本發(fā)明涉及一種分子檢測(cè)技術(shù)。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種包含信號(hào)放大器的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

分子檢測(cè)在臨床診斷和分子生物學(xué)研究方面起重要作用。已研發(fā)出若干系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行分子檢測(cè)，以便檢測(cè)和/或鑒別樣品中的靶分子。

場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FET)為對(duì)表面電荷極其敏感的半導(dǎo)體電子組件。在若干種FET中，硅納米線(SiNW)FET生物傳感器是指硅納米線的表面經(jīng)識(shí)別分子修飾的感測(cè)元件。當(dāng)FET暴露于包含靶分子，如蛋白質(zhì)、DNA或RNA的水性環(huán)境時(shí)，靶分子結(jié)合到硅納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管的表面上的識(shí)別分子。在此狀況下，由通過(guò)靶分子攜帶的電荷形成的電場(chǎng)影響SiNW-FET的電子或空穴數(shù)目，觸發(fā)電導(dǎo)率的上升或下降。通過(guò)監(jiān)測(cè)電導(dǎo)率的變化，可測(cè)定靶分子的存在且甚至測(cè)定濃度。

已使用場(chǎng)效應(yīng)晶體管來(lái)檢測(cè)和/或鑒別靶寡核苷酸以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合，其兩者均受益于不存在試劑標(biāo)記要求和FET傳感器的商業(yè)制造來(lái)源的簡(jiǎn)便可用性。FET傳感器的靈敏度高度取決于晶體管表面與實(shí)際檢測(cè)分子之間的檢測(cè)距離(德拜長(zhǎng)度(debyelength))。在靈敏度方面，大多數(shù)當(dāng)前類型的FET作為基因檢測(cè)裝置是不能令人滿意的。這主要是由于對(duì)DNA/DNA或DNA/RNA雜交的相對(duì)高鹽濃度的要求。高度帶電的生物分子的雜交需要適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度來(lái)抑制電荷排斥力。不幸的是，雜交緩沖液中的離子也會(huì)減小FET德拜長(zhǎng)度并且因此削弱檢測(cè)靈敏度。在抗體-抗原結(jié)合檢測(cè)的情況下，相比于其它生物分子，大尺寸抗體也會(huì)降低FET的檢測(cè)靈敏度。舉例來(lái)說(shuō)，在應(yīng)用二次抗體的檢測(cè)中，考慮到二次抗體的大尺寸，感測(cè)區(qū)中的二次抗體的凈電荷(在德拜長(zhǎng)度內(nèi))較少，且電導(dǎo)率的變化較??；因此信號(hào)較弱?？贵w的表面電荷分布和結(jié)合的抗體的結(jié)合定向使得難以解決FET檢測(cè)和定量分析。另外，結(jié)合緩沖液中的鹽的介質(zhì)濃度也會(huì)減小德拜長(zhǎng)度，并且轉(zhuǎn)而還會(huì)降低檢測(cè)靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了改進(jìn)檢測(cè)靈敏度和感測(cè)極限，提供一種包含信號(hào)放大器的檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)靶分子的方法，其包含形成包含靶分子的捕獲復(fù)合物；和將捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器結(jié)合，其中捕獲復(fù)合物具有凈電荷；信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物的親和力且具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷。

本發(fā)明也提供一種檢測(cè)靶分子的試劑盒，其包含：

信號(hào)放大器，其具有與包含靶分子的捕獲復(fù)合物的親和力，其中捕獲復(fù)合物具有凈電荷；信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷；和

電信號(hào)檢測(cè)元件，其用于檢測(cè)由于捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化。

在以下部分中詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)可發(fā)現(xiàn)于具體實(shí)施方式和權(quán)利要求書(shū)中。

附圖說(shuō)明

圖1顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的方法的示意圖。

圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的電中性核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。

