本發(fā)明涉及一種電化學(xué)生物傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)境雌激素是指一類進(jìn)入機(jī)體后，具有干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、運(yùn)輸、結(jié)合、代謝等過(guò)程，激活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而破壞維持機(jī)體穩(wěn)定性和調(diào)控作用的化合物，環(huán)境雌激素種類繁多，包括人工合成化合物及植物天然雌激素，廣泛分布于自然界中。壬基酚便是一種類雙酚類合成雌激素。目前，檢測(cè)壬基酚的方法主要有色譜法、質(zhì)譜法等。此類方法儀器貴重、操作復(fù)雜，化驗(yàn)人員需要專業(yè)培訓(xùn)后才能進(jìn)行檢測(cè)。因此，研發(fā)成本低、檢測(cè)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的壬基酚傳感器具有重要意義。
電化學(xué)生物傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。其中尤以無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器研究較多，其關(guān)鍵的技術(shù)是提高修飾電極對(duì)抗體的固定量和對(duì)測(cè)試底液的信號(hào)響應(yīng)速度和大小。二氧化鈦是應(yīng)用最為廣泛的一種光催化劑材料，同時(shí)由于生物相容性好，也常被用作電極基質(zhì)材料。由于片狀二氧化鈦納米材料能夠暴露更多的高指數(shù)晶面，具有更高的催化活性，二氧化鈦納米片具有比納米粒子更好地應(yīng)用前景，對(duì)于二氧化鈦納米片的研究也備受關(guān)注。但是，二氧化鈦導(dǎo)電性差也限制了由單一二氧化鈦納米材料構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的靈敏度普遍不高，不利于實(shí)際應(yīng)用。在半導(dǎo)體納米材料上修飾或復(fù)合特殊的納米材料，一方面增加了電極比表面積，增強(qiáng)電極導(dǎo)電能力，另一方面二者可以產(chǎn)生協(xié)同催化作用，更大的增強(qiáng)對(duì)過(guò)氧化氫溶液H2O2的催化響應(yīng)速度和電流響應(yīng)信號(hào)大小，大大提高檢測(cè)靈敏度。因此，設(shè)計(jì)、制備高效、穩(wěn)定的二氧化鈦納米片及其修飾物是制備電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵技術(shù)。
二硫化鉬（化學(xué)式為MoS2）納米材料，具有二維層狀結(jié)構(gòu)，是應(yīng)用最廣泛的固體潤(rùn)滑劑之一。其剝離后的片狀二維納米材料，是性能優(yōu)異的半導(dǎo)體納米材料，除了具有大的比表面積，可以作為催化劑和生物抗體的載體，提高負(fù)載量，同時(shí)作為助催化劑也具有優(yōu)良的電子傳遞性能。
目前，大多數(shù)的合成手段都是分開(kāi)合成后，再將催化劑與載體進(jìn)行復(fù)合，過(guò)程繁瑣，產(chǎn)率不高。因此，對(duì)于原位復(fù)合制備具有優(yōu)良電化學(xué)性能的二維納米電極材料具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的科學(xué)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于壬基酚的快速、靈敏檢測(cè)?；诖四康模景l(fā)明首先制備了一種新型二維納米電極材料——摻雜二氧化鈦/二硫化鉬復(fù)合材料Cu-TiO2/MoS2，即銅摻雜二氧化鈦納米方塊原位復(fù)合二硫化鉬的二維納米復(fù)合材料，利用該材料的良好的生物相容性和大的比表面積，負(fù)載上壬基酚抗體，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于銅摻雜二氧化鈦可以催化過(guò)氧化氫原位生成O2，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，再利用抗體與抗原的特異性定量結(jié)合對(duì)電子傳輸能力的影響，使得電流強(qiáng)度相應(yīng)降低，最終實(shí)現(xiàn)了采用無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)方法檢測(cè)壬基酚的生物傳感器的構(gòu)建。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
1. 一種基于摻雜二氧化鈦/二硫化鉬復(fù)合材料的電化學(xué)壬基酚傳感器的制備方法，其特征在于所述的電化學(xué)壬基酚傳感器由工作電極、摻雜二氧化鈦/二硫化鉬復(fù)合材料、壬基酚抗體、牛血清白蛋白組成；所述的摻雜二氧化鈦/二硫化鉬復(fù)合材料為銅摻雜二氧化鈦納米方塊原位復(fù)合二硫化鉬的二維納米復(fù)合材料Cu-TiO2/MoS2；
其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟：
a. 制備Cu-TiO2/MoS2；
b. 制備電化學(xué)壬基酚傳感器；
其中，步驟a制備Cu-TiO2/MoS2的具體步驟為：
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末和0.2 ~ 2.0 mmol銅鹽共同加入到3~10 mL正丁基鋰溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和30 ~ 60 ℃下，攪拌12 ~ 48小時(shí)，得到反應(yīng)后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應(yīng)后的溶液，然后在30 ~ 60 ℃下進(jìn)行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到銅插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取10 ~ 500 mg步驟（2）制得的銅插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢加入0.5 ~ 0.8 mL氫氟酸，然后160~200 ℃下在反應(yīng)釜中反應(yīng)18 ~ 24小時(shí)；
（4）將步驟（3）所得的反應(yīng)產(chǎn)物，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的銅鹽選自下列之一：硫酸銅、氯化銅、硝酸銅、乙酸銅、有機(jī)銅化合物；
