本發(fā)明涉及一種可用于白藜蘆醇抗氧化機制作用的評價方法。

背景技術：

衰老的自由基理論認為物質在人體內代謝和產生能量都需要氧參與，但是氧氣在代謝過程中會產生各種自由基。

氧自由基是由氧氣分子衍生的一系列自由基。自由基是含有一個不成對電子的分子或原子團，如一氧化氮自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和脂類自由基。由于自由基外層有一個不成對的電子，能量高，非常活躍，容易與其他物質發(fā)生反應。低濃度的氧自由基在體內具有重要的生物功能，但伴隨氧自由基逐步積累，細胞膜則容易受到其攻擊，甚至可能損傷細胞成分導致疾病的發(fā)生。由此，無論從心腦血管疾病到癌癥，自由基和幾種主要疾病特別是衰老和老年退行性疾病(如老年癡呆癥和帕金森氏癥等)都有密切關系。

白藜蘆醇，其英文名：Resveratrol，化學名：E-3,5,4’-三羥基二苯乙烯，其化學結構式是：

白藜蘆醇是一種非黃酮類的多酚化合物，其化學結構存在順式和反式兩種異構體，自然界中白藜蘆醇主要以反式形式存在，研究表明反式異構體的生理活性強于順式異構體。白藜蘆醇含有三個酚羥基，特別是其中的4-對位羥基是其抗氧化能力的主要來源，其鄰二羥基和乙烯基的存在則有助于形成共軛體系，穩(wěn)定自由基。這樣的分子結構使得其具有很強的還原性。白藜蘆醇可以通過與自由基反應，來降低自由基活性，阻止自由基進一步鏈式反應，達到清除自由基的效果；同時，白藜蘆醇能夠保持谷胱甘肽的還原狀態(tài)，從而抑制氧化自由基的生產，最終達到抗氧化的功能。

因此，白藜蘆醇能保護細胞和器官免受氧化侵害，阻止膽固醇在血管內的沉淀，免于斑點、皺紋、肌膚松弛的困擾，具有預防腫瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。

盡管白藜蘆醇具有抗氧自由基代謝的功能，然而本領域仍然期待有新的有效的抗氧自由基代謝的評價方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的有效的抗氧自由基代謝的評價方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種對白藜蘆醇進行質量檢測的方法。已經出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明，可以使用白藜蘆醇有效地評價抗氧自由基代謝。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

本發(fā)明第一方面提供了白藜蘆醇在制備評價抗氧自由基代謝的試劑中的用途。

本發(fā)明第二方面提供了白藜蘆醇評價抗氧自由基代謝的方法。

根據本發(fā)明第二方面的方法，該方法包括以下試驗項目以評價白藜蘆醇抗氧自由基代謝的效果：過氧化氫對大腸桿菌生長的影響、白藜蘆醇對大腸桿菌生長的保護作用、發(fā)酵罐中的規(guī)范實驗、氧自由基對大腸桿菌代謝流的影響、高濃度白藜蘆醇對大腸桿菌生長的抑制。

進一步的，本發(fā)明第三方面提供了一種對白藜蘆醇進行質量控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法測定白藜蘆醇供試品中白藜蘆醇的含量，該方法包括如下操作：

(1)中國藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進行測定；

(2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.05％酒石酸水溶液以體積比30：70為流動相，檢測波長為306nm；

取系統(tǒng)適用性試驗溶液測定，理論板數按白藜蘆醇峰計應不低于3000，白藜蘆醇與其最接近的雜質峰之間的分離度應大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應大于3.0；

(3)溶液制備：

取白藜蘆醇供試品適量，加流動相溶解并稀釋，制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過濾，作為供試品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供試品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流動相稀釋刻度，搖勻，制成含白藜蘆醇濃度為2μg/ml的溶液，作為對照溶液(即，2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對照品、白藜蘆醇苷對照品適量，用流動相溶解并制成兩種物質濃度均為分別為200μg/ml和2μg/ml的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對照品適量，用流動相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過濾，作為對照品溶液；

(4)測定：

精密量取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定白藜蘆醇主成分的保留時間，并讀取白藜蘆醇峰的峰面積；

精密量取系統(tǒng)適用性試驗溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算理論板數和各峰之間的分離度；

精密量取對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至白藜蘆醇苷保留時間的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質的峰面積；

