本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)粒棘球蚴病又稱囊性包蟲病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)的中絳期幼蟲引起的一種人獸共患病，主要寄生在人和家畜等多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)。90％以上的細(xì)粒棘球蚴包囊生長(zhǎng)于宿主的肝臟、肺臟或者同時(shí)生長(zhǎng)于肝肺。細(xì)粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生問題。在一些流行地區(qū)，其感染率可高達(dá)5-10％，死亡率高達(dá)2-4％。據(jù)估計(jì)，全球人囊性棘球蚴病每年至少損失1-3.6百萬傷殘調(diào)整生命年(DALYs)，而動(dòng)物囊性棘球蚴病每年造成的經(jīng)濟(jì)損失至少為20億美元。因此，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)把棘球蚴病列為《被忽視的熱帶疾病》，作為其2008-2015年重點(diǎn)防治計(jì)劃。

缺乏標(biāo)準(zhǔn)有效的特異性重組抗原是細(xì)粒棘球蚴病免疫診斷中的一個(gè)尚未解決的難題。目前，細(xì)粒棘球蚴病免疫診斷的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分復(fù)雜，具有難以大量提純、抗原來源不穩(wěn)定、成本高、診斷特異性低等缺陷。與囊液抗原相比，重組抗原具有特異性好以及來源穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。目前，動(dòng)物細(xì)粒棘球蚴病的重組診斷抗原的報(bào)道還很少，劉紅霞等用細(xì)粒棘球蚴CE18重組蛋白檢測(cè)綿羊細(xì)粒棘球蚴病，發(fā)現(xiàn)其他帶科絳蟲病陽性血清如羊腦多頭蚴病血清和羊細(xì)頸囊尾蚴病血清均存在交叉反應(yīng)，特別是和羊細(xì)頸囊尾蚴病血清的交叉反應(yīng)概率較高，不能準(zhǔn)確診斷綿羊細(xì)粒棘球蚴病。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應(yīng)用，使其能夠能被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識(shí)別，具有良好的免疫原性，并具有較高的特異性和靈敏度，減少與其他帶科絳蟲病陽性血清的交叉反應(yīng)。

二氫葉酸還原酶(DHFR)能催化二氫葉酸生成四氫葉酸，進(jìn)而合成四氫葉酸類輔酶，參與體內(nèi)核酸和氨基酸的合成，在生物體中發(fā)揮重要作用。二氫葉酸還原酶抑制劑能選擇性的與二氫葉酸還原酶結(jié)合，抑制其催化還原活性，使二氫葉酸不能順利轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，阻礙葉酸代謝，干擾DNA和蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，所以二氫葉酸還原酶抑制劑具有抗癌以及抗寄生蟲的作用。

DHFR在原蟲上研究的比較廣泛，如瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲等，但在蠕蟲上并未見相關(guān)研究，因此，本發(fā)明對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶(Eg-DHFR)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過反轉(zhuǎn)錄表達(dá)出rEg-DHFR蛋白，制備出抗rEg-DHFR的多克隆抗體，對(duì)該蛋白進(jìn)行免疫印跡分析表明其可被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識(shí)別，具有良好的免疫原性，利用rEg-DHFR蛋白建立細(xì)粒棘球蚴病間接ELISA診斷方法，為細(xì)粒棘球蚴病的防控提供監(jiān)測(cè)手段。

因此，本發(fā)明提出了細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶在制備檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應(yīng)用。

其中，作為優(yōu)選，所述試劑盒為ELISA檢測(cè)試劑盒或免疫印跡檢測(cè)試劑盒。

同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴病的ELISA檢測(cè)試劑盒，包括細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶(作為抗原進(jìn)行包被)和ELISA檢測(cè)試劑盒常規(guī)組分。所述試劑盒依據(jù)間接ELISA檢測(cè)原理。

作為優(yōu)選，所述ELISA檢測(cè)試劑盒常規(guī)組分包括抗原包被液、酶標(biāo)板、封閉液、HRP標(biāo)記的二抗和TMB底物。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉液為5％脫脂奶粉；所述HRP標(biāo)記的二抗為HRP標(biāo)記的山羊或綿羊抗兔二抗。