所述的非極性溶劑選自下列之一：己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、苯、甲苯；
所述的水浴超聲處理，處理時(shí)間為1小時(shí)；
步驟b制備電化學(xué)壬基酚傳感器的具體步驟為：
（1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12 μL的Cu-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8~12 μL 10 μg/mL的壬基酚抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8~12 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得電化學(xué)壬基酚傳感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4。
2. 本發(fā)明所述的制備方法所制備的電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，包括如下應(yīng)用步驟：
a. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液；
b. 工作電極修飾：將如權(quán)利要求1所述的制備方法所制備的電化學(xué)生物傳感器為工作電極，將步驟a中配制的不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4 ℃ 冰箱中保存；
c. 工作曲線繪制：將飽和甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在電解槽中先后加入15 mL PBS和20 μL 5 mol/L的H2O2；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為I0，含有不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作Ii， 響應(yīng)電流降低的差值為ΔI = I0-Ii，ΔI 與壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C 之間成線性關(guān)系，繪制ΔI －C工作曲線；
d. 壬基酚的檢測(cè)：用待測(cè)樣品代替步驟a中的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟b和c中的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)電信號(hào)強(qiáng)度降低的差值ΔI 和工作曲線，得到待測(cè)樣品中壬基酚的含量。
本發(fā)明的有益成果
（1）本發(fā)明所述的電化學(xué)壬基酚傳感器制備簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的快速、靈敏、高選擇性檢測(cè)，并且成本低，可應(yīng)用于便攜式檢測(cè)，具有市場(chǎng)發(fā)展前景；
（2）本發(fā)明首次采用原位復(fù)合的方法制備了新型二維納米電極材料Cu-TiO2/MoS2，該方法主要有三個(gè)優(yōu)勢(shì)：一是，由于銅在二氧化鈦納米方塊上的原位生長(zhǎng)而充分與二氧化鈦納米方塊接觸，利用銅的金屬表面等離子體作用，有效提高了半導(dǎo)體基質(zhì)電子傳遞能力和催化活性，解決了二氧化鈦納米片雖然比表面積比較大及介孔特性適用于電化學(xué)基質(zhì)材料，但是電化學(xué)活性不高及電流信號(hào)不穩(wěn)定的技術(shù)問(wèn)題；二是，由于二硫化鉬片狀二維納米材料的負(fù)載特性和二氧化鈦納米方塊在其上的充分分散，極大地增大了電子傳遞能力，解決了二氧化鈦納米片導(dǎo)電性差和電流響應(yīng)信號(hào)弱而不利于制備電化學(xué)傳感器的技術(shù)問(wèn)題；三是，由于銅離子在該過(guò)程中既作為插層材料又作為反應(yīng)摻雜材料，最后采用原位復(fù)合的方法實(shí)現(xiàn)了該復(fù)合材料的一鍋制備，不但節(jié)省了時(shí)間、材料損耗，而且使得制備的銅摻雜的二氧化鈦納米方塊能夠更好地均勻分散到二硫化鉬片狀二維納米材料上面。因此，該材料的有效制備，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值；
（3）本發(fā)明首次將Cu-TiO2/MoS2應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的制備中，顯著提高了電流信號(hào)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，大大提高了電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度，使得電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了在實(shí)際工作中的應(yīng)用；該材料的應(yīng)用，也為相關(guān)生物傳感器，如光電化學(xué)傳感器、電致化學(xué)發(fā)光傳感器等提供了技術(shù)參考，具有廣泛的潛在使用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 Cu-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末和0.2 mmol銅鹽共同加入到3mL正丁基鋰溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和60 ℃下，攪拌12小時(shí)，得到反應(yīng)后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應(yīng)后的溶液，然后在60 ℃下進(jìn)行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到銅插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取500 mg步驟（2）制得的銅插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢加入0.5 mL氫氟酸，然后160 ℃下在反應(yīng)釜中反應(yīng)18小時(shí)；
（4）將步驟（3）所得的反應(yīng)產(chǎn)物，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的銅鹽為硫酸銅；