(5)結果計算：

根據供試品溶液色譜圖中主成分峰面積以及對照品溶液色譜圖中主成分峰面積和對照品溶液主成分濃度，計算供試品中白藜蘆醇的百分含量。

根據本發(fā)明第三方面的方法，其中還包括使用所述高效液相色譜法測定白藜蘆醇供試品中雜質白藜蘆醇苷的含量。具體地說，根據記錄的各色譜圖，當供試品中檢測到存在白藜蘆醇苷時，以對照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0％，計算供試品溶液色譜圖中白藜蘆醇苷相對于白藜蘆醇的百分含量，即得到供試品中的白藜蘆醇苷的含量(即，如果對照溶液主峰面積為100，供試品溶液色譜圖中雜質白藜蘆醇苷的峰面積為115％，則白藜蘆醇苷相對于白藜蘆醇的百分含量，簡稱白藜蘆醇苷含量為1.15％；供試品溶液色譜圖中雜質白藜蘆醇苷的峰面積為87％，則白藜蘆醇苷含量為0.87％)。

根據本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長15～30cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。

根據本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長20～30cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。

根據本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長25cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。

在本發(fā)明上述方法的步驟中，雖然其描述的具體步驟在某些細節(jié)上或者語言描述上與下文具體實施方式部分的實例例中所描述的步驟有所區(qū)別，然而，本領域技術人員根據本發(fā)明全文的詳細公開完全可以概括出以上所述方法步驟。

本發(fā)明的任一方面的任一實施方案，可以與其它實施方案進行組合，只要它們不會出現(xiàn)矛盾。此外，在本發(fā)明任一方面的任一實施方案中，任一技術特征可以適用于其它實施方案中的該技術特征，只要它們不會出現(xiàn)矛盾。

下面對本發(fā)明作進一步的描述。

本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。

紅葡萄酒含有多種活性生物分子，具有抗衰老，抗氧化，防腫瘤和抑菌的生理作用。這些分子中，白黎蘆醇由于具有最為顯著的抗氧化作用而受到人們的關注。已有美國部分廠家將其作為保健品進行銷售。然而要想白黎蘆醇真正有效，安全地，廣泛地在藥品，食品領域發(fā)揮作用，必須清楚地了解其抗氧化的體內過程和分子機制。

為此，我們查閱相關資料，了解衰老的氧自由基理論，認識了白藜蘆醇的分子結構與抗氧化能力。然后設計實驗重現(xiàn)了氧自由基對大腸桿菌的生長抑制，以及白藜蘆醇對這種抑制的緩解與保護。通過一種嶄新的實驗檢測方法，我們觀察到大腸桿菌的生長抑制與恢復都是由其碳中心代謝系統(tǒng)狀態(tài)改變導致的。表明白藜蘆醇對大腸桿菌的保護作用是通過維持代謝系統(tǒng)流量穩(wěn)定這一機制來實現(xiàn)的。然后我們證明大腸桿菌碳中心代謝系統(tǒng)狀態(tài)改變主要是由催化相應反應的酶活變化導致的。進一步地，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇濃度過高時，會導致保護作用的減弱。我們根據白藜蘆醇濃度討論了紅酒飲用的上限。我們的實驗既幫助人們認識了白藜蘆醇，又為飲用紅酒提供了一定的指導意義。

有一個有名的法國悖論，法國人酷好美食，特別是高脂含量的食物，然而其心臟血管疾病的比例卻不高。這個悖論的解釋是因為法國人喜歡以紅酒來搭配美食，而紅酒富含各類活性生物成分，具有抗衰老，抗氧化功能，能預防腫瘤與心血管疾病。其中白藜蘆醇功能很大。

衰老的自由基理論認為，物質在人體內代謝和產生能量都需要氧參與，但是氧氣在代謝過程中會產生各種自由基。自由基是含有一個不成對電子的分子或原子團，例如一氧化氮自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和脂類自由基。由氧氣分子衍生的一系列自由基叫做氧自由基。由于自由基外層有一個不成對的電子，能量高，非?；钴S，容易與其他物質發(fā)生反應。低濃度的氧自由基在體內具有重要的生物功能。但如果氧自由基積累過多，就很容易攻擊細胞膜，還可能損傷細胞成分甚至導致疾病的發(fā)生。從心腦血管疾病到癌癥，自由基和幾種主要疾病特別是衰老和老年退行性疾病(老年癡呆癥和帕金森氏癥等)都有密切關系。

白藜蘆醇(化學名稱為E-3，5，4’-三羥基二苯乙烯)英文名為Resveratrol。它是非黃酮類的多酚化合物，分子式為C14H12O3，相對分子質量為228.25，為白色針狀晶體。白藜蘆醇的化學結構，還分別存在順式和反式兩種異構體，植物中白藜蘆醇主要以反式形式存在，研究表明反式異構體的生理活性強于順式異構體。白藜蘆醇含有三個酚羥基，特別是其中的4-對位羥基是其抗氧化能力的主要來源，其鄰二羥基和乙烯基的存在則有助于形成共軛體系，穩(wěn)定自由基。這樣的分子結構使得其具有很強的還原性達到抗氧化的功能。

