本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用閥切換方法同時(shí)檢測植物中的無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和三種植物素的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，檢測植物中的無機(jī)陰離子、有機(jī)酸通常采用高效陰離子交換色譜法(離子色譜法)，而莨菪亭、蘆丁、槲皮素等植物素采用反相高效液相色譜法、分光光度法等方式進(jìn)行單獨(dú)測定。但在分析測試中，經(jīng)常需要同時(shí)對無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和不同的植物素進(jìn)行測定。若仍然采用分開單獨(dú)測定的方法，不僅會(huì)造成人力財(cái)力的浪費(fèi)，而且無法滿足某些對檢測時(shí)效性較強(qiáng)的應(yīng)用。目前尚沒有一種有效可靠的方法能夠同時(shí)測定上述物質(zhì)含量，因此亟需開發(fā)一種能夠同時(shí)檢測植物中的無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和多種植物素的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，并提供一種利用閥切換方法同時(shí)檢測植物中的有機(jī)酸、無機(jī)陰離子和三種植物素的方法與應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下：

利用閥切換方法同時(shí)檢測植物中的有機(jī)酸、無機(jī)陰離子和三種植物素的方法，利用閥切換法連用高效液相色譜儀紫外檢測法與高效陰離子交換色譜電導(dǎo)檢測法對植物樣品中有機(jī)酸、無機(jī)陰離子和莨菪亭、蘆丁、槲皮素三種植物素進(jìn)行分離檢測；經(jīng)前處理后的植物樣品先被淋洗液帶進(jìn)連接在高效液相色譜儀的C18柱中，有機(jī)酸及陰離子在C18柱中不保留，通過設(shè)置合適的閥切換時(shí)間使機(jī)酸及陰離子被全部切換至離子色譜分析柱中，保留在C18柱中的三種植物素繼續(xù)隨著淋洗液的淋洗被沖出色譜柱，用紫外檢測器檢測；進(jìn)入離子色譜柱的樣品隨著堿液淋洗液淋洗被沖出色譜柱，用電導(dǎo)檢測器檢測。

作為優(yōu)選，植物樣品前處理方法如下：把樣品置于80℃的溫度下，烘干2小時(shí)后研磨，過0.5mm的篩子，準(zhǔn)確稱取小于0.5mm的樣品0.0400g，置于10mL容量瓶中，并準(zhǔn)確加入2.00mL超純水和8.00mL甲醇充分搖勻；設(shè)置頻率為50KHz進(jìn)行超聲提取，提取溫度為20℃，超聲提取時(shí)間為1h，移入10mL聚丙烯離心管中，在2500r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

進(jìn)一步的，通過閥切換實(shí)現(xiàn)無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和三種植物素分離的方法如下：進(jìn)樣前，六通閥1保持在Load狀態(tài)，樣品通過手動(dòng)進(jìn)樣裝載到六通閥1中的20μL定量環(huán)中，所注入的多余樣品進(jìn)入廢液；六通閥2保持在Inject狀態(tài)；進(jìn)樣完成后，啟動(dòng)切換程序，切換六通閥1，開始進(jìn)樣，六通閥1處于Inject狀態(tài)，六通閥2仍保持在Inject狀態(tài)，淋洗液將定量環(huán)中的樣品注入C18柱中，無機(jī)陰離子、有機(jī)酸在C18柱中無保留，而三種植物素在上面有保留，得以分離開來；啟動(dòng)切換程序1.1min后，切換六通閥2，使六通閥2處于Load狀態(tài)，富集柱富集有機(jī)酸、陰離子，富集時(shí)間為2.5min；富集完成后，再次切換六通閥2，使六通閥2重新回到Inject狀態(tài)，富集柱與分析柱IonPac AS11-HC相連，分離富集的有機(jī)酸、陰離子，同時(shí)C18柱分離植物素。