圖3顯示使用R18RNA適體作為信號(hào)放大器以放大6×組氨酸t(yī)ag抗原和抗6×組氨酸-tag家兔抗體的主信號(hào)的檢測(cè)的I_D-V_G曲線。

圖4顯示使用抗家兔山羊抗體作為信號(hào)放大器以放大6×組氨酸t(yī)ag抗原和抗6×組氨酸-tag家兔抗體的主信號(hào)的檢測(cè)的I_D-V_G曲線。

圖5顯示通過(guò)使用R18RNA適體或抗家兔山羊抗體作為信號(hào)放大器以放大6×組氨酸t(yī)ag抗原和抗6×組氨酸-tag家兔抗體的主信號(hào)的檢測(cè)誘導(dǎo)的閾值電壓位移。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種檢測(cè)靶分子的方法，其包含形成包含靶分子的捕獲復(fù)合物；和將捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器結(jié)合，其中捕獲復(fù)合物具有凈電荷；信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物的親和力且具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”是指發(fā)現(xiàn)或確定靶分子的存在性或存在度，且優(yōu)選地鑒別靶分子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)包含定量樣品中的靶分子。本文中應(yīng)用的反應(yīng)包括(但不限于)寡核苷酸分子之間的雜交、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體結(jié)合、寡核苷酸-蛋白質(zhì)相互作用、多糖-蛋白質(zhì)相互作用或小分子-蛋白質(zhì)相互作用。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶分子”是指從分子池檢測(cè)或鑒別上文指定小分子或大分子。優(yōu)選地，靶分子為大分子，如蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、寡核苷酸或聚核苷酸。靶分子為天然存在或人工的。在另一方面中，靶分子經(jīng)純化或與其它內(nèi)容物混合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，靶分子的表達(dá)模式在正常條件與異常條件(如疾病)下不同。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，靶分子的表達(dá)模式在不同細(xì)胞類型中不同。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，靶分子為DNA分子、RNA分子、抗體、抗原、酶、底物、配體、受體、細(xì)胞膜相關(guān)蛋白或細(xì)胞表面標(biāo)記物。DNA分子優(yōu)選地為基因或未轉(zhuǎn)錄區(qū)。RNA分子優(yōu)選地為mRNA、微RNA、長(zhǎng)非翻譯RNA、rRNA、tRNA或siRNA。

根據(jù)本發(fā)明的樣品衍生自天然存在的來(lái)源或衍生自人工操縱。優(yōu)選地，樣品衍生自天然存在的來(lái)源，如提取物、體液、組織生檢、液體生檢或細(xì)胞培養(yǎng)物。在另一方面中，樣品根據(jù)檢測(cè)所需的反應(yīng)處理。舉例來(lái)說(shuō)，可調(diào)節(jié)樣品的pH值或離子強(qiáng)度。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“捕獲復(fù)合物”是指包含至少兩個(gè)分子的復(fù)合物且捕獲復(fù)合物中的分子中的一個(gè)為靶分子。捕獲復(fù)合物中的其它分子中的一個(gè)能夠特異性結(jié)合到靶分子，即捕獲具有親和力的靶分子，以形成捕獲復(fù)合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含與識(shí)別分子形成捕獲復(fù)合物，所述識(shí)別分子能夠捕獲具有親和力的靶分子。形成捕獲復(fù)合物提供發(fā)現(xiàn)或確定靶分子的存在性或存在度的主信號(hào)。識(shí)別分子的類型取決于靶分子的類型。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，識(shí)別分子為根據(jù)堿基互補(bǔ)性能夠與靶寡核苷酸分子形成捕獲復(fù)合物的單鏈寡核苷酸分子。捕獲復(fù)合物優(yōu)選地指雙鏈結(jié)構(gòu)，且一個(gè)單鏈為靶寡核苷酸分子且另一單鏈為識(shí)別分子。優(yōu)選地，識(shí)別分子具有與靶寡核苷酸分子的序列匹配的序列；更優(yōu)選地，具有與靶寡核苷酸分子的序列完全匹配的序列。通過(guò)形成捕獲復(fù)合物，靶寡核苷酸分子可捕獲自樣品中的混合物。捕獲步驟也指特異性選擇靶寡核苷酸分子和在捕獲復(fù)合物中呈現(xiàn)靶寡核苷酸分子的純化步驟。

