本申請要求之前于2010年8月18日提交的美國臨時專利申請系列No.61/374,676的優(yōu)先權(quán)，并通過引用方式全文并入該公開。

此外，本申請還通過引用方式全文并入了在2010年5月24日提交的美國專利申請系列號12/785,716。

背景技術(shù)：

電化學(xué)檢測由于其提供了高敏感性、小維度、低成本、快速反應(yīng)以及與微細加工技術(shù)的相容性而引人注目。(例如參見Hughes et al，，Science，254：74-80(1991)；Mir et al，Electrophoresis，30：3386-3397(2009)；Trojanowicz，Anal.Chim，Acta，653：36-58(2009)；和Xu et al.，Taianta，80：8-18(2009))。這些特征導(dǎo)致多種基于電流、電勢或阻抗信號的傳感器的發(fā)展，并將它們組裝到用于化學(xué)、生物化學(xué)和細胞應(yīng)用的陣列中。(例如參見Yeow et al.，Sensors and Actuators B 44：434-440(1997)；Martinoia et al.，Biosensors&Bioelectronics，16：1043-1050(2001)；Hammond et al，IEEE Sensors X，4：706-712(2004)；Milgrew et al.，Sensors and Actuators B 103：37-42(2004)；Milgrew et al，Sensors and Actuators B，111-112：347-353(2005)；Hizawa et al.，Sensors and Actuators B，117：509-515(2006)；Heer et al，Biosensors and Bioeiectronics，22：2546-2553(2007)；Barbara et al，Sensors and Actuators B，118：41-46(2006)；Anderson et al.，Sensors and Actuators B，129：79-86(2008)；Rothberg et al，美國專利公開2009/0127589；和Rothberg et al，英國專利申請GB24611127)。通常，在此類系統(tǒng)中，分析物隨機分布在限制區(qū)域(例如微孔(本文也稱為“孔”)或反應(yīng)室)的陣列中，并且試劑通過流體系統(tǒng)被傳遞至所述的區(qū)域中，其中所述的流體系統(tǒng)使試劑定向流動通過包括傳感器陣列的流動池。其中發(fā)生反應(yīng)的微孔以及未發(fā)生反應(yīng)的空孔可以通過與各個微孔相關(guān)聯(lián)的一個或多個電傳感器監(jiān)測。

在一種類型的電化學(xué)檢測中，基本反應(yīng)產(chǎn)物或“信號”為pH變化。通過測量孔底部的表面電荷變化來檢測pH的變化?？椎撞康谋砻婢彌_了由于生物反應(yīng)所產(chǎn)生的pH的變化。由于生物反應(yīng)所導(dǎo)致的表面電荷的變化通過孔的底部與位于其表面之下的化學(xué)敏感場效晶體管(chemFET)的浮動?xùn)胖g的電容耦合來感知。然而，孔的側(cè)壁與chemFET離開的太遠，以至于不會有助于chemFET信號。遺憾的是，在目前的實施方式中，孔的側(cè)壁以及孔底部的表面起到緩沖作用。例如，圖2A示出了在底部和側(cè)壁上具有天然金屬氧化物、氮化物或oxinitride表面的現(xiàn)有技術(shù)的微孔結(jié)構(gòu)。因此，側(cè)壁的緩沖作用減弱了在孔的底部所檢測的信號。

鑒于上文所述，有利的是具有有效的微孔結(jié)構(gòu)，以及能夠克服現(xiàn)有方法的缺陷的保形涂敷和選擇性蝕刻微孔側(cè)壁(這會減弱側(cè)壁的緩沖作用)的方法。

附圖簡述

圖1示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的流動池的剖視圖。

圖2A示出了具有天然金屬氧化物表面的現(xiàn)有技術(shù)的孔的結(jié)構(gòu)。

圖2B示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的、具有保形硅烷化表面的孔的結(jié)構(gòu)。

圖2C示出了具有保形硅烷化表面的孔的結(jié)構(gòu)，以及根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案被蝕刻成原始的金屬氧化物的所有水平表面。

圖3A示出了一種類型的硅烷的PEG-硅烷的分子結(jié)構(gòu)，其中所述的這種類型的硅烷可以用于根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的微孔的保形涂敷過程。

圖3B示出了另一種類型的硅烷的分子結(jié)構(gòu)，其中所述的另一種類型的硅烷可以用于根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的微孔的保形涂敷過程。

圖3C示出了兩性離子種類的硅烷的分子結(jié)構(gòu)，其中所述的兩性離子種類的硅烷可以用于根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的微孔的保形涂敷過程。

圖4A-4C示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造孔結(jié)構(gòu)的不同階段。

圖5示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造圖4C所示的孔結(jié)構(gòu)的過程。

圖6A-6F示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造另一種孔結(jié)構(gòu)的不同階段。

圖7示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造圖6F所示的孔結(jié)構(gòu)的過程。

圖8示出了根據(jù)本教導(dǎo)的另一個實施方案的孔結(jié)構(gòu)。

圖9A-9E示出了根據(jù)本教導(dǎo)的另一個實施方案制造孔結(jié)構(gòu)的不同階段。

圖10示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造圖9E所示的孔結(jié)構(gòu)的過程。

圖11示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的化學(xué)感應(yīng)過程。

發(fā)明詳述

所述的實施方案可以提供具有改善的信噪比(SNR)化學(xué)檢測裝置。該化學(xué)檢測裝置可以包括使用化學(xué)品涂敷的微孔，其中所述的化學(xué)品與微孔的底部結(jié)合并有利于離子與置于微孔底部之下的CMOS裝置的結(jié)合。在不同的實施方案中，微孔的側(cè)壁可以由二氧化硅(SiO₂)或塑料制成。在一個實施方案中，微孔的側(cè)壁可以使用硅烷類物質(zhì)涂敷，其中所述的硅烷類物質(zhì)會減弱溶液中質(zhì)子的緩沖作用。SNR可以通過側(cè)壁減弱質(zhì)子的緩沖作用來改善。

一個實施方案可以提供制造具有改善的信噪比的化學(xué)檢測裝置的方法。該方法可以包括：在CMOS裝置的頂部形成塑料層；在塑料層的頂部形成金屬氧化物層；通過各向異性塑料蝕刻在位于CMOS裝置的頂部上的塑料層上形成微孔；以及施加可與微孔的底部結(jié)合、但不會結(jié)合塑料側(cè)壁的化學(xué)品。