在具體的ELISA檢測(cè)過程中，抗原包被的最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.6μg/每孔，血清最佳稀釋濃度為1:320，最佳封閉液和封閉條件是5％脫脂奶粉37℃封閉1h，血清孵育最佳時(shí)間是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳時(shí)間是37℃ 1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000時(shí)，底物顯色的最佳條件是37℃15min。在以上條件下，測(cè)得陰陽性血清的P/N值為3.86。

作為優(yōu)選，所述ELISA檢測(cè)試劑盒常規(guī)組分還包括顯色反應(yīng)終止液H₂SO₄、洗滌液PBST和稀釋液PBS。

本發(fā)明先提取細(xì)粒棘球絳蟲總RNA，而后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，然后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其與GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性達(dá)到100％。最后連接至表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，獲得細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的反轉(zhuǎn)錄重組蛋白rEg-DHFR。

免疫印跡顯示rEg-DHFR能被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識(shí)別，具有良好的免疫原性。間接ELISA結(jié)果顯示，該方法的cut-off值為0.4014，特異性和靈敏度分別為85.7％(12/14)和1:6400，并且與綿羊腦包蟲血清無交叉反應(yīng)。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶在制備檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應(yīng)用，其作為免疫抗原能夠被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識(shí)別，應(yīng)用于間接ELISA檢測(cè)時(shí)，具備較高的特異性和靈敏度，臨床檢測(cè)符合率高達(dá)97.9％。以細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶為免疫抗原建立的檢測(cè)方法具有良好的診斷效果，可以用于疫區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴病的初步篩選。

附圖說明

圖1所示為Eg-DHFR PCR擴(kuò)增凝膠圖；其中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1為空白對(duì)照；2為Eg-DHFR cDNA PCR產(chǎn)物；

圖2所示為rEg-DHFR的western blot凝膠圖；其中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；1為重組菌中rEg-DHFR的表達(dá)；2為純化后的rEg-DHFR；3為兔抗rEg-DHFR-IgG識(shí)別rEg-DHFR；4為健康兔血清識(shí)別rEg-DHFR；5為自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識(shí)別rEg-DHFR；6為健康綿羊血清識(shí)別rEg-DHFR；7為兔抗rEg-DHFR-IgG識(shí)別原頭蚴粗提蛋白；8為健康兔血清識(shí)別原頭蚴粗提蛋白；

圖3所示為間接ELISA對(duì)rEg-DHFR的特異性分析圖；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為山羊抗細(xì)頸囊尾蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴陽性血清、綿羊抗細(xì)粒棘球蚴陽性血清；Cuto-off value表示臨界值；

圖4所示為間接ELISA的臨床試驗(yàn)結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為陽性血清和陰性血清；Cuto-off value表示臨界值。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了細(xì)粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，各試驗(yàn)所涉及的材料和試劑如下：

1、主要試劑

動(dòng)物組織總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，購自GIBCOBRL公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性內(nèi)切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA Agarose，購自Qiagen公司；TaqPCR MasterMix、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，購自Bio-Rad公司，PCR引物合成和測(cè)序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2、菌株和質(zhì)粒載體

宿主菌大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pMD19-T Vector購自TaKaRa公司；pET32a(+)載體由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室提供。

3、常用緩沖溶液和培養(yǎng)基的配制

PBS Buffer①：分別稱取下列試劑于燒杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.42g，KH₂PO₄ 0.27g。加入約500mL滅菌雙蒸水混勻溶解，加入濃HCl使pH達(dá)到7.4，定容到1L。高壓滅菌后室溫保存。

電泳緩沖液(50×TAE Buffer)：稱取242g Tris和37.2g Na₂EDTA·2H₂O于燒杯中，加入500mL滅菌雙蒸水并混勻溶解，加58mL的CH₃COOH再次充分?jǐn)嚢瑁ㄈ莸?L并室溫保存。