因此白藜蘆醇能保護細胞和器官免受氧化侵害，阻止膽固醇在血管內的沉淀，免于斑點、皺紋、肌膚松弛的困擾，還具有預防腫瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。很多科學家都認為白藜蘆醇未來可能作為保健品，或者食品，乃至藥品，在預防和輔助治療疾病中發(fā)揮重要作用，產生廣泛的價值。現(xiàn)在網絡上甚至已經有一些廠家在出售所謂的美國產的白黎蘆醇保健品，如美國美安等品牌的。

然而嚴謹地看，這些行為還是比較倡促的。要想真正將白黎蘆醇有效，安全地，廣泛地應用于藥品，食品領域，必須了解白黎蘆醇抗氧化過程的機制。自由基對生物損害的有哪些靶標，白藜蘆醇對機體保護的又是哪些分子靶標？同時，白黎蘆醇保護作用有著什么樣的劑量關系等等。

本發(fā)明人經過嚴格的科學研究，獲得的研究結果能夠有效地解決現(xiàn)有技術迫切需要解決的問題，體現(xiàn)在：

(1)提供白藜蘆醇在制備評價抗氧自由基代謝的試劑中的用途。

(2)提供白藜蘆醇評價抗氧自由基代謝的方法。示例性的，該方法包括以下試驗項目以評價白藜蘆醇抗氧自由基代謝的效果：過氧化氫對大腸桿菌生長的影響、白藜蘆醇對大腸桿菌生長的保護作用、發(fā)酵罐中的規(guī)范實驗、氧自由基對大腸桿菌代謝流的影響、高濃度白藜蘆醇對大腸桿菌生長的抑制。

(3)提供一種對白藜蘆醇進行質量控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法測定白藜蘆醇供試品中白藜蘆醇的含量。進一步的，該質量控制的方法還包括使用所述高效液相色譜法測定白藜蘆醇供試品中雜質白藜蘆醇苷的含量。

附圖說明

圖1：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入不同濃度雙氧水后的生長曲線

圖2：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長曲線

圖3：13C同位素示蹤確定代謝流量的基本原理

圖4：大腸桿菌三種實驗條件下部分碳中心代謝流量分布值和酶活變化情況

圖5：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長曲線

圖6：高濃度情況時，白藜蘆醇的濃度和保護效果的回歸關系圖

具體實施方式

通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細描述。

實施例1：白藜蘆醇的含量測定及其中雜質的含量測定

目前市售的白藜蘆醇多是從虎杖中提取得到的，盡管進行了分離純化使產物白藜蘆醇含量達90％以上，然而其中通常還會存在少量雜質例如白藜蘆醇苷。而白藜蘆醇苷需要經過一系列的生物化學反應才能形成白藜蘆醇，白藜蘆醇苷的存在對于白藜蘆醇的生物學效應以及白藜蘆醇應用于評價抗氧自由基代謝的方法都會有不良影響。因此，檢測白藜蘆醇產品中的雜質白藜蘆醇苷含量是非常重要的。

邢琪昌等(邢琪昌，等，高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，湖北中醫(yī)藥大學學報，2013，15(3):33)的文獻中介紹了一種使用高效液相色譜法同時測定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，其中使用的HPLC的色譜條件是：色譜柱為Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈-0.03％磷酸水溶液(30：70)，梯度洗脫，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：306nm，進樣量：20μL，理論塔板數以白藜蘆醇計不低于3000，分離度大于1.5。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述方法只適用于中藥材虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量測定，該中藥材虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷二者的含量相差不大甚至白藜蘆醇苷更高；然而，本發(fā)明目前需要測定的是一種白藜蘆醇產品，其中含有90％以上的白藜蘆醇以及少量的白藜蘆醇苷和其它雜質。目標成分是白藜蘆醇，而白藜蘆醇苷為雜質，然而根據上述文獻的方法，其中白藜蘆醇的保留時間大約為6分鐘，而白藜蘆醇苷保留時間大約在18分鐘，相對保留時間大約為3.0。因此使白藜蘆醇苷保留時間提前并且盡量不會造成白藜蘆醇保留時間提前以便獲得足夠的理論塔板數和其它令人滿意的色譜分析指標，是非常必要的。為此，本發(fā)明提供以下方法以測定白藜蘆醇含量：

使用高效液相色譜法測定白藜蘆醇中白藜蘆醇的含量，其包括如下操作：

(1)中國藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進行測定；

(2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.03％磷酸水溶液以體積比30：70為流動相，檢測波長為306nm；

取系統(tǒng)適用性試驗溶液測定，理論板數按白藜蘆醇峰計應不低于3000，白藜蘆醇與其最接近的雜質峰之間的分離度應大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應大于3.0；