另一個實施方案可以提供制造具有改善的信噪比的化學(xué)檢測裝置的方法。該方法可以包括：在位于二氧化硅(SiO₂)層頂部上的金屬氧化物上形成微孔的開口。SiO₂層可以位于CMOS裝置的頂部。該方法可以進一步包括在位于微孔開口的邊緣之下的SiO₂層上形成環(huán)狀底切；通過各向異性SiO₂蝕刻，在位于CMOS裝置的頂部上的SiO₂層上形成微孔；施加一種與微孔的側(cè)壁和底部結(jié)合的化學(xué)品；使位于微孔底部的化學(xué)品失活；以及施加另一種定位于微孔的底部并有利于離子的結(jié)合的化學(xué)品。

另一個實施方案可以提供制造具有改善的信噪比的化學(xué)檢測裝置的方法。該方法可以包括：在位于二氧化硅(SiO₂)層頂部上形成金屬氧化物層。SiO₂層可以位于CMOS裝置的頂部。該方法可以進一步包括在位于CMOS裝置的頂部上的SiO₂層上形成微孔；施加與微孔的側(cè)壁和底部結(jié)合的化學(xué)品；以及蝕刻掉微孔底部的化學(xué)品。

另一個實施方案可以提供制造具有改善的信噪比的化學(xué)檢測裝置的方法。該方法可以包括：在位于CMOS裝置的頂部上的二氧化硅(SiO₂)層中形成微孔；施加可選擇性地附著在微孔的底部的化學(xué)品；在微孔的頂部邊緣和側(cè)壁上形成金屬氧化物層；以及施加可選擇性地附著在微孔的頂部邊緣和側(cè)壁上的另一種化學(xué)品。

圖1為流動池100的放大剖視圖，其示出了具有試劑流108的流動室106的一部分，其中試劑流108移動穿過位于微孔的開放末端上的微孔陣列102的表面。微孔陣列102和傳感器陣列105一起可以形成整合單元，該單元形成了流動池100的底部的壁或底面。在一個實施方案中，參比電極104可以以流體方式與流動室106連接。微孔101和傳感器114在放大圖中示出。微孔101可以通過任何傳統(tǒng)的微細加工技術(shù)以統(tǒng)裝材料110的方式形成。微孔的體積、形狀、縱橫比(例如底寬與孔高的比例)以及其他的維度特征可以具有設(shè)計選擇性，這取決于具體的應(yīng)用，包括所發(fā)生的反應(yīng)的本性、以及所采用的試劑、副產(chǎn)物和標(biāo)記技術(shù)(如果使用的話)。傳感器114可以為具有浮動?xùn)?18的chemFET，所述的浮動?xùn)?18具有通過鈍化層116而與微孔內(nèi)部分離的傳感器板120。傳感器114主要可以響應(yīng)于在與傳感器板120相對的鈍化層116上存在的電荷124的量(以及產(chǎn)生與該量相關(guān)的輸出信號)。電荷124的變化可以導(dǎo)致FET的來源121和排出122之間的電流的變化，這可以直接用于提供基于電流的輸出信號，或者使用額外的線路間接提供基于電壓的輸出信號。試劑、洗滌溶液和其他的試劑主要通過擴散140而由流動室106移動進入到微孔中。

在一個實施方案中，在微孔101中進行的反應(yīng)可以為分析反應(yīng)，從而鑒別或確定所關(guān)注的分析物的特征或性質(zhì)。此類反應(yīng)可以直接或間接產(chǎn)生會影響與傳感器板120相鄰的電荷的量的副產(chǎn)物。(例如，如果使用了副產(chǎn)物螯合劑或其他結(jié)合化合物，其會影響在結(jié)合所關(guān)注的分析物之后的傳感器，或者如果使用了標(biāo)記部分，例如作為結(jié)合事件等的結(jié)果可以形成次級副產(chǎn)物的酶，則可以進行間接檢測)。如果生產(chǎn)少量的這種副產(chǎn)物，或者這種副產(chǎn)物快速衰退或與其他構(gòu)成部分反應(yīng)，則可以在微孔101中同時分析同一分析物的多個拷貝以便增強最終產(chǎn)生的輸出信號。在一個實施方案中，在沉積到微孔中之前或之后，分析物的多個拷貝可以附著在固相負載體112上。固相負載體112可以為微粒子、納米粒子、珠、包含固體和多孔的凝膠等。就核酸分析物而言，可以通過滾環(huán)擴增(RCA)、指數(shù)RCA等技術(shù)來制備多個相關(guān)的拷貝，從而在無需固體負載體的條件下生產(chǎn)擴增子。

在一個實施方案中，基因組DNA片段測序而產(chǎn)生的副產(chǎn)物為pH變化，這是由于引入了核苷酸。在一個實施方案中，這可以在7.5至7.8的合適的操作pH下發(fā)生。在給定條件下，每個引入的核苷酸釋放大約一個質(zhì)子。通過測量在孔底部的表面上的電荷的變化來檢測pH變化。孔的底部和側(cè)面的表面通常由金屬氧化物或氮化物構(gòu)成。該表面可以包含大量的可以發(fā)生充電反應(yīng)的表面基團。這些充電反應(yīng)可以使用以下等式來描述：

表面基團的數(shù)量以及與上述充電反應(yīng)相關(guān)的特性平衡常數(shù)賦予所述的表面以緩沖的能力。在有限樣品體積(例如微孔)中的表面緩沖能力將緩沖與生物嵌入反應(yīng)相關(guān)的pH變化。由于充電反應(yīng)(上述等式(1)和(2))而引起的表面電荷的變化可以通過將孔的底部與定位于孔的底表面以下的chemFET之間相偶聯(lián)的能力來感應(yīng)。然而，如在背景技術(shù)部分中所討論的那樣，孔的側(cè)壁與chemFET離開的太遠，以至于不會有助于chemFET信號。因此，本發(fā)明的實施方案采用保形涂敷來區(qū)分孔的側(cè)壁和底部，并由此減弱側(cè)壁的緩沖。

