本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種微小病變型腎病的早期診斷的生物標(biāo)記物、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微小病變型腎病(minimal change nephropathy，MCD)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫，高脂血癥為基本特征的腎病綜合征的多種類型之一。好發(fā)于兒童，占兒童原發(fā)性腎病綜合征的80％左右，占成人原發(fā)性腎病綜合征的5％-10％。微小病變型腎病對糖皮質(zhì)激素的治療敏感，但極易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)變?yōu)榧に啬退幓蚣に匾蕾嚕R床治療較為棘手。并且該病強(qiáng)調(diào)個體化治療，即針對不同個體及同一個體的不同病程的病理改變來調(diào)整治療方案。因此，對微小病變型腎病的正確的早期診斷尤為重要。微小病變型腎病在光鏡下腎小球無明顯病變，免疫熒光陰性，只有通過電鏡下特征性改變，即廣泛的腎小球臟層上皮細(xì)胞足突融合來進(jìn)行確診。而電鏡學(xué)技術(shù)檢查費(fèi)用高、診斷用時長，目前國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚未廣泛普及。該病的特點(diǎn)決定了病理診斷的困難，從而容易錯過患者的最佳治療時機(jī)。同時，在出現(xiàn)激素耐藥或激素依賴時，則應(yīng)及時注意病理類型的改變。因此，一種可以在早期有效并且簡易的診斷微小病變型腎病的方法的出現(xiàn)，對患者至關(guān)重要。

另一方面，在腎小球疾病的不同病理類型中，除膜性腎病(membranous nephropathy，MN)和微小病變型腎病這兩者，多數(shù)在光鏡下可見腎小球結(jié)構(gòu)的異常變化。臨床膜性腎病可以通過免疫熒光技術(shù)來進(jìn)行診斷，但免疫熒光顯微鏡相對普通顯微鏡昂貴。如果能夠通過免疫組織化學(xué)染色在普通光鏡下即可觀察到該病的特征性病變，不僅有助于對兩種疾病的鑒別，也有助于進(jìn)一步快速的確定膜性腎病的診斷，從而為臨床醫(yī)生制定針對性的治療方案提供可靠的依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種微小病變型腎病的早期病變有密切的關(guān)系并能夠獨(dú)立用于檢測微小病變型腎病早期病變的生物標(biāo)記物，并將其應(yīng)用于制造微小病變型腎病的早期診斷試劑盒。

本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

一種微小病變型腎病的早期診斷生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物為STMN1蛋白。

本發(fā)明還提供所述的生物標(biāo)記物在制造用于微小病變型腎病的早期診斷的試劑盒中的應(yīng)用，其包括以下步驟：

(1)準(zhǔn)備取自受試者的待測樣品和對照品；

(2)對步驟(1)的待測樣品和對照品中的STMN1蛋白進(jìn)行定量測定，得到樣品值和對照值；

(3)將步驟(2)中得到的所述樣品值和所述對照組進(jìn)行比較，所述樣品值高于所述對照值，則判斷所述受試者伴有微小病變型腎病。

進(jìn)一步地，所述的受試者的待測樣品取自患有腎小球損傷患者的腎組織，所述對照品取自腎切除術(shù)患者的正常腎組織。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中使用免疫組織化學(xué)染色法對所述STMN1蛋白進(jìn)行定量測定。免疫組織化學(xué)染色法的檢測結(jié)果根據(jù)STMN1蛋白陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和所述陽性細(xì)胞占所有同類細(xì)胞的百分比中和判斷。本發(fā)明中根據(jù)對于STMN1蛋白的免疫組織化學(xué)染色的定性結(jié)果，也可以判斷受試者是否為伴有微小病變型腎病患者。

上述所述的待測樣品和對照品可以為任何類型的離體腎組織或細(xì)胞樣本，包括新鮮采集的腎穿刺活檢組織、福爾馬林固定石蠟包埋的腎組織、OCT包埋的冷凍腎組織，液氮保存的新鮮無固定腎組織等。無論應(yīng)用于哪種類型的生物樣本，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)信息確定樣品的前處理方法，使處理后的樣品適用于利用免疫組織化學(xué)染色法對所述STMN1蛋白進(jìn)行定性和定量測定。