EB：將0.1gEB加入100mL的滅菌雙蒸水中，分裝后常溫保存。

LB培養(yǎng)基：液態(tài)培養(yǎng)基：分別稱取Triptone 10g，5g Yeast Extract,10g NaCl加入燒杯中溶于500mL滅菌H₂O中并用燒堿調(diào)節(jié)pH至7.0，定容到1L后高壓滅菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g瓊脂粉，高壓滅菌，4℃保存。

IPTG溶液：電子天平稱取2g的異丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超純水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹铀?0mL，用0.45μm濾膜過濾后用EP管分裝貯存于-20℃。

30％聚丙烯酰胺溶液：稱取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去離子水混勻溶解，加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。

1M Tris-HCl(pH 6.8)：稱取12.11g的Tris于燒杯中，加80mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙?，加濃鹽酸并使用酸度計(jì)調(diào)整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：取19g的Tris于燒杯中，加50mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙?，加濃鹽酸并使用酸度計(jì)調(diào)整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。

10％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液：稱取10g的SDS于燒杯中，加入80mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?00mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。

10％過硫酸銨溶液：稱取0.1g的APS，加水定容到1mL，常溫保存。

考馬斯亮藍(lán)染色液：用電子天平稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)粉末于20mL酒精中，取100mL濃磷酸到200mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。

氨芐西林鈉溶液(AMP)：使用電子天平稱取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超純水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?0mL，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝EP管-20℃保存。

4、試驗(yàn)動(dòng)物

2只健康新西蘭兔，1.4～2.2kg，購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1：細(xì)粒棘球蚴總RNA的提取

細(xì)粒棘球蚴包囊來自于自然感染的綿羊肝臟，樣本采自青海西寧或四川甘孜，保存于液氮中。

取出液氮保存的細(xì)粒棘球蚴，用研缽將其磨碎，隨后參照天根的動(dòng)物組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。

(1)每10-20mg原頭蚴加300μL裂解液，使用研磨棒研磨；

(2)向勻漿液中加入Proteinase K(10μL)和RNase-Free ddH2O(590μL)，混勻后反應(yīng)15min(56℃)。

(3)離心5min(12,000rpm)，將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管子中；在管子中加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱中，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(4)在吸附柱中加去蛋白質(zhì)液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后，棄廢液。

(5)將DNase I工作液(80μL)加入吸附柱，室溫放置反應(yīng)15min；隨后加去蛋白質(zhì)液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(6)500μL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室溫)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(7)重復(fù)(6)。

(8)空離，棄廢液，晾干殘余漂洗液。

(9)把吸附柱放入一個(gè)新的離心管中，用RNase-Free ddH2O(30-100μL)洗脫，靜置2min(室溫)，離心2min(12,000rpm)后得到細(xì)粒棘球蚴總RNA提取液。

實(shí)施例2：第一鏈cDNA的合成

以抽提的細(xì)粒棘球蚴總RNA為模板，以O(shè)ligo dT(18)為反轉(zhuǎn)錄引物，參照Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作：

(1)冰上制備反應(yīng)混合物

Oligo dT₁₈ 1μL

模板RNA 1μL

DEPC ddH₂O 1μL

(2)在70℃(5min)孵育后轉(zhuǎn)到冰上冷卻

(3)在冰上按照順序加入以下反應(yīng)物：

5reaction buffer 4μL

核糖核酸酶抑制劑 1μL

10dNTP混合物 2μL

(4)37℃(5min)孵育后加RevertAid^TM反轉(zhuǎn)錄酶1μL。

(5)PCR程序：42℃，1h；70℃，10min。

(6)得到的cDNA于-80℃保存。

實(shí)施例3：Eg-DHFR基因的擴(kuò)增

根據(jù)GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：

上游：5’-CGCGGATCCATGGGGCTGAAGCGTCT-3’下劃線為BamH I

下游：5’-CCGCTCGAGATGATCATTAAGGGGATGCG-3’下劃線Xho I

擴(kuò)增體系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCR Mixture12.5μL，滅菌雙蒸水9.5μL。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃5min；38個(gè)循環(huán)(變性：95℃，40s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，45s)；最后延伸：72℃，10min。