圖2B和2C示出了本發(fā)明的一個實施方案，其通過保形涂敷天然金屬氧化物、氮化物或oxinitride表面層、然后選擇性地蝕刻所有水平的表面而解決了側(cè)壁緩沖的問題。圖2B示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案使用硅烷對側(cè)壁的所有表面進行的保形涂敷。如圖26所示，微孔202可以通過層204覆蓋(在底部和側(cè)壁之上)。例如，層204可以為對質(zhì)子缺乏親和性的化學(xué)品層。保形涂敷減弱或消除了可以在溶液中與質(zhì)子發(fā)生反應(yīng)的表面基團，并因此減弱或消除所述的表面的緩沖能力。例如，當(dāng)由微孔202的底部除去層204時，側(cè)壁上的層204可以幫助減弱或消除微孔側(cè)壁的緩沖能力。圖2C示出了僅對水平表面(包括孔的底部以及孔之間的頂部邊緣)進行選擇性蝕刻的結(jié)果，選擇性蝕刻恢復(fù)了天然金屬氧化物、氮化物或oxinitride表面，并因此允許在孔的底物選擇性地感應(yīng)pH?？梢允褂糜糜谖g刻水平表面的不同的技術(shù)。在一個實施方案中，使用水平表面的定向反應(yīng)性離子蝕刻(例如Bosch過程)來完成蝕刻。

圖3A-3C示出了可以用于保形涂敷過程的不同類型的硅烷。圖3A示出了可以用于保形涂敷過程的PEG-硅烷的結(jié)構(gòu)。其可以得自NANOCS.com(產(chǎn)品代碼PEG6-0 I02)，并且PEG的平均MW＝2000。所述的硅烷可以賦予電荷未變化的親水性表面在大致的操作pH(例如7.5至7.8的pH范圍)下使pH發(fā)生較小的變化。圖3B示出了可以用于保形涂敷過程中的N，N，N-三甲基-3-(三甲氧基甲硅烷基)-I-丙基氯化銨硅烷(propanaminium chloride silane)的結(jié)構(gòu)。其可以得自Sigma Aldrich(產(chǎn)品#595888)。該硅烷可以賦予所有垂直表面以親水性正電荷。在所述的表面上的電荷在大致的操作pH下對pH的較小的變化不會產(chǎn)生應(yīng)答。圖3C示出了可以用于保形涂敷過程的兩性離子種類的硅烷的結(jié)構(gòu)。其可以使用丙磺酸內(nèi)酯和APTMS在單一步驟的反應(yīng)中得到。其可以賦予側(cè)壁以高度親水性但總體中性的涂層。

圖4A-4C示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造孔結(jié)構(gòu)的、不同階段的截面圖。圖4A示出了在形成微孔之前部分化學(xué)感應(yīng)裝置400的截面圖?；瘜W(xué)感應(yīng)裝置400可以包含金屬氧化物層402、微孔層404、CMOS裝置層406、以及位于微孔層404和CMOS裝置層406之間的電荷敏感裝置408.1和408.2。金屬氧化物層402可以位于微孔層404的頂部，微孔層404依次可以位于CMOS裝置層406的頂部。電荷敏感裝置408.1和408.2均可以表示chemFET的頂部部分。例如，電荷敏感裝置408.1和408.2可以為chemFET的鈍化層(例如圖1所示的鈍化層116)，而chemFET的浮動?xùn)沤Y(jié)構(gòu)可以位于電荷敏感裝置408.1和408.2的下方(圖中未示出)。在一個實施方案中，微孔層404可以為塑料層(例如Cytop、TEFLON、Paryiene等)。此外，在一個實施方案中，電荷敏感裝置408.1和408.2均可以包含兩個或多個金屬氧化物層。例如，電荷敏感裝置408.1和408.2均可以包含五氧化二鉭(Ta₂O₅)的頂層和氧化鋁(Al₂O₃)的底層。金屬氧化物層402可以包含Ta₂O₅、二氧化鉿(HfO₂)、氧化鋯(ZrO₂)或Al₂O₃中的一層或多層。CMOS裝置層可以為半導(dǎo)體材料(例如Si)層。

圖4B示出了具有一對微孔410的化學(xué)感應(yīng)裝置400的截面圖。可以在金屬氧化物層402和微孔層404上蝕刻微孔410。在一個實施方案中，可以蝕刻微孔410從而暴露電荷敏感裝置408.1和408.2的頂部。例如，可以通過各向異性蝕刻來蝕刻微孔410。圖4C示出了在將化學(xué)品施加到化學(xué)感應(yīng)裝置400上之后的化學(xué)感應(yīng)裝置400的截面圖。由于塑料側(cè)壁的惰性，所施加的化學(xué)品，如波浪線412所示，可以僅涂敷在微孔的底部。在一個實施方案中，塑料側(cè)壁由于惰性而可以具有零緩沖作用。在一個實施方案中，化學(xué)品可以為磷酸酯、膦酸酯或硅烷。

圖5示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造圖4C所示的孔結(jié)構(gòu)的過程500。在方塊502中，過程500可以在CMOS裝置層的頂部上形成塑料層。如圖4A中所示，可以在CMOS裝置層406的頂部上形成塑料層404。接著，在方塊504中，過程500可以在塑料層的頂部上形成金屬氧化物的層。例如，在圖4A中，可以在塑料層404的頂部上形成金屬氧化物層402。接著，過程500可以進行到方塊506。在方塊506中，可以在位于CMOS裝置層的頂部上的塑料層上形成微孔。如上文所述，就圖4B而言，可以通過各向異性塑料蝕刻在塑料層上進行蝕刻。在方塊508中，可以施加化學(xué)品。例如，由于塑料側(cè)壁的惰性，化學(xué)品(例如波浪線412)可以僅與微孔的底部結(jié)合。