本發(fā)明所述的試劑盒，包括抗STMN1抗體。抗STMN1抗體只要對STMN1蛋白具有特異的結(jié)合性，則其種類或來源等沒有特別限制。另外，可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括封閉待測樣品組織的封閉液、與STMN1抗體特異性結(jié)合的生物標(biāo)記二抗、與生物標(biāo)記二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)的顯色劑。為了檢測直接、簡便、高靈敏度的目的，優(yōu)先使用利用結(jié)合有標(biāo)記物的二次抗體的方法、利用二次抗體與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而成的聚合物的方法等間接的檢測方法。

此處的二次抗體是指對抗STMN1抗體具有特異性結(jié)合的抗體。二次抗體可以使用來源于兔、山羊、小鼠等的市售的具有標(biāo)記物的二次抗體。

進(jìn)一步地，所述封閉液含有5wt％山羊血清、1wt％BSA、0.01wt％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸緩沖液，所述生物標(biāo)記二抗為生物素化二抗，所述顯色劑含有辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素和DAB顯色試劑。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括作為復(fù)染劑的蘇木精染色液。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括由0.01M檸檬酸鹽緩沖液和磷酸緩沖液組成的抗原修復(fù)系統(tǒng)，以及由3％過氧化氫和磷酸緩沖液組成的消除內(nèi)源性過氧化物酶系統(tǒng)。

本發(fā)明中，對動物腎小球病變的研究結(jié)果顯示，STMN1在早期無光鏡結(jié)構(gòu)變化的腎小球損傷中高表達(dá)，經(jīng)western blotting和qPCR進(jìn)一步證實，STMN1的蛋白和基因表達(dá)量在損傷的腎小球足細(xì)胞中也比未損傷的細(xì)胞中明顯升高。結(jié)合此結(jié)果，利用我國正常和常見三種腎小球病變的病人標(biāo)本，包括MN，MCD，局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，采用簡單易行的免疫組織化學(xué)方法，定性地確認(rèn)了STMN1在微小病變型腎病早期診斷的生物標(biāo)記作用。目前還沒有Stathmin 1(STMN1)蛋白與微小病變型腎病的關(guān)聯(lián)性的報道。

本發(fā)明采用利用所述試劑盒，對于取自受試者的待測樣品和對照品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，測定待測樣品和對照品中的STMN1蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色后，STMN1蛋白陽性細(xì)胞染成褐色，可以在光學(xué)顯微鏡下觀察得到。根據(jù)樣品染色情況判定腎組織的疾病診斷：腎小球足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體呈褐色陽性反應(yīng)可診斷為微小病變型腎病。該方法操作簡單準(zhǔn)確，對樣品的要求不高，可用于大規(guī)模篩查或追溯性研究。這些方法可以應(yīng)用于多種樣本，冰凍組織、石蠟包埋組織、新鮮離體組織等，可提供多層次的檢測信息，可為微小病變型腎病等腎小球性疾病的研究提供支持，也為臨床診斷和指導(dǎo)用藥提供可依賴的檢測指標(biāo)。從而使患者得到更加充分、有效的治療，最終達(dá)到改善疾病預(yù)后的目的。

附圖說明

圖1表示STMN1在阿霉素腎病模型大鼠腎組織中的表達(dá)情況；

圖2表示STMN1在微小病變腎病臨床病人腎組織中的表達(dá)情況；

圖3表示STMN1在不同類型的腎小球損傷疾病患者的腎組織中的表達(dá)對比情況。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。下面實施例中未注明具體實驗條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件所述條件，或按照產(chǎn)品說明書上所提供的條件。下面實施例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

1.待測樣品和對照品：

(1)來自實驗動物的待測樣品和對照品：

按照文獻(xiàn)(Okuda S.等，Kidney international，1986；29(2):502-510)所述的方法，將大鼠(雄性Sprague-Dawley大鼠6～8周，購自從大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，給予兩次尾靜脈注射阿霉素(4.0毫克/公斤和2.5毫克/公斤)，得到大鼠阿霉素腎病大鼠模型，取腎組織，作為腎小球腎病組(待測樣品)。對照品來自兩次尾靜脈注射同樣計量的生理鹽水的大鼠腎組織。

(2)來自病人的待測樣品和對照品：

取自常見三種腎小球病變的病人的腎組織作為待測樣品，所述常見三種腎小球病變?yōu)槲⑿〔∽冃湍I病(MCD)，膜性腎病(MN)和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)。取自腎切除術(shù)患者的正常腎組織作為對照品。