(3)溶液制備：

取白藜蘆醇供試品適量，加流動相溶解并稀釋，制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過濾，作為供試品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供試品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流動相稀釋刻度，搖勻，制成含白藜蘆醇濃度為2μg/ml的溶液，作為對照溶液(即，2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對照品、白藜蘆醇苷對照品適量，用流動相溶解并制成兩種物質濃度均為分別為200μg/ml和2μg/ml的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對照品適量，用流動相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過濾，作為對照品溶液；

(4)測定：

精密量取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定白藜蘆醇主成分的保留時間，并讀取白藜蘆醇峰的峰面積；

精密量取系統(tǒng)適用性試驗溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算理論板數和各峰之間的分離度；

精密量取對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至白藜蘆醇苷保留時間的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質的峰面積；

(5)結果計算：

根據供試品溶液色譜圖中主成分峰面積以及對照品溶液色譜圖中主成分峰面積和對照品溶液主成分濃度，計算供試品中白藜蘆醇的百分含量；

當供試品中檢測到存在白藜蘆醇苷時，以對照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0％，計算供試品溶液色譜圖中白藜蘆醇苷相對于白藜蘆醇的百分含量，即得到供試品中的白藜蘆醇苷的含量(即，如果對照溶液主峰面積為100，供試品溶液色譜圖中雜質白藜蘆醇苷的峰面積為115％，則白藜蘆醇苷相對于白藜蘆醇的百分含量，簡稱白藜蘆醇苷含量為1.15％；供試品溶液色譜圖中雜質白藜蘆醇苷的峰面積為87％，則白藜蘆醇苷含量為0.87％)。

以上HPLC方法，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長15～30cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。特別地，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長20～30cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。特別地，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長25cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。

實施例1a：使用上述以乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動相的色譜方法，色譜柱的規(guī)格是：柱長25cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm，結果：白藜蘆醇保留時間為6.23min，白藜蘆醇苷保留時間為18.37min，其相對于白藜蘆醇的相對保留時間為2.95?？梢?，作為雜質的白藜蘆醇苷雜質峰的出峰時間較晚，這是不利于色譜測定的。還發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動相，在進行精密度試驗時，取同一批白藜蘆醇樣品溶液(濃度為0.2mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進樣測定5次，按白藜蘆醇峰面積計算，RSD通常在0.35～0.38％范圍內，顯示白藜蘆醇具有優(yōu)良的精密度；但是，同樣地如果針對系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖中的各雜質峰面積計算時，白藜蘆醇苷的RSD均在1.82～1.96％范圍內，顯示這種雜質的精密度不能滿足要求。在補充試驗中，使用以上以乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動相的色譜方法，測定白藜蘆醇/白藜蘆醇苷二者以1：1的混合物時，白藜蘆醇RSD在0.35～0.37％范圍內，白藜蘆醇苷RSD在0.37～0.41％范圍內，顯示二者均具有優(yōu)良的精密度。申請人推測這種差異可能是由于供試品中兩種物質比例偏差造成的。總之，現(xiàn)有技術無法滿足本發(fā)明供試品測試要求。

實施例1b：根據上述HPLC法，但是流動相中使用的0.03％磷酸水溶液改為等體積的0.05％酒石酸水溶液，其它測定條件不變，色譜柱的規(guī)格是：柱長25cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm，結果：白藜蘆醇保留時間為6.11min，白藜蘆醇苷保留時間為13.62min，其相對于白藜蘆醇的相對保留時間為2.23?？梢?，作為雜質的白藜蘆醇苷雜質峰的出峰時間顯示提前，這可以大大提高分析方法的效率。還發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.03％酒石酸水溶液為流動相，在進行精密度試驗時，取同一批白藜蘆醇樣品溶液(濃度為0.2mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進樣測定5次，按白藜蘆醇峰面積計算，RSD通常在0.33～0.37％范圍內，顯示白藜蘆醇具有優(yōu)良的精密度；還出人意料地發(fā)現(xiàn)，針對系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖中的各雜質峰面積計算時，白藜蘆醇苷的RSD均在0.41～0.54％范圍內，顯示這種雜質白藜蘆醇苷的精密度完全能夠滿足要求。在補充試驗中，使用以上以乙腈-0.05％酒石酸水溶液為流動相的色譜方法，測定白藜蘆醇/白藜蘆醇苷二者以1：1的混合物時，白藜蘆醇RSD在0.36～0.38％范圍內，白藜蘆醇苷RSD在0.35～0.38％范圍內，顯示二者均具有優(yōu)良的精密度。這表明，使用乙腈-0.05％酒石酸水溶液為流動相的色譜方法，不論供試品中兩種物質的比例如何，它們均具有優(yōu)良的色譜測定性能。