圖6A-6F示出了根據(jù)本教導(dǎo)的另一個實施方案制造孔結(jié)構(gòu)的不同階段的截面圖。圖6A示出了在形成微孔之前部分化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖。該化學(xué)感應(yīng)裝置600可以包含金屬氧化物層602、微孔層604、CMOS裝置層606以及位于微孔層604和CMOS裝置層606之間的電荷敏感裝置608.1和608.2。金屬氧化物層602可以位于微孔層604的頂部，微孔層604依次可以位于CMOS裝置層606的頂部。電荷敏感裝置608.1和608.2均可以表示chemFET的頂部部分。例如，電荷敏感裝置608.1和608.2可以為chemFET的鈍化層(例如圖1所示的鈍化層116)，而chemFET的浮動?xùn)沤Y(jié)構(gòu)可以位于電荷敏感裝置608.1和608.2的下方(圖中未示出)。在一個實施方案中，微孔層604可以為二氧化硅層(SiO₂)。此外，在一個實施方案中，電荷敏感裝置608.1和608.2均可以包含兩個或多個金屬氧化物層。例如，電荷敏感裝置608.1和608.2均可以包含Ta₂O³/₄的頂層和Al₂O₃的底層。金屬氧化物層602可以包含Ta₂O₅、HfO₂、ZrO₂或Al₂O₃中的一層或多層。CMOS裝置層606可以為半導(dǎo)體材料(例如Si)層。

圖6B示出了具有所形成的一對微孔610的化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖。可以在金屬氧化物層602和微孔層604的上部上蝕刻微孔610的開口。如圖6B所示，在金屬氧化物層602的開口邊緣之下，可以蝕刻微孔層604的上部，從而創(chuàng)建底切?？梢酝ㄟ^各向同性SiO₂蝕刻來創(chuàng)建底切。圖6C示出了具有所形成的一對微孔610的化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖。在一個實施方案中，可以蝕刻微孔610從而暴露電荷敏感裝置608.1和608.2的頂部?？梢酝ㄟ^各向異性SiO₂蝕刻來創(chuàng)建微孔610。圖6D示出了在施加化學(xué)品之后的化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖?？梢酝糠笏┘拥幕瘜W(xué)品，如波浪線612所示，從而覆蓋微孔610的側(cè)壁和底部。在一個實施方案中，化學(xué)品可以為硅烷基團。

圖6E示出了具有一對微孔610的底部的化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖，其中所述的微孔610的底部清潔了所施加的化學(xué)品。在一個實施方案中，可以蝕刻微孔610從而清潔所施加的化學(xué)品并暴露電荷敏感裝置608.1和608.2的頂部?？梢酝ㄟ^定向蝕刻、反應(yīng)性離子蝕刻、犧牲層蝕刻或這些蝕刻技術(shù)的組合來清潔微孔610的底部。如果使用犧牲層蝕刻，則可以在施加化學(xué)品之前在電荷敏感裝置608.1和608.2的金屬氧化物感應(yīng)層的頂部上創(chuàng)建犧牲層。在施加化學(xué)品之后，可以蝕刻犧牲層從而剝離微孔610的底部上的化學(xué)品，從而暴露電荷敏感裝置608.1和608.2的金屬氧化物感應(yīng)層。在另一個實施方案中，可以通過其他手段(例如覆蓋或化學(xué)方式提供的失活)來使化學(xué)品失去活性。

圖6F示出了在施加另一種化學(xué)品之后的化學(xué)感應(yīng)裝置600的截面圖?？梢酝糠笃渌┘拥幕瘜W(xué)品(其可以稱為第一化學(xué)品并以醒目的波浪線614所示)，從而覆蓋微孔610的底部。在一個實施方案中，其他化學(xué)品可以為一種或多種化學(xué)品，其選自：磷酸酯、膦酸酯、兒茶酚、硝基兒茶酚、硼酸酯、苯基硼酸酯、咪唑、硅烷醇或其他pH感應(yīng)基團。其他化學(xué)品可以為正電荷的，從而幫助珠的承載并幫助由化學(xué)反應(yīng)所導(dǎo)致的電荷的積累。

在一個實施方案中，其他化學(xué)品可以缺乏。即，化學(xué)感應(yīng)裝置600可以具有使用一種化學(xué)品涂敷的微孔610的側(cè)壁，并且可以使微孔610的底部暴露。通過使用一種化學(xué)品僅涂敷側(cè)壁，由側(cè)壁對電荷產(chǎn)生的緩沖可以被減弱或消除，并且可以改善SNR。

圖7示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案制造圖6F所示的孔結(jié)構(gòu)的過程。在方塊702中，可以在位于二氧化硅(SiO₂)層的頂部上的金屬氧化物層上形成微孔的開口，并且SiO₂層可以位于CMOS裝置層的頂部。接著在方塊704中，可以在位于微孔開口的邊緣之下的SiO₂層上形成環(huán)狀底切。如圖6B所示，可以在金屬氧化物層602和微孔層606上形成開口和位于微孔610的開口的周圍的底切。如上文所述，就圖6B而言，可以通過各向同性SiO₂蝕刻來創(chuàng)建底切。在方塊706中，可以在位于CMOS裝置層的頂部上的SiO₂層上形成微孔。例如，可以使用各向異性SiO₂蝕刻來蝕刻微孔。在方塊708中，可以對微孔施加化學(xué)品?？梢詫⒒瘜W(xué)品與微孔的側(cè)壁和底部結(jié)合，并覆蓋微孔的側(cè)壁和底部。在方塊710中，可以使微孔底部的化學(xué)品失去活性。例如，化學(xué)品可以被除去(例如通過定向蝕刻、反應(yīng)性蝕刻、犧牲層蝕刻或它們的組合)、通過化學(xué)品失活、或者被覆蓋。在方塊712中，可以將另一種化學(xué)品施加到微孔上。其他的化學(xué)品可以與微孔的底部結(jié)合，并有利于離子的結(jié)合。