所述的非極性溶劑為己烷；
所述的水浴超聲處理，處理時(shí)間為1小時(shí)。
實(shí)施例2 Cu-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末和1.0 mmol銅鹽共同加入到5 mL正丁基鋰溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和30 ℃下，攪拌24小時(shí)，得到反應(yīng)后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應(yīng)后的溶液，然后在30 ℃下進(jìn)行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到銅插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取200 mg步驟（2）制得的銅插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢加入0.6 mL氫氟酸，然后180 ℃下在反應(yīng)釜中反應(yīng)20小時(shí)；
（4）將步驟（3）所得的反應(yīng)產(chǎn)物，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的銅鹽為氯化銅；
所述的非極性溶劑為四氯化碳；
所述的水浴超聲處理，處理時(shí)間為1小時(shí)。
實(shí)施例3 Cu-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末和2.0 mmol銅鹽共同加入到10 mL正丁基鋰溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和50 ℃下，攪拌48小時(shí)，得到反應(yīng)后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應(yīng)后的溶液，然后在50 ℃下進(jìn)行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到銅插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取10 mg步驟（2）制得的銅插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢加入0.8 mL氫氟酸，然后200 ℃下在反應(yīng)釜中反應(yīng)24小時(shí)；
（4）將步驟（3）所得的反應(yīng)產(chǎn)物，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的銅鹽為乙酸銅；
所述的非極性溶劑為苯；
所述的水浴超聲處理，處理時(shí)間為1小時(shí)。
實(shí)施例4 電化學(xué)壬基酚傳感器的制備方法
（1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8 μL的Cu-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8 μL 10 μg/mL的壬基酚抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得電化學(xué)壬基酚傳感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4。
實(shí)施例5 電化學(xué)壬基酚傳感器的制備方法
（1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂10 μL的Cu-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10 μL 10 μg/mL的壬基酚抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得電化學(xué)壬基酚傳感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4。
實(shí)施例6 電化學(xué)壬基酚傳感器的制備方法
（1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂12 μL的Cu-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂12 μL 10 μg/mL的壬基酚抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂12 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得電化學(xué)壬基酚傳感器；
所述的Cu-TiO2/g-C3N4溶膠為將50 mg 的Cu-TiO2/g-C3N4粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4。
實(shí)施例7 實(shí)施例1~6制備的電化學(xué)壬基酚傳感器，應(yīng)用于壬基酚的檢測(cè)，步驟如下：
（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液；
（2）工作電極修飾：將如權(quán)利要求1所述的制備方法所制備的電化學(xué)壬基酚傳感器為工作電極，將步驟（1）中配制的不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲線繪制：將飽和甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在電解槽中先后加入15 mL PBS和20 μL 5 mol/L的H2O2；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為I0，含有不同濃度的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作Ii，響應(yīng)電流降低的差值為ΔI = I0-Ii，ΔI 與壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C 之間成線性關(guān)系，繪制ΔI －C工作曲線；壬基酚的線性檢測(cè)范圍為：0.009~200 ng/mL，檢出限為：3.0 pg/mL；
（4）壬基酚的檢測(cè)：用待測(cè)樣品代替步驟（1）中的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟（2）和（3）中的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)電信號(hào)強(qiáng)度降低的差值ΔI 和工作曲線，得到待測(cè)樣品中壬基酚的含量。