2.采用含有抗STMN1抗體的試劑盒，對于取自受試者的待測樣品和對照品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，測定待測樣品和對照品中的STMN1蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色后，STMN1蛋白陽性細(xì)胞染成褐色，可以在光學(xué)顯微鏡下觀察得到。根據(jù)樣品染色情況判定腎組織的疾病診斷：腎小球足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體呈褐色陽性反應(yīng)可診斷為微小病變型腎病。

(1)含有抗STMN1抗體的試劑盒，包括封閉待測樣品組織的封閉液、與STMN1抗體特異性結(jié)合的生物標(biāo)記二抗、與生物標(biāo)記二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)的顯色劑。優(yōu)先地，所述封閉液含有5wt％山羊血清、1wt％BSA、0.01wt％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸緩沖液，所述生物標(biāo)記二抗為生物素化二抗，所述顯色劑含有辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素和DAB顯色試劑。

所述試劑盒還可以包括作為復(fù)染劑的蘇木精染色液。

所述試劑盒還可以包括由0.01M檸檬酸鹽緩沖液和磷酸緩沖液組成的抗原修復(fù)系統(tǒng)，以及由3％過氧化氫和磷酸緩沖液組成的消除內(nèi)源性過氧化物酶系統(tǒng)。所述試劑盒可針對性地適用于石蠟包埋的腎組織樣本。

3.免疫組織化學(xué)染色及判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用本發(fā)明試劑盒對待測樣品和對照品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行微小病變型腎病的早期診斷，包括如下步驟：

①封閉：在待處理樣品的組織上加200μl封閉液，室溫孵育60分鐘；

②抗原抗體反應(yīng)：

(1)一抗孵育：在組織上加150μl按照1:100比例稀釋的STMN1抗體，以封口膜覆蓋組織，于4℃孵育過夜，然后以PBS清洗3次，每次10分鐘；

設(shè)陰性對照組，用同體積封閉液代替STMN1抗體。

(2)二抗孵育：在組織上加150μl生物素化二抗工作液，室溫孵育60分鐘，PBS清洗3次，每次10分鐘；

③在組織上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫孵育60分鐘，PBS清洗3次，每次10分鐘；

④DAB顯色(采用市售的DAB染色液)：

(1)制備底物混合液：在1ml pH值＝7.0的雙蒸水中，加入一滴試劑A，混合均勻后，將試劑B和試劑C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；

(2)顯色：將150μl底物混合液滴加在組織上，室溫顯色3～10分鐘，充分顯色后自來水沖洗終止反應(yīng)；

⑤染色、脫水、透明、封片：將組織切片浸入蘇木精染色液2次，每次2秒；然后用蒸餾水處理3次，每次5分鐘；再依次以50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各處理1次，每次1分鐘；再以無水乙醇處理2次，每次2分鐘，二甲苯與無水乙醇1:1混合物處理1次，2分鐘，100％二甲苯處理2次，每次2分鐘；最后用樹膠封片，保存；

⑥根據(jù)樣品染色情況判定腎組織的疾病診斷：腎小球足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體呈褐色陽性反應(yīng)可診斷為微小病變型腎病。

上述本發(fā)明的對腎組織進(jìn)行微小病變型腎病的早期診斷的方法理論上適用于任何類型的離體腫瘤組織或細(xì)胞樣本，包括新鮮采集的腎穿刺活檢組織、福爾馬林固定石蠟包埋腎組織、OCT包埋的冷凍腎組織，液氮保存的新鮮無固定腎組織等。無論應(yīng)用于哪種類型的生物樣本，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)信息確定樣品的前處理方法，已使處理后的樣品適用于本發(fā)明所述及的免疫組化檢測。對于幾種典型的樣本及其處理方法分別是：

(1)所述早期診斷微小病變型腎病的方法應(yīng)用于福爾馬林固定石蠟包埋腎組織時，對樣品的預(yù)處理包括如下步驟：

a.脫蠟：福爾馬林固定石蠟包埋腎組織常規(guī)切片，厚度4～5μm的石蠟組織切片依次經(jīng)過100％二甲苯脫蠟3次，每次5分鐘；無水乙醇脫蠟3次，每次2分鐘；95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇各脫蠟1次，2分鐘；

b.抗原修復(fù)：以0.01M檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，然后以PBS清洗3次，每次5分鐘；