圖8示出了根據(jù)本教導(dǎo)的另一個實施方案的孔結(jié)構(gòu)。圖8的孔結(jié)構(gòu)可以包含金屬氧化物層802、微孔層804、CMOS裝置層806、以及化學(xué)敏感裝置808.1或808.2。金屬氧化物層802可以位于微孔層804的頂部，微孔層804依次可以位于CMOS裝置層806的頂部。在微孔810中，電荷敏感裝置808.1或808.2可以被暴露。微孔810的側(cè)壁以及底部的外周邊緣816可以被第二化學(xué)品812(非醒目的波浪線)覆蓋。外周邊緣816可以為位于電荷敏感裝置818.1和808.2的周圍的微孔810的底部的一部分?；瘜W(xué)感應(yīng)裝置808.1和808.2的頂部表面可以被第一化學(xué)品814(醒目的波浪線)覆蓋。在一個實施方案中，如圖8所示，微孔810均可以具有倒錐形。即，微孔810的底部可以具有比微孔810的頂部更大的直徑，因此側(cè)壁可以為倒傾斜的。在一個實施方案中，金屬氧化物層802可以包含Ta₂O₅、HfO₂、ZrO₂或Al₂O₃中的一層或多層；微孔層806可以為SiO₂層；并且CMOS裝置層806可以為半導(dǎo)體材料(例如Si)層。可以使用定向蝕刻、反應(yīng)性離子蝕刻、犧牲層蝕刻或它們的組合來蝕刻微孔810。

圖9A-9E示出了根據(jù)本教導(dǎo)的另一個實施方案制造孔結(jié)構(gòu)的不同階段的截面圖。圖9A示出了在形成任意的微孔之前化學(xué)感應(yīng)裝置900的一部分的截面圖。化學(xué)感應(yīng)裝置900可以包含位于CMOS裝置層904頂部上的微孔層902，以及嵌入在微孔層902和CMOS裝置層904之間的電荷敏感裝置906。嵌入裝置906可以表示chemFET的頂部。例如，嵌入裝置906可以為chemFET的鈍化層(例如圖1所示的鈍化層116)，chemFET的浮動?xùn)沤Y(jié)構(gòu)可以位于裝置906的下方(圖中未示出)。在一個實施方案中，微孔層902可以為SiO₂層。此外，在一個實施方案中，裝置906可以包含金屬氧化物的一層或多層。例如，裝置906可以包含Ta₂O₅的頂層和Al₂O₃的底層。CMOS裝置層可以為半導(dǎo)體材料(例如Si)層。

圖9B示出了具有微孔908的化學(xué)感應(yīng)裝置900的截面圖。可以在微孔層902上蝕刻微孔908。在一個實施方案中，可以蝕刻微孔908從而暴露裝置906的頂部?？梢酝ㄟ^各向異性SiO₂蝕刻來蝕刻微孔908。圖9C示出了在施加化學(xué)品之后的化學(xué)感應(yīng)裝置900的截面圖。由于電荷敏感裝置906的表面的化學(xué)性質(zhì)，僅在微孔908的底部涂敷所施加的化學(xué)品，如醒目的波浪線910所示。例如，電荷敏感裝置906的表面對膦酸酯、膦酸酯或硅烷基團可以具有選擇性親和性。在一個實施方案中，化學(xué)品可以為磷酸酯、膦酸酯、兒茶酚、硝基兒茶酚、硼酸酯、苯基硼酸酯、咪唑、硅烷醇或其他pH感應(yīng)基團。

圖9D示出了在微孔908的側(cè)壁和頂部水平部分916(本文中也稱為“頂部邊緣”或“與側(cè)壁的頂部邊緣最接近的水平表面”)被金屬氧化物層912覆蓋后的化學(xué)感應(yīng)裝置900的截面圖。在一個實施方案中，金屬氧化物層912可以為單分子層。例如，單分子層可以為金屬氧化物，其是通過孔壁的氧化物(例如二氧化硅)與鋯的醇鹽間進行化學(xué)選擇性反應(yīng)、然后通過反應(yīng)后水解而形成的。即，金屬氧化物層912可以為ZrO₂基于溶劑進行沉積而形成的層。根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案，由于金屬氧化物層912和化學(xué)品910之間缺乏親和性，所以金屬氧化物層912并非沿著孔的底部設(shè)置，如圖9D所示。事實上，化學(xué)品910可以起到“面具”或者保護性/阻擋層的作用，從而防止金屬氧化物層912沿著微孔的底部設(shè)置。圖9E示出了在施加另一種化學(xué)品之后的化學(xué)感應(yīng)裝置900的截面圖。由于金屬氧化物層912的表面的化學(xué)性質(zhì)，可以在微孔908的側(cè)壁和頂部水平部分上涂敷其他化學(xué)品，如非醒目的波浪線914所示。在一個實施方案中，其他化學(xué)品可以為PEG磷酸酯或膦酸酯。為了與之前的實施方案保持一致，在微孔908的底部涂敷的化學(xué)品可以被稱為第一化學(xué)品，而在側(cè)壁上涂敷的化學(xué)品可以被稱為第二化學(xué)品。

在微孔908的側(cè)壁上的中性PEG表面可以減弱或消除質(zhì)子在側(cè)壁上的緩沖作用。此外，在微孔的底部上涂敷的磷酸酯或膦酸酯可以給與正電荷，從而改善珠的承載或DNA引物，由此進一步促進測序的信噪比(SNR)。

圖10示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案來制造圖9E所示的孔結(jié)構(gòu)的過程1000。在方塊1002中，可以在位于CMOS裝置的頂部上的二氧化硅(SiO₂)層中形成微孔。如圖9B所示，可以在SiO₂層902中形成微孔908。接著在方塊1004中，可以施加化學(xué)品從而選擇性地附著在微孔的底部。例如，第一化學(xué)品可以施加，并選擇性地附著在微孔908中電荷敏感裝置906的頂表面上。在方塊1006中，可以在微孔的側(cè)壁和頂部水平部分上形成金屬氧化物層。如上文所述，就圖9D而言，可以在微孔908的側(cè)壁和頂部水平部分上創(chuàng)建ZrO₂單分子層的基于溶劑的沉積。在方塊1008中，可以施加第二化學(xué)品，從而選擇性地附著在微孔的側(cè)壁和頂部水平部分上。例如，由于其他化學(xué)品和金屬氧化物層912的化學(xué)性質(zhì)，第二化學(xué)品(例如圖9E的非醒目波浪線914)可以在側(cè)壁和頂部水平部分上僅與微孔的金屬氧化物層912結(jié)合。