以細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的cDNA為模板擴(kuò)增出一條576bp左右的條帶(圖1)。

實(shí)施例4：PCR產(chǎn)物的回收

將含有目的條帶的凝膠切下，放入EP管中，稱重。采用凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。每100mg凝膠加入400μLPC Buffer后，55℃水浴溶膠。待凝膠完全溶解后，移入吸附柱中，離心60 sec(12000rpm)，隨后加入Washing Buffer洗滌離心2次后，空離心2min(12000rpm)。晾干吸附柱內(nèi)乙醇?xì)馕?，向吸附柱中加?0μL Elution Buffer，離心2min(12000rpm)，得到目的DNA片段。

實(shí)施例5：Eg-DHFR基因克隆測(cè)序和比對(duì)

(1)將下列試劑混合：4μL的Solution 1，3.5μL的模板DNA，0.5μL的pMD19-T vector，放入離心機(jī)瞬離后放于16℃恒溫水連接過夜。

(2)從-70℃出感受態(tài)細(xì)胞，室溫融化后取30μL放入空EP管中，將連接過夜的8μL產(chǎn)物加入EP管并用微量加樣槍輕輕吹打混勻，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42℃水浴90s立即冰浴5min。每個(gè)EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培養(yǎng)1.5h。將混勻的溶液倒在到LB平板上，37℃冷卻1h使表面干燥，反倒平板過夜。

(3)挑取菌落到空EP管中，加入1mL LB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震蕩培養(yǎng)6h至其渾濁。吸取1μL菌液擴(kuò)增并將產(chǎn)物跑電泳后觀察。選取電泳觀察陽性的菌液送至英濰捷基公司進(jìn)行測(cè)序。

把測(cè)序得到的目的片段序列放入GeneDB數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，經(jīng)測(cè)序得到的序列與GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性達(dá)到100％。

實(shí)施例6：Eg-DHFR基因克隆、鑒定及轉(zhuǎn)化

1、質(zhì)粒提取

測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確后，將菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，參照天根生化有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒操作說明進(jìn)行：

(1)取3-5mL菌液，離心收集沉淀；

(2)加入懸浮液P1懸浮菌體，并加入裂解液P2對(duì)菌液進(jìn)行裂解；

(3)加入P3產(chǎn)生沉淀，翻轉(zhuǎn)混合，靜置10min后離心15min(12,000rpm)；

(4)取上清至收集管中，加600μL漂洗溶液PW，靜置2min，離心1min(12,000rpm)，棄廢液；

(5)重復(fù)(4)；

(6)晾干漂洗液后用90μL洗脫液回收質(zhì)粒。

2、質(zhì)粒酶切回收

將提取的pMD19-T-Eg-DHFR用Takara BamH I和Xho I快切酶雙酶切，37℃酶切12min，體系總體積為10μL：T克隆質(zhì)粒8μL，10X QuickCut Green Buffer 1μL，QuickBamH I和Xho I 0.5μL。用微量加樣槍混勻后瞬離，37℃恒溫水浴15min后迅速取出點(diǎn)樣進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

3、目的片段連接表達(dá)載體

將雙酶切的Eg-DHFR目的片段和pET28a(+)載體22℃連接1.5h，隨后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h。挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行PCR鑒定。

4、pET28a-Eg-DHFR重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，方法參照“2、質(zhì)粒酶切回收”。

實(shí)施例7：重組Eg-DHFR在大腸桿菌中的表達(dá)

1、重組蛋白的表達(dá)

(1)將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)-DHFR轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌。

(2)將表達(dá)菌接種于兩瓶含100mL的新鮮的LB(含AMP 100μg/mL)培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)3h(160r/min)，至菌液OD590為0.6后加入誘導(dǎo)劑IPTG(1mmol/L)，37℃誘導(dǎo)5h(160r/min)，另一瓶不加IPTG做對(duì)照培養(yǎng)。