靶寡核苷酸分子可為單鏈分子或雙鏈分子。獲得雙鏈靶寡核苷酸分子的單鏈的方式可例如為加熱或改變雙鏈靶寡核苷酸分子的環(huán)境的離子強(qiáng)度。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，靶分子為抗原，且識(shí)別分子為其抗體，且根據(jù)抗原-抗體親和力形成捕獲復(fù)合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，靶分子為抗體，且識(shí)別分子為其抗原，且根據(jù)抗原-抗體親和力形成捕獲復(fù)合物。

形成捕獲復(fù)合物的方式取決于靶分子和識(shí)別分子的天然特性。形成捕獲復(fù)合物的方式的實(shí)例包括(但不限于)寡核苷酸分子之間的雜交、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體結(jié)合、寡核苷酸-蛋白質(zhì)相互作用、多糖-蛋白質(zhì)相互作用或小分子-蛋白質(zhì)相互作用。

根據(jù)本發(fā)明的捕獲復(fù)合物可呈現(xiàn)于溶液中或附著于固體表面上。優(yōu)選地，捕獲復(fù)合物附著于固體表面上或捕獲復(fù)合物與固體表面間隔開(kāi)一定距離。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“固體表面”是指固體載體，包括(但不限于)聚合物、紙、織物或玻璃。采用的固體表面取決于待檢測(cè)的信號(hào)而變化。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)方法采用場(chǎng)效應(yīng)晶體管監(jiān)測(cè)信號(hào)時(shí)，固體表面為場(chǎng)效應(yīng)晶體管的晶體管表面；當(dāng)方法采用表面等離子體共振時(shí)，固體表面為表面等離子體共振的金屬表面。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，固體表面的材料為硅；優(yōu)選地多晶硅或單晶硅；更優(yōu)選地多晶硅。多晶硅比單晶硅更便宜，但由于多晶具有更多晶界，通常在晶界中出現(xiàn)阻礙電子轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷。此類現(xiàn)象使得固體表面不均勻且難以定量。此外，離子可能穿透到多晶的晶界中且引起溶液中的檢測(cè)失效。另外，多晶硅在空氣中不穩(wěn)定。然而，上述缺點(diǎn)將不干擾根據(jù)本發(fā)明的方法的功能。