以上實施例1a和實施例1b中，白藜蘆醇與其最接近的雜質峰之間的分離度大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應大于4.0，理論板數按白藜蘆醇峰計大于5000。以上實施例1a和實施例1b中，使用的色譜柱的規(guī)格是：柱長25cm、柱內徑4.6mm、填料粒徑5μm。本發(fā)明人在補充試驗中發(fā)現(xiàn)，當改用柱長15cm、20cm、或30cm，但柱內徑和填料粒徑仍分別為4.6mm和5μm，都能獲得與上述實施例1a和實施例1b類似的結果，這表明柱長不影響測定。

實施例2：氧自由基對生物體的影響

1、過氧化氫對大腸桿菌生長的影響

為了檢驗氧自由基對生物的影響，我們選取了大腸桿菌作為實驗的“被試”，雙氧水作為氧自由基的代表。大腸桿菌是一種很常見的微生物，由于被科學家研究得比較多，以它作為實驗是有很好的代表性。

我們先是在4個500mL的三角搖瓶，利用250mL無機M9培養(yǎng)基對大腸桿菌JM101菌株進行培養(yǎng)。當培養(yǎng)基OD600值達到0.3后，分別加入終濃度為0.005％，0.01％，0.015％的雙氧水(H2O2，下文正文使用雙氧水，圖表使用H2O2)，然后記錄其OD值變化情況。這里OD600指的是某種溶液在600nm波長處的吸光值。這樣的實驗重復三次，實驗數據用Excel畫成了圖1。從圖中，可見加入雙氧水的搖瓶里的大腸桿菌的生長，在最開始的30分鐘里明顯受到遏制；之后大腸桿菌的生長也變慢了許多。這充分說明了，大腸桿菌的正常生長在受到雙氧水脅迫后受到很大的抑制。圖1是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入不同濃度雙氧水后的生長曲線。

2、白藜蘆醇對大腸桿菌生長的保護

接下來需要檢驗白藜蘆醇是否能夠對雙氧水抑制大腸桿菌生長起到一定的影響。這一次的實驗設置和之前一樣，但是所有培養(yǎng)基中都添加0.015％的雙氧水。我們又在其中分別加入了25uM、50uM、100uM的白藜蘆醇。這樣可以比較不同濃度的白藜蘆醇對大腸桿菌的保護作用。將得到的結果畫為圖2，可以發(fā)現(xiàn)當白藜蘆醇的濃度在一定范圍內變化時，雙氧水對大腸桿菌正常生長的阻遏作用明顯變小了，說明白藜蘆醇效果優(yōu)異。圖2是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長曲線。

3、發(fā)酵罐中的實驗結果

之前的實驗是在搖瓶中進行的，而搖瓶培養(yǎng)里的各種物質的濃度是在發(fā)生變化的，所以不是一個穩(wěn)定的條件，如果以后要說明深入問題可能存在困難。所以，想到用發(fā)酵罐進行實驗。在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，可以使得體系內的各種參數都恒定。

在發(fā)酵罐上進行了與搖瓶中類似的實驗。在發(fā)酵罐上為了便于比較，我們將不同實驗的洗脫速率都設置為恒定值，這也就決定了發(fā)酵罐中細菌的生長速率是恒定的。在發(fā)酵罐中，反映大腸桿菌的生長特性的值變成生物質比合成速率，也就是培養(yǎng)基中每克葡萄糖能夠生成多少克的生物質。我們測量了大腸桿菌JM101菌株，在正常培養(yǎng)基和含雙氧水培養(yǎng)基中的生長特性。在雙氧水培養(yǎng)實驗中，雙氧水的濃度被精細地選擇在0.2％(V/V)，在此濃度下，細胞內環(huán)境受到足夠的擾動而同時細胞可以維持其生長速度大于等于替換速率(0.2h-1)。用于抗氧化的白藜蘆醇的濃度則選擇為20uM。我們的結果表明，在發(fā)酵罐中生物質合成量在加入雙氧水后明顯下降，大腸桿菌的生長同樣受到雙氧水很大的抑制。白藜蘆醇則可以保護大腸桿菌，使得其所受氧化劑的影響變小了。具體結果見下表：

表：發(fā)酵罐中脅迫實驗的基本參數

4、氧自由基對大腸桿菌代謝流的影響

以上實驗讓人們對氧自由基和白藜蘆醇對大腸桿菌的影響都有了非常直觀的感受。當然，我們更想了解氧自由基為什么會對大腸桿菌的生長產生影響，也就是這些參數變化的更深層次的原因。細胞攝取諸如葡萄糖等糖類，將這些糖類分解成更小的分子，利用它們來構建DNA、蛋白質、細胞膜和驅動細胞運行的能量分子。整個的過程稱作為代謝，它使得細胞能夠執(zhí)行各種功能以及生長和增殖，由此創(chuàng)造了整個生物體。