(3)分別取有到過后的菌液1.5mL于兩個(gè)新EP管中，4℃離心1min(12,000r/min)收集菌體，分別加入10μL 5×SDS上樣Buffer和40μL PBS溶液，充分混勻。

(4)沸水煮10min，以使菌體充分破裂，4℃離心10min(12,000r/min)，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

(5)用考馬斯亮藍(lán)染色1h，脫色后觀察表達(dá)情況。

2、重組蛋白的可溶性分析

將含有重組質(zhì)粒Pet28a-Eg-DHFR的表達(dá)菌接種于500mL含氨芐的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)(170rpm)至OD600＝0.6左右，加入最佳IPTG濃度，誘導(dǎo)6h。把菌液離心10min(8000rpm)，棄上清，沉淀用裂解液(20mM Tris-Cl,pH8.0)懸浮，超聲破碎菌體。將破碎后的菌體裂解液在4℃條件下離心10min(12,000rpm)，分離沉淀與上清；沉淀加入適量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分別加10μL 5×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10min，離心10min(12,000rpm)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析rEg-DHFR是否為可溶性表達(dá)。

3、SDS-PAGE電泳檢測(cè)

按蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad)說明書，組裝電泳槽。配制12％的分離膠和5％的濃縮膠；把凝膠垂直置于電泳緩沖液中，將樣本和蛋白質(zhì)Marker加入樣品孔中；調(diào)節(jié)恒壓為80V，20min；隨后調(diào)整電壓為200V。電泳完畢后取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色1h，沸水浴脫色15min，最后在凝膠成像系統(tǒng)中照相觀察。

4、重組蛋白的純化

根據(jù)上述步驟對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大量重組蛋白菌液。

(1)取1,000mL菌液，離心10min(8,000rpm)，棄上清，收集菌體。

(2)在菌體中加入裂解液。

(3)超聲波破碎，直到菌液澄清。

(4)離心10min(12,000rpm)，留上清。

(5)取鎳離子親和層析柱，用Banding Buffer平衡5-10個(gè)床體積；

(6)將樣品于0.22μm濾膜過濾后上樣；

(7)用Banding Buffer洗5-10個(gè)床體積；

(8)用含不同梯度的咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫，并收集各洗脫峰；

(9)用400mM咪唑洗脫液清洗后，用20％的乙醇洗滌至離子濃度為0，將柱子于4℃保存。

(10)將蛋白用超濾管進(jìn)行超濾和濃縮，多次加入PBS進(jìn)行溶液的置換，以除去原有的咪唑；

(11)蛋白濃縮后，進(jìn)行SDS-PAGE檢查，并以BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

5、結(jié)果

Eg-DHFR片段成功連接在pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃條件下，用1mM IPTG誘導(dǎo)5h時(shí)表達(dá)量最大。表達(dá)的重組蛋白大小為27kDa左右，符合預(yù)期大小?？扇苄苑治鼋Y(jié)果顯示，rEg-DHFR表達(dá)為可溶性蛋白。純化后的重組蛋白為單一條帶(圖2)。

實(shí)施例8：免疫原性分析

1、兔抗rEg-DHFR-IgG的制備

將純化后的rEg-DHFR蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照1:1比例混合制備乳劑苗。對(duì)兩只新西蘭兔進(jìn)行皮下四次注射免疫，每次間隔兩個(gè)周免疫一次，第一次用弗氏完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫。

免疫結(jié)束后，使用HiTrap ProteinA 1mL預(yù)裝柱和HPLC純化系統(tǒng)(Bio-Rad)純化血清，將流速調(diào)為1.0mL/min，使用A2Buffer洗柱子10min。將0.45μm NC膜過濾過的血清放入柱子中，0.5mL/min。用10-20ml的B Buffer洗脫，收集洗脫下來的IgG，并用50mM的Tris調(diào)節(jié)洗脫下來的IgG溶液的PH。平衡后用20％的酒精洗滌柱子，直到離子濃度降為0。通過SDS-PAGE鑒定抗體純化情況。