捕獲復(fù)合物附著于固體表面上的方式取決于固體表面的材料和捕獲復(fù)合物的類型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲復(fù)合物經(jīng)由共價(jià)鍵鍵聯(lián)到固體表面。共價(jià)鍵的實(shí)例包括(但不限于)以下方法，其取決于固體表面化學(xué)性質(zhì)和靶分子或識(shí)別分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)氧化硅用作固體表面時(shí)，固體表面通過(guò)使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)修飾。APTES的分子中的硅原子進(jìn)行與羥基的氧原子的共價(jià)結(jié)合且其將表面的硅烷醇基團(tuán)(SiOH)轉(zhuǎn)化為胺；接著識(shí)別單鏈寡核苷酸分子的5'-氨基通過(guò)戊二醛與固體表面胺基共價(jià)結(jié)合(羅伊以利拿單(Roey Elnathan)、莫里亞奎亞特(Moria Kwiat)、亞歷山大佩夫茲納(Alexander Pevzner)、約尼恩格爾(Yoni Engel)、拉里薩伯斯坦(Larisa Burstein)、阿爾蒂姆卡其托林茨(Artium Khatchtourints)、阿米爾利希滕斯坦(Amir Lichtenstein)、賴莎坎塔艾夫(Raisa Kantaev)和費(fèi)爾南多帕托斯基(Fernando Patolsky),生物識(shí)別層工程改造：克服基于納米線的FET裝置的篩選限度(Biorecognition Layer Engineering:Overcoming Screening Limitations of Nanowire-Based FET Devices),納米快報(bào)(Nanoletters),2012,12,5245-5254)。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，固體表面修飾為自組裝單層分子，所述分子具有用于通過(guò)各種化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵聯(lián)到識(shí)別單鏈寡核苷酸分子的不同官能基的不同官能基(斯里瓦塔薩文卡塔蘇巴勞(Srivatsa Venkatasubbarao),微陣列狀態(tài)和展望(Microarrays-status and prospects),生物技術(shù)趨勢(shì)(TRENDS in Biotechnology)第22卷第12號(hào)2004年12月；金蘇文(Ki Su Kim)、李炫升(Hyun-Seung Lee)、楊鄭安(Jeong-AYang)、喬孟何(Moon-Ho Jo)和韓四光(Sei Kwang Hahn)，適體官能化Si-納米線FET生物傳感器的制造、表征和應(yīng)用(The fabrication,characterization and application ofaptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors),納米技術(shù)(Nanotechnology)20(2009))。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲復(fù)合物與固體表面間隔開(kāi)一定距離。由于電性變化檢測(cè)元件應(yīng)用于檢測(cè)因捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器的結(jié)合所致的電性變化，捕獲復(fù)合物無(wú)需直接結(jié)合到固體表面，其條件是捕獲復(fù)合物與固體表面之間的距離足夠短以允許電性變化檢測(cè)元件檢測(cè)電性變化。優(yōu)選地，固體表面與捕獲復(fù)合物之間的距離為約0到約10nm；更優(yōu)選地約0到約5nm。

根據(jù)本發(fā)明的捕獲復(fù)合物具有凈電荷。優(yōu)選地，通過(guò)捕獲復(fù)合物的凈電荷產(chǎn)生的電信號(hào)太弱而無(wú)法檢測(cè)，且需要信號(hào)放大器。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)放大器”是指具有與捕獲復(fù)合物的親和力，且具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷的分子。如果捕獲復(fù)合物的凈電荷為正性，那么信號(hào)放大器的相同凈電荷也為正性；如果捕獲復(fù)合物的凈電荷為負(fù)性，那么信號(hào)放大器的相同凈電荷也為負(fù)性。盡管信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷，信號(hào)放大器與捕獲復(fù)合物之間的親和力結(jié)合比這兩種凈電荷之間的排斥力強(qiáng)。通過(guò)結(jié)合信號(hào)放大器和捕獲復(fù)合物，捕獲復(fù)合物的凈電荷的信號(hào)通過(guò)引入信號(hào)放大器的相同凈電荷而放大。

優(yōu)選地，信號(hào)放大器具有小尺寸。在小尺寸的情況下，結(jié)合的信號(hào)放大器和捕獲復(fù)合物位于電信號(hào)檢測(cè)元件的感測(cè)區(qū)，且放大效應(yīng)經(jīng)最大化。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)FET用作電信號(hào)檢測(cè)元件時(shí)，結(jié)合的信號(hào)放大器和捕獲復(fù)合物位于德拜(debye)長(zhǎng)度內(nèi)。更優(yōu)選地，信號(hào)放大器的分子量為約0.5kDa到約50kDa；更優(yōu)選地約1.5kDa到約35kDa。

在另一方面中，信號(hào)放大器具有豐富的凈電荷。優(yōu)選地，信號(hào)放大器具有至少一個(gè)凈電荷，更優(yōu)選地至少五個(gè)凈電荷；更優(yōu)選地至少十個(gè)電荷。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，信號(hào)放大器具有高凈電荷密度。具有高凈電荷密度的分子的意思是分子相比于具有相同分子量的分子具有更多凈電荷。更優(yōu)選地，信號(hào)放大器具有豐富的凈電荷和小尺寸。