在代謝系統(tǒng)中，三羧酸循環(huán)是機體將糖或其他物質氧化而獲得能量的最有效方式；同時，三羧酸循環(huán)是糖、脂和蛋白質三大類物質代謝與轉化的樞紐。它的活性大小，直接決定了細胞的生長狀態(tài)。其具體生物化學反應如圖3所示，這些生物化學反應組合起來，形成一個開放的循環(huán)。三羧酸循環(huán)的運行就是各個生化反應的一個接力賽，各個反應將相應的產物傳遞給下一步反應。圖3是13C同位素示蹤確定代謝流量的基本原理。

氧化劑對大腸桿菌生長的影響，應該會和對大腸桿菌三羧酸循環(huán)代謝流量的影響有關。于是，之前的問題就變成了在脅迫與保護情況下，三羧酸循環(huán)各個反應的流量是否受到影響。然而，通過某個反應的流量本身是一個很動態(tài)的概念，不像物質的量，濃度等比較容易測定。真要測量這個東西，感覺還是個問題。通過13-C同位素示蹤來檢測代謝流量大小的方法。這種方法在原理上有些巧妙，它是利用混合了不同比例穩(wěn)定同位素(13C，12C)的葡萄糖來喂養(yǎng)大腸桿菌，當這種葡萄糖進入大腸桿菌后，同位素分子會隨著各個生化反應而生產各種生物分子，由于不同的化學反應對分子的碳骨架的處理不同，導致不同的流量對應不同的同位素標記狀態(tài)，通過測定這些分子碳骨架的穩(wěn)定同位素標記狀態(tài)，我們可以反推出這些流量來。

比如圖3中一個含有3個碳的分子m，有50％全為13C標記，50％則全為12C。這種分子會有兩種下游的反應，一是經過A反應生成a，這個反應中分子碳骨架沒有改變，然后由a再生產下游的n；另一個是經過B反應，從一個3碳的分子被拆成一個2碳分子b和一個一碳分子c。而a可以通過反應C生成分子n，而b和c則可以通過反應D結合生產分子n。但是，反應C和反應D來的n內部的同位素標記狀態(tài)卻有很大區(qū)別。單純從反應C來的，其同位素分布狀態(tài)就如圖3x所示，單純從反應D來的，其同位素分布狀態(tài)就如圖3z所示。而一半來自反應C，一半來自反應D的n，則如圖3y所示。因此，我們如果測定了分子n的同位素標記狀態(tài)，我們就可以反推出反應C和D的值。這就是利用13C同位素示蹤方法檢測代謝流得基本原理。而檢測分子的同位素標記狀態(tài)則可以使用質譜，因為13C與12C的原子質量不一樣，相同分子如果含有的13C數量不一樣，在質譜上會形成不同的質譜峰。

借助實驗室的一系列的技術和儀器。我們又開始了我們的實驗。這一次我們一開始就使用了發(fā)酵罐來進行培養(yǎng)，使得整個培養(yǎng)體系處于一個恒定狀態(tài)。接下來，我們就開始測量之前四種條件下大腸桿菌三羧酸循環(huán)各反應的流量值。

首先收集發(fā)酵罐里面所有的培養(yǎng)基，通過離心的方式使大腸桿菌菌體與培養(yǎng)基分離。菌體再用Tris-HCl洗一到兩次，然后用6M的HCl重懸，并高溫進行水解，使細菌菌體內的蛋白質分解成游離的氨基酸。

標準水解方法是在110℃下水解12-24h，我們的產物放在105℃水解時，有不少的沉淀最后沒有能夠溶解，而且時間稍長后變黑。但一般存度稍高的蛋白質水解并不會出現(xiàn)黑褐色，因此估計是細胞內其他物質被碳化造成的，尤其是細胞所含的多糖不易溶解，而產生黑色。當然其中肯定有不少氨基酸被氧化，至于氧化的程度則不能完全確定。為此，將水解的溫度先降低到90℃，先水解4-5個小時(并且將菌液濃度降低)，等大部分可見沉淀溶解后，調到105℃水解18個小時。

將水解后的大腸桿菌樣品用專門的衍生化試劑處理后，將樣品交送入氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析，得到三羧酸循環(huán)所生成的各個氨基酸分子的同位素標記狀態(tài)。然后，將這些分子的同位素標記狀態(tài)輸入到，實驗室自己開發(fā)的優(yōu)化軟件中，通過對13C標記狀態(tài)進行擬合，軟件給出了代謝流量的最優(yōu)估計值。