在一個實施方案中，可以在金屬層上制備微孔，其中所述的金屬被放置在CMOS裝置層的頂部。即，例如，微孔層902可以為金屬層，例如Al、Cu或Ti。在這種實施方案中，可以通過第一化學(xué)品涂敷微孔的底部，或者可以通過第二化學(xué)品、或者第一和第二化學(xué)品來涂敷微孔的側(cè)壁。此外，在這種實施方案中，可以通過金屬氧化物層覆蓋微孔的頂部邊緣，其中所述的金屬氧化物層例如為五氧化二鉭(Ta₂O₅)、氧化鋁(Al₂O₃)、二氧化鉿(HfO₂)或氧化鋯(ZrO₂)中的一層或多層。金屬微孔的制造可以使用大馬士革或雙大馬士革過程。例如，使用平板印刷來制備負柱圖案(negative pillar pattern)、沉積種子層、實施金屬電鍍、拋光金屬、然后蝕刻負柱圖案從而形成金屬微孔。例如參見Ohmori，et al.，Japanese Journal of Applied Physics 49 05FD01：1-4(2010)，該文獻的內(nèi)容以引用方式并入本文。

在一個實施方案中，用于第二化學(xué)品的硅烷基團可以為R-[(CH₂)_n]-Si-[X₁X₂X₃]，其中R為有機官能團，[(CH₂)_n]為烴連接體(n＝1至20)，Si為硅原子，并且[X₁X₂X₃]包含一種或多種獨立的可水解基團，包括烷氧基或鹵素基團。在另一種實施方案中，用于第二化學(xué)品的硅烷基團可以為R-[(C₂H₄O)_n]-Si-[X₁X₂X₃]，其中R為有機官能團，[(C₂H₄O)_n](n＝1至100)為聚醚連接體，Si為硅原子，并且[X₁X₂X₃]包含一種或多種可水解基團，包括烷氧基或鹵素基團。在任一種實施方案中，有機官能團R包括但不限于甲基、亞甲基、苯基、芐基、苯胺、氨基、酰胺、羥基、醛、烷氧基、鹵素、巰基、羧基、?；?、乙烯基、烯丙基、苯乙烯基、環(huán)氧基、異氰?；?、環(huán)氧丙氧基和丙烯酰氧基。

用于第二化學(xué)品的硅烷基團的實例可以包括：

N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷，

(巰基甲基)甲基二乙氧基硅烷，

氯代甲基三乙氧基硅烷，

(異氰?；谆?甲基二甲氧基硅烷，

N-苯基氨基甲基三乙氧基硅烷，

三乙氧基甲硅烷基十一醛，

11-巰基十一烷基三甲氧基硅烷，

10-十一碳烯基三甲氧基硅烷，

N-(2-氨基乙基)-11-氨基十一烷基三甲氧基硅烷，

11-溴代十一烷基三甲氧基硅烷，

n-辛基三乙氧基硅烷，

2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷，

3-甲氧基丙基三甲氧基硅烷，

甲氧基三乙烯氧基丙基三硅烷，

甲氧基硅烷，

甲氧基乙氧基十一烷基三氯硅烷，

2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]-三氯硅烷。

圖11示出了根據(jù)本教導(dǎo)的實施方案的化學(xué)感應(yīng)過程1100。在方塊1102中，多種分析物附著于其上的固相負載體可以沉積到微孔中。例如，多種分析物可以附著在固相負載體112上，并且固相負載體112可以沉積到微孔101中。微孔可以具有底表面和側(cè)壁。在一個實施方案中，底表面可以被有利于pH感應(yīng)的第一化學(xué)品覆蓋，并且側(cè)壁可以被能夠減弱溶液中的質(zhì)子的緩沖作用的第二化學(xué)品覆蓋。在方塊1104中，可以感應(yīng)在微孔的底表面上的電荷。如上文所述，就等式(1)和(2)而言，所述的電荷可以是由于至少一種化學(xué)品與多種分析物的反應(yīng)所產(chǎn)生的一種或多種副產(chǎn)物。在一個實施方案中，化學(xué)感應(yīng)過程1100可以為DNA序列感應(yīng)過程。即，多種分析物的每一種均可以為樣品DNA片段。可以通過隨后將不同的試劑提供給微孔101并檢測化學(xué)反應(yīng)的副產(chǎn)物來測定DNA序列。

本發(fā)明的多個實施方案將具體說明并在本文中進行描述。但是，應(yīng)該理解的是本發(fā)明的修改和變體都由上述的教導(dǎo)所涵蓋。在其他實例中，為了不使所述的實施方案模糊不清，還尚未描述公知的操作、成分和線路?？梢岳斫獾氖潜疚乃_的具體的結(jié)構(gòu)和功能的詳情可以是代表性的，并且不必限定本發(fā)明的范圍。例如，使用CMOS技術(shù)來描述一些實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是CMOS裝置可以用于指單純的PMOS裝置或單純的NMOS裝置、或者是PMOS與NMOS裝置的組合。

由之前的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是可以以多種形式來實施本發(fā)明，并且多個實施方案可以單獨或組合實施。因此，盡管將本發(fā)明的實施方案與其具體的實例相關(guān)聯(lián)來進行描述，但是由于通過對附圖、說明書和所述的權(quán)利要求進行研究，其他的修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，所以本發(fā)明的實施方案和/或方法的真實范圍不應(yīng)該被如此限定。

可以使用硬件元件、軟件元件或它們的組合來實施多種實施方案。硬件元件的實例可以包括處理器、微處理器、線路元件(例如晶體管、電阻器、電容器、感應(yīng)體等)、集成電路、特殊應(yīng)用集成電路(ASIC)、可編程邏輯裝置(PLD)、數(shù)字信號處理器(DSP)、現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)、邏輯門、記錄器、半導(dǎo)體裝置、芯片、微芯片、芯片組等。軟件的實例可以包括軟件要素、程序(program)、應(yīng)用、計算機程序、應(yīng)用程序、系統(tǒng)程序、機器程序、操作系統(tǒng)軟件、中間件、穩(wěn)件、軟件模塊、程序(routine)、子程序、功能、方法、程序(procedure)、軟件界面、應(yīng)用程序界面(API)、指令組、計算編碼、計算機編碼、碼段、計算機碼段、命令、評價、符號、或它們的任意的組合。確定實施方案是使用硬件元件和/或軟件元件來實施可以根據(jù)多種因素來改變，例如所需的計算速率、功率水平、熱的耐受性、處理循環(huán)的預(yù)算、輸入數(shù)據(jù)的速率、輸出數(shù)據(jù)的速率、存儲資源、數(shù)據(jù)總線速度以及其他設(shè)計或?qū)嵤┑南薅ā?/p>