信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物中的靶分子或識(shí)別分子的親和力。優(yōu)選地，信號(hào)放大器具有與靶分子的親和力。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，信號(hào)放大器為寡核苷酸分子，包括單鏈寡核苷酸分子和雙鏈寡核苷酸分子。通過(guò)具有不同序列和/或結(jié)構(gòu)，寡核苷酸能夠具有與不同分子的親和力。在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，信號(hào)放大器為寡核苷酸適體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”或“寡核苷酸分子”是指核苷酸的寡聚物。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”是指由含氮堿基、糖和一或多個(gè)磷酸酯基，優(yōu)選一個(gè)磷酸基構(gòu)成的有機(jī)分子。含氮堿基包括嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤包括經(jīng)取代或未經(jīng)取代的腺嘌呤和經(jīng)取代或未經(jīng)取代的鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶包括經(jīng)取代或未經(jīng)取代的胸腺嘧啶、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的胞嘧啶和經(jīng)取代或未經(jīng)取代的尿嘧啶。糖優(yōu)選地為五碳糖，更優(yōu)選地經(jīng)取代或未經(jīng)取代的核糖或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的脫氧核糖。磷酸酯基與糖的2碳、3碳或5碳；優(yōu)選地與5碳位點(diǎn)形成鍵。為了形成寡核苷酸，通過(guò)磷酸二酯橋?qū)⒁粋€(gè)核苷酸的糖與相鄰糖接合。優(yōu)選地，寡核苷酸為DNA或RNA；更優(yōu)選地為DNA。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸適體”是指結(jié)合到特定分子的寡核苷酸分子。寡核苷酸適體可通過(guò)從大型隨機(jī)序列集合，如從SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)方法選擇所述適體而獲得?；貞?yīng)于捕獲復(fù)合物，可選擇合格寡核苷酸適體。

根據(jù)本發(fā)明，如果靶分子存在于樣品中，那么識(shí)別分子結(jié)合到靶分子以形成具有凈電荷的捕獲復(fù)合物。由于捕獲復(fù)合物攜有凈電荷，歸因于通過(guò)引入凈電荷形成捕獲復(fù)合物而出現(xiàn)主信號(hào)形式的電性變化。另一方面，如果靶分子不存在于樣品中，那么識(shí)別分子無(wú)法結(jié)合到靶分子。因此，電環(huán)境不變，且未出現(xiàn)電性變化。因此，如果捕獲復(fù)合物存在于樣品中，那么信號(hào)放大器結(jié)合到捕獲復(fù)合物。由于信號(hào)放大器攜有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷，歸因于通過(guò)引入更多凈電荷的信號(hào)放大器結(jié)合而出現(xiàn)經(jīng)放大的電性變化。監(jiān)測(cè)出現(xiàn)的電性變化，進(jìn)而檢測(cè)靶分子。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含監(jiān)測(cè)由于捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化。

根據(jù)本發(fā)明的電性變化包括(但不限于)凈電荷的增加。電性變化可檢測(cè)為電信號(hào)。電信號(hào)包括(但不限于)導(dǎo)電性、電場(chǎng)、電容、電流、電子或電子空穴的變化。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，電性變化為閾值電壓位移變化。優(yōu)選地，電性變化通過(guò)電性變化檢測(cè)元件檢測(cè)。

優(yōu)選地，固體表面與電性變化檢測(cè)元件耦接以檢測(cè)電性變化。優(yōu)選地，電性變化檢測(cè)元件為場(chǎng)效應(yīng)晶體管或表面等離子體共振，更優(yōu)選地場(chǎng)效應(yīng)晶體管。場(chǎng)效應(yīng)晶體管的實(shí)例包括(但不限于)納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管、納米管場(chǎng)場(chǎng)效應(yīng)晶體管和石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管。