結果如圖4所示。從圖4的結果可以看到，暴露在雙氧水之下后三羧酸循環(huán)的主要限速酶代謝流量值發(fā)生了明顯的變化，異檸檬酸脫氫酶在正常的時候值為0.23，加入雙氧水后，降低為0.16，在有白藜蘆醇保護時回升至0.1。a-酮戊二酸脫氫酶在正常的時候值為0.11，加入雙氧水后，降低為0.02，在有白藜蘆醇保護時回升至0.06。這兩個酶流量的變化和大腸桿菌生長狀態(tài)的變化非常一致。圖4是大腸桿菌三種實驗條件下部分碳中心代謝流量分布值和酶活變化情況。紅色小方框中為代謝流量或者酶活在3種情況下的對比。1代表對照組，2代表雙氧水脅迫組，3代表加入白藜蘆醇的保護組。其中BIOMASS表示生物質。

從結果中可以看到，加入雙氧水后，三羧酸循環(huán)流量降低，大腸桿菌生長效率受到抑制；當加入白藜蘆醇后，三羧酸循環(huán)流量有所回升，而相應地大腸桿菌生長抑制也得到緩解。因此，這充分說明白藜蘆醇對大腸桿菌生長的影響是通過對中心碳代謝流量的影響來達到得。

5、大腸桿菌代謝流變化的原因探究

這些代謝系統(tǒng)的改變又是由什么導致的呢？代謝反應都是由生物酶來催化的，而大部分的酶就是蛋白質的一種。代謝反應的速率的變化，會不會與酶的活力變化有關呢？

受這個思路啟發(fā)，我們想測試幾種條件下的酶活。由于之前代謝流的測定圍繞著三羧酸循環(huán)進行，我們選定了異檸檬酸脫氫酶和□-酮戊二酸脫氫酶。酶活的測量原理相對比較簡單，首先要將代測反應耦聯(lián)一個能產生發(fā)色基團的反應。然后就是在單位時間內，測定酶所催化生成的發(fā)色基團的多少來代表酶活。酶活檢測的結果和流量結果一樣畫在圖5。

我們把酶活檢測的結果與代謝流量的變化情況作了一個對比，如圖5。這個圖很能說明問題，可以看到酶活變化和代謝流量值變化的方向是一致的，同時變化幅度也很相關，酶活的變化大的時候，代謝流量的變化也很大。因此，酶活變化和代謝流量值變化具有非常強的相關性。這也表明，代謝反應的速率的變化有很大程度來自酶的活力變化。圖5是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長曲線。

6、白藜蘆醇對大腸桿菌生長的抑制

白藜蘆醇雖然能有效地抗氧化，但是如果它本身濃度過高，會不會有相反的效果呢？我們又重復了之前的實驗，但是換成了500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜蘆醇。結果當白藜蘆醇濃度過大時，在濃度超過10mM時，大腸桿菌生長抑制反而開始加重，繼續(xù)增大時，抑制也很明顯。表明當濃度過大時，白藜蘆醇本身也是對大腸桿菌生長有抑制作用。我們將這些數據500uM，2.5mM，10mM，50mM濃度的數據畫成了圖5。這表明白藜蘆醇對生長的保護是有一定的限度，任何事物都有限度，這就是所謂“過猶不及”的道理。

7、從白藜蘆醇討論紅酒飲用上限

我們知道了白藜蘆醇的抗氧化性可以保護細胞在生長時免受氧化劑的威脅，但是白藜蘆醇濃度過高后，這種效果就明顯減弱了。這是不是說，紅酒喝太多了也沒有效果了呢？我們覺得可以從我們的實驗中做一些推導。我們覺得首先要計算出白藜蘆醇失效的最大濃度，這可以通過之前所進行的500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜蘆醇數據進行推導。我們將在圖5中0.015％雙氧水刺激時，加入白藜蘆醇后，大腸桿菌OD值的回升均值作為白藜蘆醇對細胞的保護作用的指標。這樣我們手里，有了兩組數據，一個組是白藜蘆醇的濃度，一組是這些濃度對應的保護指標。我們將白藜蘆醇的濃度取了底為10的對數后，根據兩組數據進行了線性回歸，得到了線性擬合方程Y＝0.633-0.119*X。擬合圖如圖6，Y軸是白藜蘆醇濃度的對數值，X軸是這些濃度對應的保護指標。將這個方程外推到保護指標為零，得到白藜蘆醇失效的濃度為0.2M。圖6是高濃度情況時，白藜蘆醇的濃度和保護效果的回歸關系圖。

但這只是針對體外培養(yǎng)的細菌，而對真實的吸收到人體的情況又不一樣。為了用一個較為準確的人體模型模擬來估計上限，我們查閱了好多資料，找到了一些有用的參數，

1)在刊登于《中外葡萄與葡萄酒》雜志上的“干紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量與分布”(《中外葡萄與葡萄酒》，2004(2):8-10)一文中，可以找到紅酒中白藜蘆醇的含量，一般在5-30uM之間。我們取15uM作為代表值X。