2、免疫印跡

(1)按照上述方法制備蛋白質(zhì)電泳凝膠，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

(2)蛋白質(zhì)電泳結(jié)束后，取蛋白質(zhì)所在的相應(yīng)凝膠部位，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行平衡，共3次，每次4min。

(3)將硝酸纖維素濾膜(NC膜)和24層濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min。

(4)按順序?qū)㈥帢O電極板、24層濾紙、凝膠、NC膜、24層濾紙置于Bio-Rad半干式轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，蓋上陽極電極板。

(5)將電轉(zhuǎn)移裝置接到電轉(zhuǎn)儀上，并加入轉(zhuǎn)移緩沖液35mA轉(zhuǎn)移30min。

(6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，浸泡在3％BSA的TBST中，4℃封閉過夜。

(7)封閉結(jié)束后，剪開NC膜，陰性和陽性分開放置，加入1：1000稀釋的一抗，室溫孵育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(8)將HRP標(biāo)記的Goat-anti-sheep IgG按1:1000稀釋后，加入NC膜，室溫孵育2h后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(9)將NC膜置于平皿中，以新鮮底物顯色液沖洗直至顯色。

(10)顯色后，用雙蒸水沖洗NC膜終止顯色，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。

3、結(jié)果

免疫印跡顯示，rEg-DHFR能被細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清識(shí)別，且為單一條帶(圖2)，說明rEg-DHFR具有較好的免疫原性。以兔抗rEg-DHFR-IgG識(shí)別原頭蚴粗蛋白提取液，顯示只有單一條帶，大小與天然Eg-DHFR一致(21.9kDa)，說明表達(dá)的重組蛋白確實(shí)為rEg-DHFR。

實(shí)施例9：間接ELISA方法的建立

1、間接ELISA操作步驟

(1)以抗原包被液按比列稀釋rEg-DHFR蛋白，每孔100μL加入96酶標(biāo)板中進(jìn)行包被；

(2)倒掉包被液，拍干孔內(nèi)液體，用PBST洗滌，重復(fù)四次；

(3)加入封閉液(5％的脫脂奶粉)封閉后，洗滌四次；

(4)用PBS按比例稀釋血清后，加入酶標(biāo)孔孵育，倒掉液體，洗滌四次；

(5)加入稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊或綿羊抗兔二抗，孵育，洗滌四次；

(6)在避光條件下向孔中加入可溶性單組分底物TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)；

(7)在孔中加入100μL 2M H₂SO₄終止反應(yīng)，在紫外吸光度為450nm時(shí)測(cè)定其OD值。

(8)倒掉液體，拍干后，按(2)所示洗滌四次，每次3min；

(9)倒掉液體，拍干后，在避光條件下進(jìn)行顏色反應(yīng)，向孔中加入可溶性單組分底物TMB，每孔100μL，室溫孵育10～20min；

(10)再向孔中加入100μL 2M H₂SO₄終止反應(yīng)，立即將96孔板置于酶標(biāo)儀上，在紫外吸光度為450nm時(shí)測(cè)定其OD值。

2、確定最佳條件

(1)用棋盤滴定法確定最佳抗原和血清稀釋濃度^[100]，設(shè)置6個(gè)抗原濃度梯度，分別為：0.075μg,0.15μg,0.3μg,0.6μg,1.2μg和2.4μg/每孔，血清從1:20到1:2560作倍比稀釋，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(2)二抗作用的最佳濃度和時(shí)間，分別設(shè)1:1000，1:2000，1:3000，1:4000，1:5000五個(gè)稀釋濃度進(jìn)行摸索。二抗作用時(shí)間設(shè)置為37℃0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)四個(gè)組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(3)抗原包被時(shí)間確定，用包被液稀釋重組抗原，用最佳稀釋濃度進(jìn)行包被，包被時(shí)間分別為37℃1h、37℃2h及4℃過夜3個(gè)組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(4)封閉液以及封閉時(shí)間的確定，分別用1％BSA，3％BSA，5％BSA，1％脫脂牛奶，3％脫脂牛奶，5％脫脂牛奶封閉。用最佳的封閉液分別封閉37℃1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)及4℃過夜4個(gè)，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(5)陰、陽性血清反應(yīng)時(shí)間的確定，按照確定的條件來篩選陰、陽性血清的最佳孵育時(shí)間，設(shè)為37℃0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)4個(gè)組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的濃度作為最佳。