進(jìn)一步的，離子色譜中：分析柱采用IonPac AS11-HC(4mm×250mm)，保護(hù)柱采用IonPac AG11-HC(4mm×50mm)，富集柱采用IonPac TAC-ULP1(5mm×23mm)，色譜條件如下：流速1.0mL/min，柱溫30℃；梯度洗脫程序：0-18.6min，濃度為0.8mmol/L KOH溶液；18.6-33.6min，濃度為0.8-15mmol/L KOH溶液；33.6-53.6min，濃度為15mmol/L KOH溶液；53.6-68.6min，濃度為15-50mmol/L KOH溶液；68.6-68.7min，濃度為50-0.8mmol/L KOH溶液；68.7-69.6min，濃度為0.8mmol/L KOH溶液。

高效液相色譜中：C18柱采用依利特Hypersil ODS分析柱(4.6mm×250mm，粒徑5μm)，流動(dòng)相：甲醇(C)、水(D)，流速1.0mL/min，柱溫25℃，波長365nm；進(jìn)樣量20μL；梯度洗脫程序：0-12min，20％-40％C，80％-60％D；12-14min，40％-70％C，60％-30％D；14-22min，70％-90％C，30％-10％D；22-25min，90％-20％C，10％-80％D。

上述方法可應(yīng)用于食品生產(chǎn)和生物醫(yī)藥行業(yè)中檢測活性成份。

本發(fā)明的方法利用閥切換法將高效液相色譜法紫外檢測法與高效陰離子交換色譜—電導(dǎo)檢測法進(jìn)行聯(lián)用，可在一次檢測過程中同時(shí)對植物樣品中無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和莨菪亭、蘆丁、槲皮素三種植物素進(jìn)行分離檢測。本發(fā)明還具有重現(xiàn)性好、檢測限低、精密度好的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為閥切換裝置樣品裝載步驟圖；圖中六通閥不同孔之間實(shí)線代表連通，虛線代表不連通，下同；

圖2為閥切換裝置依利特Hypersil ODS分析柱(C18柱)分離樣品步驟圖；

圖3為閥切換裝置富集柱富集陰離子和有機(jī)酸步驟圖；

圖4為閥切換裝置陰離子、有機(jī)酸與植物素同時(shí)分析步驟圖；

圖5為50ppm有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液離子色譜圖；

圖6為10ppm有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液液相色譜圖；

圖7為第二個(gè)切換時(shí)間與陰離子、有機(jī)酸峰面積關(guān)系圖；

圖8為第一個(gè)切換時(shí)間與陰離子、有機(jī)酸峰面積關(guān)系圖；

圖9為10ppm標(biāo)準(zhǔn)混合溶液離子色譜圖；其中編號(hào)分為代表：1-乳酸；2-乙酸；3-丙酸；4-甲酸；5-Cl^-；6-蘋果酸；7-SO₄^2-；8-草酸；9-PO₄^3-；10-檸檬酸。

圖10為1ppm標(biāo)準(zhǔn)混合溶液液相色譜圖；其中編號(hào)分別代表：1-莨菪亭；2-蘆丁；3-槲皮素。

圖11為甘草樣品離子色譜圖；其中編號(hào)分別代表：1-乳酸；2-乙酸；3-甲酸；4-Cl^-；5-蘋果酸；6-SO₄^2-；7-草酸；8-PO₄^3-；9-檸檬酸。

圖12為甘草樣品液相色譜圖；其中編號(hào)分別代表：1-莨菪亭；2-蘆?。?-槲皮素。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施案例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和植物素的色譜分析，具體步驟如下：

1、儀器和試劑

本發(fā)明方法基于的閥切換裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括泵、六通閥1、依利特Hypersil ODS分析柱(C18柱)、六通閥2、富集柱、保護(hù)柱、分析柱、抑制器、電導(dǎo)檢測器、UV檢測器。六通閥1通過定量環(huán)進(jìn)行進(jìn)樣，并通過依利特Hypersil ODS分析柱與六通閥2相連，富集柱置于六通閥2中，六通閥2一路與UV檢測器相連，另一路依次與保護(hù)柱、分析柱、抑制器、電導(dǎo)檢測器相連。各檢測元件的廢液出口均與廢液收集裝置相連。

