、精氨酸鍵合造成的，賴氨酸、精氨酸和杯吡啶無鍵合；而酸性氨基酸在杯吡啶存在的情況下氨基酸上所有氫原子的化學(xué)位移和其單獨(dú)存在時(shí)相比有明顯的位移變化，表明酸性氨基酸加入到杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)導(dǎo)致芘四磺酸四鈉鹽產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化是杯吡啶和酸性氨基酸鍵合造成的，酸性氨基酸和杯吡啶有鍵合。

實(shí)施例3

實(shí)施例2杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu的檢測的應(yīng)用，方法如下：

將杯吡啶、芘四磺酸四鈉鹽溶解于水中后混合均勻得到溶液，所述杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽濃度分別為0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。如圖7所示，隨著酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu逐漸加入到上述杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)由弱熒光發(fā)射信號(hào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對酸性氨基酸縮合成的肽Glu-Glu的熒光傳感檢測的應(yīng)用。

實(shí)施例4

實(shí)施例2杯吡啶在中性生理pH值水溶液中對酸性氨基酸選擇性識(shí)別的方法對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的檢測的應(yīng)用，方法如下：

將杯吡啶、芘四磺酸四鈉鹽溶解于水中后混合均勻得到溶液，所述杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽濃度分別為0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。如圖8所示，隨著酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸逐漸加入到上述杯吡啶—芘四磺酸四鈉鹽水溶液中，芘四磺酸四鈉鹽的熒光信號(hào)由弱熒光發(fā)射信號(hào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光發(fā)射信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對酸性氨基酸代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸的熒光傳感檢測的應(yīng)用。