(6)底物顯色時(shí)間的確定，37℃條件下設(shè)5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘和30分鐘顯色時(shí)間，測(cè)定OD₄₅₀值，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大時(shí)間作為最佳。

間接ELISA結(jié)果顯示，P/N值達(dá)到最高的抗原包被的最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.6μg/每孔，血清最佳稀釋濃度為1:320，最佳封閉液和封閉條件是5％脫脂奶粉37℃封閉1h，血清孵育最佳時(shí)間是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳時(shí)間是37℃ 1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000時(shí)，底物顯色的最佳條件是37℃ 15min，在以上條件下，測(cè)得陰陽性血清的P/N值為3.86。

3、臨界值的確定

在最佳條件下，測(cè)定24份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陰性血清的OD₄₅₀。設(shè)置三個(gè)重復(fù)。按照臨界值＝平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

用24份綿羊陰性血清樣品的OD₄₅₀值確定臨界值，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出24份綿羊陰性血清樣品OD₄₅₀值的平均值為0.255，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0488。根據(jù)計(jì)算公式：臨界值＝陰性樣本OD₄₅₀平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差，得出臨界值為0.4014，即OD₄₅₀>0.4014時(shí)，理論上可判定為陽性，OD₄₅₀<0.4014可判定為陰性。

4、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次包被的板子，檢測(cè)5份已知為細(xì)粒棘球蚴病陽性的綿羊血清，每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，按照已經(jīng)建立的ELISA方法，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)，檢測(cè)該方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，板內(nèi)的變異系數(shù)在0.332％-0.944％之間，平均值為0.661％。

5、批間重復(fù)性試驗(yàn)

取3個(gè)批次包被的板子，在最佳條件下，檢測(cè)3份細(xì)粒棘球蚴病陽性的綿羊血清，每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，按照已經(jīng)建立的ELISA方法，進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)，檢測(cè)該方法的批間重復(fù)性。

批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，板間變異系數(shù)在0.584％-1.21％之間，平均值為0.830％。

6、特異性試驗(yàn)

用建立的間接ELISA分別對(duì)山羊抗細(xì)頸囊尾蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其特異性。

用建立的間接ELISA分別對(duì)綿羊抗腦多頭蚴血清和山羊抗細(xì)頸囊尾蚴陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與綿羊腦包蟲血清無交叉反應(yīng)，與細(xì)頸囊尾蚴有2個(gè)血清有交叉反應(yīng)(圖3)，因此，其特異性為85.7％(12/14)。

7、靈敏度試驗(yàn)

將3份陽性血清作倍比稀釋，從1:100到1:201800，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，確定其靈敏度。

將3份陽性血清作倍比稀釋，結(jié)果顯示在稀釋6400倍時(shí)，OD₄₅₀平均值為0.527，仍屬于陽性，而在在稀釋12800倍時(shí)，OD₄₅₀平均值為0.334，小于臨界值，因此，確定其靈敏度為1:6400。

8、臨床試驗(yàn)

用建立的間接ELISA方法分別對(duì)24份細(xì)粒棘球蚴病陰性綿羊血清和24分細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)臨界值判斷該方法的可靠性。

用24份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清和24份陰性血清對(duì)建立的間接ELISA方法進(jìn)行臨床檢測(cè)(見表1和圖4)，結(jié)果顯示23份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清的OD₄₅₀均大于臨界值，24份陰性血清OD₄₅₀均小于臨界值，檢測(cè)的符合率高達(dá)97.9％。

表1臨床血清樣本OD₄₅₀

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。