部分用到的儀器型號(hào)和參數(shù)具體如下：Thermo ICS 5000離子色譜儀(電導(dǎo)檢測器，六通閥，ASRS 300(4mm)自循環(huán)電抑制器(外接水模式，采用戴安梯度泵GP50，戴安中國有限公司)，KOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器EG40，Chromeleon 6.8色譜工作站，賽默飛世爾科技中國有限公司)；Agilent 1200series高效液相色譜儀(高壓六通進(jìn)樣閥，在線脫氣儀，梯度混合儀和UV-Vis檢測器，安捷倫科技中國有限公司)；KQ-300GVD型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS-224S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；柱溫箱(深圳天為機(jī)電設(shè)備有限公司)。

試劑如下：甲醇(色譜純，美國天地TEDIA有限公司)，乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、Cl^-、蘋果酸、SO₄^2-、草酸、PO₄^3-、檸檬酸(分析純，購自華東醫(yī)藥股份有限公司)，莨菪亭(阿拉丁試劑)、蘆丁(≥98％)、槲皮素(生化試劑)(購自華東醫(yī)藥股份有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Millipore,Molsheim,France，電阻率18.2MΩ·cm)。

實(shí)驗(yàn)樣品：甘草、白蔻和芡實(shí)樣品，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

2、色譜條件

有機(jī)酸及陰離子的分離色譜條件及檢測：賽默飛ICS5000離子色譜儀帶電導(dǎo)檢測儀分析柱IonPac AS11-HC(4mm×250mm)(括號(hào)中代表柱子型號(hào)參數(shù)，下同)+保護(hù)柱IonPac AG11-HC(4mm×50mm)和富集柱IonPac TAC-ULP1(5mm×23mm)，流速1.0mL/min，柱溫30℃。梯度洗脫程序：0-18.6min濃度為0.8mmol/LKOH溶液，18.6-33.6min濃度為0.8-15mmol/LKOH溶液，33.6-53.6min濃度為15mmol/LKOH溶液，53.6-68.6min濃度為15-50mmol/LKOH溶液，68.6-68.7min濃度為50-0.8mmol/LKOH溶液，68.7-69.6min濃度為0.8mmol/LKOH溶液。流動(dòng)相梯度表見表1。典型的色譜圖見圖9。

表1離子色譜流動(dòng)相梯度表

植物素的分離色譜條件及檢測：安捷倫1200高液液相色譜儀帶紫外檢測器，依利特Hypersil ODS分析柱(4.6mm×250mm，粒徑5μm)，流動(dòng)相：甲醇(記為C)、水(記為D)，流速1.0mL/min，柱溫25℃，波長365nm；進(jìn)樣量20μL。梯度洗脫程序：0-12min，20％-40％C，80％-60％D；12-14min，40％-70％C，60％-30％D；14-22min，70％-90％C，30％-10％D；22-25min，90％-20％C，10％-80％D。流動(dòng)相梯度表見表2。典型的色譜圖見圖10。

表2高效液相流動(dòng)相梯度表

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：Cl^-、SO₄^2-、PO₄^3-、乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸由優(yōu)級純試劑配置成濃度為1000mg/L的貯備液，莨菪亭、蘆丁、槲皮素由阿拉丁試劑配置成濃度為1000mg/L的貯備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：分別移取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至10mL的容量瓶中，用超純水定容，配得各溶質(zhì)濃度均為0.08mg/L、0.40mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、10.00mg/L、50.00mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列備用。另外分別移取一定量的Cl^-、SO₄^2-、PO₄^3-、乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至10mL的容量瓶中，用超純水定容，配得各溶質(zhì)濃度均為10.00mg/L的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

4、樣品前處理

把樣品置于80℃的溫度下，烘干2小時(shí)后研磨，過0.5mm的篩子，準(zhǔn)確稱取小于0.5mm的樣品0.0400g，置于10mL容量瓶中，并準(zhǔn)確加入2.00mL超純水和8.00mL甲醇充分搖勻；設(shè)置頻率為50KHz進(jìn)行超聲提取，提取溫度為20℃，超聲提取1h后，移入10mL聚丙烯離心管中，在2500r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