c.消除內(nèi)源性過氧化物酶：將組織切片置于3％過氧化氫中，室溫孵育30分鐘，用PBS清洗3次，每次5分鐘。

處理所得樣品直接用于檢測。

(2)所述早期診斷微小病變型腎病的方法應(yīng)用于OCT包埋的冷凍保存的腎組織時，對樣品的預(yù)處理包括如下步驟：

a.組織固定：將患者腎穿刺活檢組織約2x2cm³立即置入4％多聚甲醛中，4℃，固定24小時；

b.PBS清洗3次，每次10分鐘；

c.將組織浸入30％蔗糖，4℃過夜；

d.OCT混合物(opti-mum cutting temperature compound)包埋，放置在干冰上；

e.待OCT混合物凝固后，恒冷箱冰凍切片7～10μm；

(3)所述早期診斷微小病變型腎病的方法的應(yīng)用于液氮保存的新鮮無固定腎組織時，對樣品的預(yù)處理包括如下步驟：

a.將患者腎穿刺活檢的新鮮腎組織迅速置入液氮中，待用；

b.用時首先將組織浸入4％多聚甲醛中，4℃，固定24小時；

根據(jù)用戶所具有的實驗室設(shè)備，可行上述兩種方法中的任何一種：即石蠟包埋或OCT包埋過程后，處理所得樣品直接用于檢測。

實施例1 STMN1在早期無光鏡結(jié)構(gòu)變化的腎小球損傷中高表達(dá)

早期無光鏡結(jié)構(gòu)變化的腎小球損傷待測樣品準(zhǔn)備：

注射阿霉素獲得的阿霉素腎病模型大鼠，斷頭處死，剖開腹腔，取出一部分腎組織，生理鹽水沖洗，并將其切成小塊，經(jīng)福爾馬林等固定液固定后，石蠟包埋，制備得到福爾馬林固定石蠟包埋腎組織，作為病變組。代替阿霉素注射生理鹽水的大鼠，處死，取出腎組織，與病變組同樣的方法處理，得到福爾馬林固定石蠟包埋腎組織，作為對照組。

將準(zhǔn)備得到的病變組和對照組的石蠟包埋腎組織，上切片機(jī)切片，得到5μm厚度的石蠟組織切片，用于蘇木精-伊紅染色(HE染色)以及免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

圖1A為HE染色結(jié)果，圖1A中可見，相對于對照組，病變組的腎小球在結(jié)構(gòu)上無明顯的變化。

圖1B為STMN1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，圖1B中可見，相對于對照組，STMN1在病變組的腎小球足細(xì)胞中高表達(dá)，在對照組的腎小球內(nèi)的足細(xì)胞中幾乎不表達(dá)STMN1，但在腎小球損傷的模型中，大部分腎小球足細(xì)胞高表達(dá)STMN1(在圖中部分STMN1陽性細(xì)胞用箭頭表示)。

圖1C為電鏡下觀察得到的病變組和對照組的EPON812樹脂包埋腎組織切片，圖1C中可見，相對于對照組，病變組的足細(xì)胞損傷，可見突起融合基膜增厚(用箭頭表示)。

在上述STMN1定性表達(dá)的研究基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步確認(rèn)STMN1在腎小球損傷腎組織中的定量表達(dá)，將阿霉素腎病模型大鼠的腎組織和正常腎組織(對照組)中，提取總蛋白，采用Westen Blotting法測定STMN1蛋白的表達(dá)情況；同時提取總RNA，采用定量PCR方法檢測STMN1基因的表達(dá)情況。Westen Blotting結(jié)果如圖1D，定量PCR結(jié)果如圖1E，可見STMN1的蛋白和基因表達(dá)量在損傷的腎小球足細(xì)胞中比未損傷的細(xì)胞中明顯升高。

結(jié)果表明：STMN1可以作為一個生物標(biāo)記物，對動物模擬的腎小球損傷進(jìn)行早期診斷。即便損傷是在常規(guī)光鏡尚無任何跡象，僅在80萬倍放大的電鏡下，方可觀察到的定性變化。綜合上述定性與定量結(jié)果分析，STMN1可以作為一個用于微小病變腎病早期診斷的生物標(biāo)志物。

實施例2 STMN1在微小病變腎病中的表達(dá)