根據(jù)本發(fā)明，自由形式的信號(hào)放大器優(yōu)選地在檢測(cè)電性變化之前去除，進(jìn)而避免通過(guò)由自由形式的信號(hào)放大器攜帶的電荷產(chǎn)生的噪音。去除方式包括(但不限于)洗滌。

參看圖1，說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。首先，作為識(shí)別分子的抗原固定于FET芯片的表面上，且注射作為靶分子的第一抗體。捕獲復(fù)合物通過(guò)抗原和第一抗體形成。在此實(shí)施例中，捕獲復(fù)合物攜有負(fù)凈電荷。此外，注射作為信號(hào)放大器的RNA適體且結(jié)合到捕獲復(fù)合物。由于RNA適體攜有更多負(fù)凈電荷，信號(hào)經(jīng)放大。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，識(shí)別分子為包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸的部分中性單鏈寡核苷酸。使核苷酸呈電中性的方式不受限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，電中性核苷酸包含經(jīng)烷基取代的磷酸酯基。優(yōu)選地，烷基是C₁-C₆烷基；更優(yōu)選地，烷基是C₁-C₃烷基。C₁-C₃烷基的實(shí)例包括(但不限于)甲基、乙基和丙基。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的電中性核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。磷酸酯基中的帶負(fù)電氧原子改變?yōu)椴痪哂须姾傻闹行栽?。用烷基取代磷酸酯基的方式可根?jù)普通化學(xué)反應(yīng)應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的帶負(fù)電核苷酸包含具有至少一個(gè)負(fù)電荷的磷酸酯基。未經(jīng)修飾的核苷酸優(yōu)選地為不具有修飾或取代的天然存在的核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，帶負(fù)電核苷酸包含未經(jīng)取代的磷酸酯基。

根據(jù)本發(fā)明的部分中性單鏈寡核苷酸被部分賦予電中性。序列或長(zhǎng)度不受限制，并且部分中性單鏈寡核苷酸的序列或長(zhǎng)度可根據(jù)靶分子，基于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行設(shè)計(jì)。

電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的數(shù)目取決于部分中性單鏈寡核苷酸的序列和復(fù)合物形成的條件。電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的位置也取決于部分中性單鏈寡核苷酸的序列和復(fù)合物形成的條件?？筛鶕?jù)可用信息，基于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，設(shè)計(jì)電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的數(shù)目和位置。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)基于雙鏈(ds)結(jié)構(gòu)能量的分子建模計(jì)算設(shè)計(jì)電中性核苷酸的數(shù)目和位置，并且可接著參考結(jié)構(gòu)能量測(cè)定dsDNA/DNA或dsDNA/RNA的熔融溫度(Tm)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含多個(gè)電中性核苷酸，并且至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸安置在兩個(gè)電中性核苷酸之間；更優(yōu)選地，至少兩個(gè)帶負(fù)電核苷酸安置在兩個(gè)電中性核苷酸之間。