5、實(shí)驗(yàn)步驟

進(jìn)樣前，六通閥1保持在Load狀態(tài)，樣品通過手動(dòng)進(jìn)樣裝載到六通閥1中的定量環(huán)(20μL)中，所注入的多余樣品進(jìn)入廢液；六通閥2保持在Inject狀態(tài)，這樣可以避免系統(tǒng)中可能存在的雜質(zhì)離子在富集柱上的聚集，如圖1。進(jìn)樣完成后，啟動(dòng)切換程序(0min)，切換六通閥1，開始進(jìn)樣，六通閥1處于Inject狀態(tài)，六通閥2仍保持在Inject狀態(tài)，淋洗液將定量環(huán)中的樣品注入依利特Hypersil ODS分析柱中，有機(jī)酸和陰離子在依利特Hypersil ODS分析柱中無保留，而三種植物素在上面有保留，得以分離開來，如圖2。1.1min后，切換六通閥2，使六通閥2處于Load狀態(tài)，富集柱富集有機(jī)酸和陰離子，富集2.5min，如圖3。富集完成后，再次切換六通閥2，使六通閥2重新回到Inject狀態(tài)，富集柱與分析柱IonPac AS11-HC相連，分離富集的有機(jī)酸和陰離子，同時(shí)依利特Hypersil ODS分析柱分離植物素，如圖4。

6、切換時(shí)間的選擇

直接在依利特Hypersil ODS分析柱(C18柱)后面連接電導(dǎo)檢測器(無抑制器連接)和UV-Vis檢測器，觀察10ppm有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，如圖5、6。

為了得到準(zhǔn)確的切換時(shí)間，防止富集時(shí)間過短或過長導(dǎo)致富集不完全，對50ppm標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行一系列的測試。首先在第一個(gè)切換時(shí)間為1.4min的條件下，分別測試3.2min、3.3min、3.4min、3.5min、3.6min、3.7min時(shí)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，得到各個(gè)有機(jī)酸、陰離子的時(shí)間與峰面積關(guān)系曲線，如圖7。由該曲線圖可知，3.6min時(shí)，富集效果最好，因此選擇3.6min為第二個(gè)切換時(shí)間。然后在第二個(gè)切換時(shí)間為3.6min的條件下，分別測試0.8min、0.9min、1.0min、1.1min、1.2min、1.3min、1.4min、1.5min、1.6min時(shí)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，得到各個(gè)有機(jī)酸、陰離子的時(shí)間與峰面積關(guān)系曲線，如圖8。由該曲線圖可知，1.1min時(shí)，富集效果最好，因此選擇1.1min為第一個(gè)切換時(shí)間。

7、線性范圍、重現(xiàn)性和檢出限

在上文的色譜條件下，將0.08mg/L、0.40mg/L、2.00mg/L、10.00mg/L、50.00mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度平衡測定3次，數(shù)據(jù)通過差異性檢驗(yàn)后，取3次所得峰面積的平均值，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，物質(zhì)濃度(X)為橫坐標(biāo)建立13種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍基線噪聲(S/N＝3)計(jì)算最低檢出限，考察重現(xiàn)性時(shí)，以濃度為2.00mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣條件下連續(xù)進(jìn)樣8次(n＝8)，計(jì)算方法精密度。其線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及精密度見表3。

表3線性范圍、重現(xiàn)性及檢測限

8、實(shí)際樣品檢測及方法的回收率

對實(shí)際甘草、白蔻、芡實(shí)樣品按照步驟4所述的前處理后進(jìn)行檢測，并加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表4～6所示，其回收率均符合要求。實(shí)際樣品離子色譜圖見圖11(有機(jī)酸及陰離子色譜圖)高效液相色譜圖見圖12(植物素樣品色譜圖)。

表4甘草樣品加標(biāo)回收率

注：“-”表明未測出。

表5白蔻樣品加標(biāo)回收率

注：“-”表明未測出。

表6芡實(shí)樣品加標(biāo)回收率

注：“-”表明未測出。