圖2表示STMN1在微小病變腎病中的表達(dá)。

微小病變腎病病人待測樣品準(zhǔn)備：微小病變腎病病人的臨床腎穿標(biāo)本，經(jīng)福爾馬林等固定液固定后，石蠟包埋，制備得到福爾馬林固定石蠟包埋腎組織，作為病變組。腎切除術(shù)患者的正常腎組織同樣的方法處理，得到福爾馬林固定石蠟包埋腎組織，作為對照組。

將準(zhǔn)備得到的病變組和對照組的石蠟包埋腎組織，上切片機(jī)切片，得到5μm厚度的石蠟組織切片，用于免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

結(jié)果顯示：相對于對照組，病變組的腎小球在光鏡觀察時結(jié)構(gòu)上無明顯的變化。但與對照組相比，STMN1在微小病變腎病標(biāo)本組的腎小球中表達(dá)明顯增高，其陽性褐色表達(dá)主要分布在足細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞體(在放大圖中部分STMN1陽性細(xì)胞用箭頭表示)。而對照組中的腎小球足細(xì)胞顯示STMN1陰性表達(dá)。圖2的結(jié)果可見，STMN1可用于即使在光學(xué)顯微鏡下沒有任何結(jié)構(gòu)變化的微小病變腎病的早期診斷的生物標(biāo)志物。

圖3表示STMN1在不同類型的腎小球損傷疾病患者的腎組織中的表達(dá)對比情況。

臨床上診斷為微小病變型腎病(MCD)、膜性腎病(MN)和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的患者腎穿刺活檢的新鮮腎組織，作為病變組。腎切除術(shù)患者的正常腎組織，作為對照組，置入福爾馬林等固定液固定后，石蠟包埋，制備得到福爾馬林固定石蠟包埋腎組織，上切片機(jī)切片，得到5μM厚度的石蠟包埋組織切片，用于STMN1的免疫組織化學(xué)染色。

在對照組、MCD、MN和FSGS中的STMN1的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖3，圖3結(jié)果可見，與對照組相比，STMN1在微小病變型腎病(MCD)和膜性腎病(MN)的腎小球足細(xì)胞中明顯增強(qiáng)。STMN1在微小腎病(MCD)的腎小球組織中，僅表達(dá)在足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體，但在膜性腎病的腎小球組織中，STMN1除了在足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體外，還明顯地表達(dá)在環(huán)繞在血管襻周圍的足細(xì)胞突起中(在放大圖中部分STMN1陽性細(xì)胞用箭頭表示)。STMN1在FSGS中表達(dá)陰性。

本發(fā)明中，STMN1在腎小球損傷腎組織中表達(dá)明顯提高，可以初步判定，STMN1陽性反應(yīng)的腎組織可診斷為腎小球損傷性疾病。根據(jù)STMN1在足細(xì)胞的表達(dá)分布可以進(jìn)一步確定是哪種病變的腎小球損傷。STMN1僅表達(dá)在足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞體，沒有明顯細(xì)長突起環(huán)繞血管襻周圍的腎組織可診斷為微小病變型腎病。對于初級檢驗師，可以通過免疫熒光技術(shù)排除膜性腎病。MN，MCD和FSGS是臨床上最為常見的腎小球損傷性疾病。FSGS通?？稍贖E染色的光鏡下進(jìn)行診斷，MN需在免疫熒光染色的熒光顯微鏡下確診，但是MCD微小病變型腎病的診斷只能通過電鏡，檢查費(fèi)用高、診斷用時長且普及性受限(除高級的教學(xué)醫(yī)院外，一般醫(yī)院沒有電鏡)?；诖税l(fā)現(xiàn)，本申請?zhí)峁┮幌盗杏糜谠缙谠\斷微小病變型腎病的方法，以及相關(guān)的試劑組合。本發(fā)明所述方法可以在普通顯微鏡下通過免疫組織化學(xué)染色的方式，快速、靈敏，直觀的對微小病變型腎病進(jìn)行診斷以及與膜性腎病和FSGS的鑒別。本發(fā)明所述的操作方法簡單準(zhǔn)確，對樣品的要求不高，可用于大規(guī)模篩查或追溯性研究。這些方法可以應(yīng)用于多種樣本，冰凍組織、石蠟包埋組織、新鮮離體組織等，可提供多層次的檢測信息，可為微小病變型腎病等腎小球性疾病的研究提供支持，也為臨床診斷和指導(dǎo)用藥提供可依賴的檢測指標(biāo)。從而使患者得到更加充分、有效的治療，最終達(dá)到改善疾病預(yù)后的目的。