2)在第四軍醫(yī)大梁力的碩士學位論文“乙?；邹继J醇和白藜蘆醇在SD大鼠體內藥代動力學研究”中，可以找到大鼠以438um/kg的量口服白藜蘆醇后的血藥最高峰值為12uM，吸收效率為0.0273/kg我們以此代替人的吸收效率。那么，一個質量為Y kg個人的效率為0.0273/Y。

3)我們以剛剛推定的白藜蘆醇失效的濃度為0.2M為基準，那么要想使得白藜蘆醇的血藥濃度達到這一標準，需要飲用的紅葡萄酒體積為

V＝(0.2*Y/0.0273)/X

假設一個人體60KG，那么可以得到白藜蘆醇失效的所需紅酒量322344.25L,顯然這個濃度遠遠高于正常人能夠飲用的量。同時，在這個計算中還未考慮到白藜蘆醇吸收后，經過首關效應被代謝為其他衍生物；真核細胞存在線粒體保護大三羧酸循環(huán)等作用。故而，日常生活中，除開紅酒中的其他物質如酒精，單就白藜蘆醇而言，我們可以放心大膽飲用紅酒，而不必擔心白藜蘆醇的作用減弱。當然，因為由于以下一些原因，如我們的對象是大腸桿菌；白藜蘆醇在人體內可能會被代謝成其他成分；血液濃度還和細胞外濃度不完全相同等，真實情況和我們的模型很有差距。

8、實驗總結：

大腸桿菌在遭受一定濃度的氧自由基(本文中為過氧化氫)脅迫時，其生長會受到明顯抑制。這種現(xiàn)象無論是在搖瓶中，還是在發(fā)酵罐中都很明顯，所以氧自由基對生物是有害的；

白藜蘆醇能緩解，減輕氧自由基對大腸桿菌的生長抑制和影響。而且，這些保護作用存在一定的劑量依賴現(xiàn)象。也就是說在我們的實驗濃度范圍內，氧自由基濃度越大，則抑制現(xiàn)象就越嚴重；而白藜蘆醇濃度越高，則其表現(xiàn)出來的保護作用也就越強；

大腸桿菌在脅迫與保護時所產生的生長的抑制與恢復現(xiàn)象都與大腸桿菌的代謝狀態(tài)緊密相關，大腸桿菌中心碳代謝系統(tǒng)三羧酸循環(huán)中通過異檸檬酸脫氫酶和a-酮戊二酸酶的流量在加入氧自由基或者白藜蘆醇后都有明顯變化。中心碳代謝系統(tǒng)的變化可能是大腸桿菌生長抑制與恢復的主要原因；

在上述實驗中，大腸桿菌的中心碳代謝酶催化流量的變化與該酶的酶活變化在方向上完全一致，在數值上存在很大的相關性。酶的變化可以解釋代謝流量的變化；

當白藜蘆醇濃度超過一定限度，數量級發(fā)生變化后，濃度越高，起保護作用反而越弱，達到極限后，其保護作用明顯減弱到不明顯。我們對白藜蘆醇濃度增長與保護作用變化之間的定量關系進行了擬合，得到了回歸曲線，并將該曲線外推到零點，得到了白藜蘆醇完全失活的濃度值。通過假定的模型，計算出了，白藜蘆醇完全失活時對應的紅酒的量，遠高于日常紅酒飲用量。結果說明，我們無需擔心紅酒喝多了白藜蘆醇沒有效果。

研究意義：通過對白黎蘆醇的實驗探究，發(fā)現(xiàn)了白黎蘆醇抗氧化的機理，也意識到白黎蘆醇的藥用價值。特別是，我們對白藜蘆醇濃度增長與保護作用變化之間的定量關系進行了擬合，得到了回歸曲線，并將該曲線外推到零點，從而得到了白藜蘆醇完全失活的濃度值。通過文獻挖掘假定的人體吸收和稀釋模型，計算出了白藜蘆醇完全失活時對應的紅酒的量，遠高于日常紅酒飲用量，說明，我們無需擔心紅酒喝多了白藜蘆醇沒有效果。這對我們飲用紅酒具有參考價值。

當然，由于所做實驗有一定的局限性，我們只針對大腸桿菌進行研究；白藜蘆醇在人體內可能會被代謝成其他成分；血液濃度還和細胞外濃度不完全相同等。真實情況和我們的模型很有差距。但是在進一步的研究中，用該課題所提供的研究方法，可對不同的自由基，不同動物細胞，不同的酶的代謝過程等多方面進行研究是否同樣能達到防止代謝過程被破壞的作用。另外，一般事物具有兩面性，對于白黎蘆醇是否有毒性，其毒害作用也將納入今后的研究方向。明確白黎蘆醇的作用機理，為我們今后更加全面，更加深刻認識這一物質奠定了基礎，也為實現(xiàn)生產藥用白黎蘆醇提供理論指導。