通過(guò)引入電中性核苷酸，相比于常規(guī)DNA探針，根據(jù)本發(fā)明的部分中性單鏈寡核苷酸的完美匹配雙鏈寡核苷酸與不匹配雙鏈寡核苷酸之間的熔融溫度差值更高。不受理論限制，推測(cè)兩條鏈之間的靜電排斥力通過(guò)引入中性寡核苷酸而減小，并且熔融溫度從而升高。通過(guò)控制電中性核苷酸的數(shù)目和位置，將熔融溫度差值調(diào)節(jié)到所需點(diǎn)，提供較好工作溫度或溫度范圍以區(qū)分完美和不匹配寡核苷酸，從而改進(jìn)捕獲特異性。此類設(shè)計(jì)有益于整合到一個(gè)芯片或陣列中的不同部分中性單鏈寡核苷酸的熔融溫度的一致性。待檢測(cè)反應(yīng)數(shù)目可以隨著較高特異性而顯著升高，并且更多檢測(cè)單元可并入到單一檢測(cè)系統(tǒng)中。所述設(shè)計(jì)提供較好微陣列操作條件。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含附接到固體表面的第一部分；第一部分的長(zhǎng)度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長(zhǎng)度的約50％；并且第一部分包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸；更優(yōu)選地，第一部分的長(zhǎng)度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長(zhǎng)度的約40％；更優(yōu)選地，第一部分的長(zhǎng)度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長(zhǎng)度的約30％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分單鏈核苷酸進(jìn)一步包含與第一部分鄰接的第二部分。第二部分位于固體表面的遠(yuǎn)端。第二部分包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸。電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的描述與第一部分的描述相同并且在本文中不再重復(fù)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在具有低于約50mM；更優(yōu)選地低于約40mM、30mM、20mM或10mM的離子強(qiáng)度的緩沖液中進(jìn)行所述方法。不受理論限制，推測(cè)通過(guò)應(yīng)用部分中性單鏈寡核苷酸，部分中性單鏈寡核苷酸與靶分子之間的形成的復(fù)合物可在不需要抑制部分帶電半中性單鏈寡核苷酸與其靶標(biāo)之間的靜電排斥力的情況下發(fā)生。接著通過(guò)堿基配對(duì)和每條鏈的堆疊力驅(qū)動(dòng)雜交。因此，可在較低鹽條件下形成雙螺旋。在FET的情況下，較低離子強(qiáng)度增加檢測(cè)長(zhǎng)度(德拜長(zhǎng)度)，并且轉(zhuǎn)而增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，相比于常規(guī)檢測(cè)，可主要在FET檢測(cè)的兩個(gè)方面看出就形成捕獲復(fù)合物來(lái)說(shuō)改進(jìn)的雜交特異性。第一，熔融溫度差異較高。第二，緩沖液具有較低鹽條件，且FET檢測(cè)長(zhǎng)度(德拜長(zhǎng)度)增加。這些差異均導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的改進(jìn)。

本發(fā)明也提供一種檢測(cè)靶分子的試劑盒，其包含：

信號(hào)放大器，其具有與包含靶分子的捕獲復(fù)合物的親和力，其中捕獲復(fù)合物具有凈電荷；信號(hào)放大器具有與捕獲復(fù)合物的凈電荷相同的凈電荷；和

電信號(hào)檢測(cè)元件，其用于檢測(cè)由于捕獲復(fù)合物與信號(hào)放大器的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含如上所述的識(shí)別分子。

提供以下實(shí)例以幫助所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。

實(shí)例

合成作為識(shí)別分子的部分中性單鏈寡核苷酸：

脫氧胞嘧啶核苷(n-ac)對(duì)甲氧基亞磷酰胺、胸苷對(duì)甲氧基亞磷酰胺、脫氧鳥(niǎo)苷(n-ibu)對(duì)甲氧基亞磷酰胺和脫氧腺苷(n-bz)對(duì)甲氧基亞磷酰胺(全部購(gòu)自美國(guó)化學(xué)基因公司(ChemGenes Corporation,USA))用于根據(jù)基于固相磷酸三酯合成的給定順序或通過(guò)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)3900高通量DNA合成器(由Biosci&Tech或使命生物技術(shù)(Mission Biotech)提供)合成寡核苷酸。

合成的寡核苷酸以弱堿性在甲苯中在室溫下反應(yīng)24小時(shí)，且樣品經(jīng)受離子交換色譜以將pH值調(diào)節(jié)到7。在樣品經(jīng)濃縮和干燥之后，獲得部分中性單鏈寡核苷酸。