例如，可以使用計算機可讀的介質(zhì)或制品來實施一些實施方案，所述的介質(zhì)或制品可以存儲指令或指令組，如果這些指令或指令組是通過機器來執(zhí)行，則其可以使機器根據(jù)實施方案來實施方法和/或操作。此類機器可以包括例如任何合適的處理平臺、計算平臺、計算裝置、處理裝置、計算系統(tǒng)、處理系統(tǒng)、計算機、處理器等，并且可以使用硬件和/或軟件的任何合適的組合來實施。計算機可讀介質(zhì)或制品可以包括例如任何合適類型的記憶單元、記憶裝置、記憶制品、記憶介質(zhì)、存儲裝置、存儲制品、存儲介質(zhì)和/或存儲單元，例如存儲器、可移動或不可移動的介質(zhì)、可消除或不可消除的介質(zhì)、可寫或可重寫的介質(zhì)、數(shù)字或模擬介質(zhì)、硬盤、軟盤、光盤只讀存儲器(CD-ROM)、光盤刻錄機(CD-R)、可擦寫光盤(CD-RW)、光盤、磁性介質(zhì)、磁光介質(zhì)、可移動存儲卡或盤、多種類型的數(shù)字影碟(DVD)、磁帶、錄音帶等。指令可以包括任何合適類型的編碼，例如源代碼、編譯碼、直譯碼、可執(zhí)行碼、靜態(tài)碼、動態(tài)碼、加密碼等，其是使用任何合適的高水平、低水平、面向?qū)ο蟮?、可視的、編譯的和/或直譯的編程語言來實施的。

“擴增子”是指多核苷酸擴增反應(yīng)的產(chǎn)物。即，多核苷酸的克隆群體，其中所述的多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的，所述的多核苷酸的克隆群體可以由一個或多個起始序列復(fù)制得到。一個或多個起始序列可以為同一序列的一個或多個拷貝，或者它們可以為不同序列的混合物，其中所述的不同序列包含被擴增的共同的區(qū)域，例如存在于由樣品提取得到的DNA片段混合物中的特定的外顯子序列。通過擴增單一的起始序列來形成擴增子。擴征字可以通過多個擴增反應(yīng)來生產(chǎn)，該反應(yīng)的產(chǎn)物包含一種或多種起始或目標(biāo)核酸的復(fù)制品。在一個方面中，生產(chǎn)擴增子的擴增反應(yīng)是“模板驅(qū)動的”，這是因為試劑(核苷酸或寡核苷酸)的堿基配對在模板多核苷酸中得到補充，其中需要所述的模板來用于創(chuàng)建反應(yīng)產(chǎn)物。在一個方面中，模板驅(qū)動的反應(yīng)為使用核酸聚合酶來延伸引物或者使用核酸連接酶來連接寡核苷酸。此類反應(yīng)包括但不限于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、線性聚合酶反應(yīng)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增等，它們在以下參考文獻中公開并且這些文獻以引用方式并入本文：Mullis et al.，美國專利No.4,683,195，4.965,188，4,683,202和4,800,159(PCR)；Gelfand et al.，美國專利No.5,210,015(使用“taqman”探針的實時PCR)；Wittwer et aL，美國專利No.6,174,670；Kacian et al.，美國專利No.5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美國專利No.5,854,033；Aono et al.，日本專利公開JP 4-262799(滾環(huán)擴增)等。在一個方面中，通過PCR生產(chǎn)擴增子。如本文所用，術(shù)語“擴增”是指實施擴增反應(yīng)?！胺磻?yīng)混合物”是指包含所有用于實施反應(yīng)所必須的試劑的溶液，其可以包含但不限于在反應(yīng)過程中將pH保持在所選的水平下的緩沖劑、鹽、輔助因子、清除試劑等?！肮滔鄶U增子”是指附著有核酸序列的克隆群體的固相負載體，例如粒子或珠，其可以通過諸如乳化PCR技術(shù)之類的過程來生產(chǎn)。

“分析物”是指所關(guān)注的分子或生物細胞，其在樣品保持區(qū)域(例如微孔)直接影響電傳感器，或者通過由反應(yīng)所得的副產(chǎn)物而間接影響所述的電傳感器，其中所述的反應(yīng)與定位于所述的樣品保持區(qū)域或反應(yīng)限制區(qū)域(例如微孔)中所述的分子或生物細胞有關(guān)。在一個方面中，分析物為經(jīng)歷測序反應(yīng)的核酸分子模板，其中所述的測序反應(yīng)依次會產(chǎn)生反應(yīng)副產(chǎn)物，例如氫離子，這些副產(chǎn)物會影響電傳感器。此外，術(shù)語“分析物”還考慮了附著于固體負載體(例如珠或粒子)的分析物(例如蛋白質(zhì)、肽、核酸等)的多個拷貝。在一個實施方案中，術(shù)語“分析物”是指核酸擴增子或固相擴增子。

“微流體裝置”是指一個或多個室、端口和通道的整合系統(tǒng)，其中所述的室、端口和通道是相互連接并且是流體相同的，而且被設(shè)計用于單獨或與器械或儀器相協(xié)作地實施分析反應(yīng)或過程，其中所述器械或儀器提供了支持功能，例如樣品的引入、流體和/或試劑驅(qū)動手段、溫度控制、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)收集和/或整合系統(tǒng)等。微流體裝置可以進一步包括閥、泵和位于內(nèi)壁上的專門的功能性涂層，從而(例如)樣品成分或試劑被吸附，有利于試劑通過電滲透進行移動等。此類裝置通常在固體基材或作為固體基材制造，這些固體基材可以為玻璃、塑料或其他固體聚合物材料，并且通常具有特別是通過光或電化學(xué)方法來檢測和監(jiān)測樣品和試劑移動的平坦格式。微流體裝置的特征通常具有小于兒百平方微米的橫截面維度，并且通路通常具有毛細管維度，例如最大橫截面維度為大約0.1μm至大約500μm。微流體裝置通常具有兒nL(例如10-100nL)至1μL的體積容量。微流體裝置的制造和操作是本領(lǐng)域公知的，其通過以下參考文獻舉例，并且這些文獻以引用方式并入本文：Ramsey，美國專利No.6,001,229，5,858,195，6,010,607和6,033,546；Soane et al.，美國專利No.5,126,022和6,054,034；Nelson et al.，美國專利6,613,525；Maher et al，美國專利No.6,399,952；Ricco et al，國際專利公開WO 02/24322；Biornson et al，國際專利公開WO 99/19717；Wilding et al.，美國專利No.5,587,128；5,498,392；Ssa et al，Electrophoresis，24：3563-3576(2003)；Unger et al，Science，288：113-116(2000)；Enzelberger et al.，美國專利No.6,960,437。

“微孔”與“反應(yīng)室”交換使用，其是指“反應(yīng)限制區(qū)域”的特殊情況，即，允許所關(guān)注的反應(yīng)進行定位的固體基材的特性。反應(yīng)限制區(qū)域可以為與所關(guān)注的分析物特異性結(jié)合的基材表面的分離的區(qū)域，例如具有與所述的表面共價連接的寡核苷酸或抗體的分離的區(qū)域。通常反應(yīng)限制區(qū)域是具有良好限定的形狀和體積的洞或孔，這些洞或孔被制造成基材?？走@種類型的反應(yīng)限制區(qū)域在本文中被稱為微孔或反應(yīng)室，并且可以使用傳統(tǒng)的微細加工技術(shù)制造，其中所述的技術(shù)在以下參考文獻中公開：Doering and Nishi，Editors，Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology，Second Edition (CRC Press，2007)；Saliterman，F(xiàn)undamentals of BioMEMS and Medical Microdevices (SPIE Publications，2006)；Eiwenspoek et al，Silicon Micromachining(Cambridge University Press，2004)等。微孔或反應(yīng)室的構(gòu)造(例如間距、形狀和體積)在Rothberg et a1.，美國專利公開2009/0127589；Rothberg et al.，U.K.專利申請GB24611127中公開，這些參考文獻以引用方式并入本文。微孔可以具有正方形、長方形或八邊形橫截面，并且在表面上排列為直線陣列。此外，微孔可以具有六邊形橫截面，并且排列為六邊形陣列，這與直線陣列相比，酶單位面積上可允許更高密度的微孔。微孔的示例性構(gòu)造具有10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷個反應(yīng)室。

如本文所用，“陣列”為諸如傳感器或孔之類的原件的平坦排列。陣列可以為一個或兩個維度。一個維度的陣列為原件在第一個維度上具有一列(或排)而在第二個維度上具有多列(或排)。在第一個和第二個維度中的列(或排)的數(shù)量可以相同或不同。陣列可以包括(例如)至少100000個室。此外，每個反應(yīng)室具有水平寬度和垂直深度，并且縱橫比例如為大約1∶1或更低。例如，反應(yīng)室之間的節(jié)距不超過大約10微米。簡言之，在一個實施方案中，微孔陣列可以在形成傳感器陣列的半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)之后來制造，其中微孔結(jié)構(gòu)適用于半導(dǎo)體模具上的此類結(jié)構(gòu)。即，可以在模具上形成微孔結(jié)構(gòu)，或者可以分開形成微孔，然后將微孔安裝到模具上。

為了在模具上形成微孔，可以使用多種制造過程。例如，完整的模具可以為使用(例如)負性光刻膠(例如Microchem的SU-8 2015)或正性膠/聚酰亞胺(例如HD Microsystems HD8820)旋轉(zhuǎn)涂敷至所需的微孔高度。在光刻膠層中所需的孔的高度(例如在每個孔一個像素的實例中為大約3-12μm，但是并非限定為一股的情況)可以通過在一個或多個層中通過以預(yù)定的速率(其可以在參考文獻和制造商說明書中找到或者憑經(jīng)驗)旋轉(zhuǎn)合適的光刻膠來取得。(通常與傳感器像素的橫向維度保持一致來選擇良好的高度，公稱為1∶1-1.5∶1縱橫比，高寬或直徑)。備選地，可以使用多層不同的光刻膠，或者可以沉積另一種形式的絕緣體材料。此外，還可以使用多種類型的化學(xué)蒸汽沉積來建立適用于本文的微孔形成的材料層。在一個實施方案中，在四-甲基-原硅酸酯(TEOS)層中形成微孔。本發(fā)明涵蓋包含至少一個二維度陣列反應(yīng)室的機構(gòu)，其中每個反應(yīng)室均與化學(xué)敏感場效晶體管(“chemFET”)偶聯(lián)，并且每個反應(yīng)室的體積均不大于10³pm³(即，1pL)。每個反應(yīng)室的體積不大于0.34pL，不大于0.096pL，或者甚至0.012pL。反應(yīng)室的頂部的橫截面積可以隨意地為0.5²、1、2²、3²、4²、5²、6²、7²、8²、9²或10²平方微米。陣列可以具有至少10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或更多的反應(yīng)室。反應(yīng)室的電容性可以與chemFET偶聯(lián)。

“引物”是指天然或合成的寡核苷酸，其在與多核苷酸模板形成雙螺旋時，能夠起到核酸合成的起點的作用，并且沿著所述的模板由其3’末端延伸，由此形成了延伸的雙螺旋。通常，使用核酸聚合酶，例如DNA或RNA聚合酶來進行引物的延伸。在延伸過程中加入的核苷酸的序列是通過模板多核苷酸的序列來確定的。通常，引物是通過DNA聚合酶延伸的。引物的長度通常為14至40個核苷酸，或者為18至36個核苷酸。引物在多種核酸擴增反應(yīng)中使用，例如線性擴增反應(yīng)使用單引物，或者聚合酶鏈式反應(yīng)使用兩個或多個引物。就具體應(yīng)用而言，用于選擇引物的長度和序列的指導(dǎo)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的，由以下參考文獻所示，并且這些參考文獻以引用方式并入本文：Dieffenbach，editor，PGR Primer：A Laboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring Harbor Press，New York，2003)。