合成作為信號(hào)放大器的RNA適體

cDNA R18RNA適體通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成。

PCR反應(yīng)溶液含有：2μL 10×PCR緩沖液、0.5μL 10mM dNTP、0.5μL 10μM cDNA引物1(購(gòu)自美國(guó)集成裝置技術(shù)(Integrated Device Technology；IDT))、0.5μL 10μM cDNA引物2(購(gòu)自美國(guó)集成裝置技術(shù)(IDT))、0.5μL 10μM cDNA R18RNA適體模板(購(gòu)自美國(guó)集成裝置技術(shù)(IDT))、0.5μL Taq DNA聚合酶和15.5μL去離子水。PCR程序?yàn)椋阂粋€(gè)循環(huán)的95℃下持續(xù)1分鐘、50℃下持續(xù)1分鐘和72℃下持續(xù)1分鐘；40個(gè)循環(huán)的95℃下持續(xù)45秒、55℃下持續(xù)45秒和72℃下持續(xù)45秒；和一個(gè)循環(huán)的72℃下持續(xù)3分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化且在-20℃下儲(chǔ)存。

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)受轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有：25μL 2×緩沖液、2.5μL 1μg PCR產(chǎn)物、17.5μL去離子水和5μL酶T7Express(T7RiboMAX^TMExpress大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)，美國(guó)普洛麥格(Promega,USA))。反應(yīng)混合物在37℃下反應(yīng)2小時(shí)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)純化。

識(shí)別分子附接：

Si納米線(SiNW)芯片用40mL丙酮洗滌兩次、用40mL乙醇洗滌兩次且用40mL去離子水洗滌兩次。表面用富氮空氣干燥且引入氧等離子體30秒。含有80μL 25％(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和4mL乙醇的溶液用于修飾表面30分鐘。芯片再次用40mL乙醇洗滌兩次且在120℃下加熱10分鐘。芯片在室溫下浸沒(méi)于含戊二醛(3mL 10mM磷酸鈉緩沖劑和1mL戊二醛)的液體中1小時(shí)。芯片用磷酸鈉緩沖劑洗滌兩次。

500μL 0.33％6×組氨酸-tag肽(購(gòu)自英國(guó)阿布凱姆(abcam,U.K.))作為識(shí)別分子，且滴于芯片表面上。涂布的芯片用10mM磷酸鈉緩沖劑洗滌，接著浸沒(méi)于4mM NaBH₃CN中30分鐘，且浸沒(méi)于1％BSA阻斷緩沖液中1h。在富氮空氣干燥之前，芯片兩次用Tris-HCl洗滌10分鐘，接著用去離子水洗滌。

捕獲和信號(hào)放大

芯片配備有微流體系統(tǒng)。將5mL/h的1mM雙-三丙烷引入到通道中，且信號(hào)監(jiān)測(cè)為基線。

抗-6×組氨酸-tag家兔抗體的0.33％的靶分子以5mL/h引入到通道中，持續(xù)10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-三丙烷緩沖液洗滌10分鐘，且信號(hào)監(jiān)測(cè)為主信號(hào)。

R18RNA適體的信號(hào)放大器以5mL/h引入到通道中，持續(xù)10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-三丙烷緩沖液洗滌10分鐘，且信號(hào)監(jiān)測(cè)為放大信號(hào)。結(jié)果顯示于圖3中。位移電壓為122.6mV(ΔV＝V_d1-V_d0,at I_d1＝-9)。

作為比較物的抗家兔山羊抗體以5mL/h引入到通道中，持續(xù)10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-三丙烷緩沖液洗滌10分鐘，且信號(hào)監(jiān)測(cè)為比較信號(hào)。結(jié)果顯示于圖4中。位移電壓為20.9mV(ΔV＝V_d1-V_d0,at I_d1＝-9)。

參看圖5，捕獲復(fù)合物的主信號(hào)通過(guò)使用信號(hào)放大器成功且顯著地放大。相比于常規(guī)二次抗體(抗家兔山羊抗體)，根據(jù)本發(fā)明的信號(hào)放大器改進(jìn)檢測(cè)的靈敏度和感測(cè)極限。

盡管已結(jié)合上文闡述的特定實(shí)施例描述本發(fā)明，對(duì)于其的許多替代方案和其修改和變化將對(duì)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。所有此類替代方案、修改和變化被視為落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。