本發(fā)明涉及蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾方法及免疫滲濾裝置。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌與肝炎、肝硬變等良性肝病產(chǎn)生的甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)在其糖鏈結(jié)構(gòu)上存在很大差異，即與良性肝病相比，肝癌產(chǎn)生的AFP，其巖藻糖指數(shù)要高得多。巖藻糖具有與小扁豆素結(jié)合的特性。AFP根據(jù)其(巖藻糖基)對小扁豆凝集素的親和力不同可以分為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中AFP-L1主要來自于良性肝病，AFP-L2主要來源于孕婦，而AFP–L3是甲胎蛋白的巖藻糖糖基化形式，主要來源于肝細(xì)胞性肝癌(HepatoCellular Carcinoma，HCC)。2005年FDA正式批準(zhǔn)將AFP-L3作為原發(fā)性肝癌的標(biāo)志物之一。AFP-L3在肝癌的早期診斷、鑒別診斷、療效評估和預(yù)后監(jiān)測等方面均具有較高的特異性與敏感性。

巖藻糖為甲基化六碳糖，存在于組織及血清等多種糖蛋白糖鏈中，稱為蛋白結(jié)合巖藻糖(protein-bound fucose，P-bf)。AFP碳水化合物鏈上存在巖藻糖殘基，此種異質(zhì)體稱為巖藻糖基化AFP(FucAFP)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用意義，在肝癌診斷和預(yù)后應(yīng)用中可以作為一項(xiàng)重要的指標(biāo)。

傳統(tǒng)的血清巖藻糖蛋白的分離方法，包括親和交叉免疫電泳技術(shù)、親和印跡法、親和層析法、“雙位點(diǎn)夾心”酶聯(lián)免疫吸附法、LiBASys測定儀、i30檢測系統(tǒng)技術(shù)及熱景生物的糖基捕獲離心柱前處理技術(shù)。其中植物凝集素親和免疫電泳技術(shù)和i30檢測系統(tǒng)技術(shù)要求高、操作繁瑣、試劑昂貴，限制了其推廣應(yīng)用。而糖基捕獲離心柱，由于樣本處理和檢測分開進(jìn)行，增加了操作的繁瑣性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對目前巖藻糖蛋白分離方法中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾方法及免疫滲濾裝置，所述方法和免疫滲濾裝置尤其適用于檢測生物樣品中的巖藻糖基化甲胎蛋白，并對各種巖藻糖基化蛋白具有通用性。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾方法，其包括如下步驟：

(1)將甲胎蛋白抗原和小扁豆素復(fù)合于微孔濾膜上；

(2)滴加血清樣品到微孔濾膜上，使樣品中的巖藻糖基化甲胎蛋白與微孔濾膜上的小扁豆素結(jié)合；

(3)向微孔濾膜上滴加酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體，并加入顯色底物，得到檢測結(jié)果。

本發(fā)明是利用微孔濾膜，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血清樣本中多種抗原或抗體的一次性同時(shí)檢測，其檢測過程只需3-5min即可完成。相比采用蛋白芯片，本發(fā)明提供的免疫滲濾檢測方法，具有檢測時(shí)間短、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的免疫滲濾方法是將捕獲蛋白固定在硝酸纖維素膜上，帶負(fù)電荷的抗體與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起；并且，通過采用HRP和顯色底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生蘭褐色穩(wěn)定產(chǎn)物，該產(chǎn)物能夠長時(shí)間穩(wěn)定存在，不會(huì)隨著時(shí)間的延長逐漸變?nèi)趸蛳В^察結(jié)果不會(huì)因?yàn)闀r(shí)間段的不同產(chǎn)生誤差，結(jié)果穩(wěn)定性好；再有，本發(fā)明的免疫滲濾方法不需要任何儀器進(jìn)行結(jié)果掃描分析，可在5min之內(nèi)肉眼觀察判斷結(jié)果；其次，本發(fā)明的免疫滲濾方法只需在室溫完成，不需要溫箱。

本發(fā)明提供的免疫滲濾檢測方法，適用于檢測生物樣品中的巖藻糖基化甲胎蛋白，并對各種巖藻糖基化蛋白具有通用性。

本發(fā)明中的巖藻糖基化甲胎蛋白是指甲胎蛋白碳水化合物鏈上存在巖藻糖殘基的異質(zhì)體。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)所述甲胎蛋白抗原為原核表達(dá)人甲胎蛋白抗原，也可選擇真核表達(dá)甲胎蛋白抗原，在此不做特殊限定。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體為兔源抗體。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述酶為辣根過氧化物酶(HRP)，也可為堿性磷酸酶(ALP)，其用于實(shí)現(xiàn)酶底物顯色。

根據(jù)本發(fā)明，所述檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾方法可以包括如下步驟：

(1)將甲胎蛋白抗原和小扁豆素復(fù)合于微孔濾膜上；

(2)滴加10-15μL的血清樣品到微孔濾膜上，使樣品中的巖藻糖基化甲胎蛋白與微孔濾膜上的小扁豆素結(jié)合；然后用封閉液洗滌，去除非特異性結(jié)合物；

(3)向微孔濾膜上滴加酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體，孵育3-5s后用封閉液洗滌，去除非特異性結(jié)合物，加入顯色底物顯色液；

陽性血清時(shí)，甲胎蛋白抗原和巖藻糖基化甲胎蛋白的檢測區(qū)域顯示藍(lán)色，陰性血清時(shí)，甲胎蛋白抗原檢測區(qū)域顯示藍(lán)色，巖藻糖基化甲胎蛋白的檢測區(qū)域不顯色。陰性對照無論是陽性血清和陰性血清都不顯色。

示例性地，所述免疫滲濾方法具體可以包括如下步驟：

樣品檢測：

將待測血清樣品稀釋后滴加在含有微孔濾膜的檢測區(qū)上，孵育后，用PBST洗滌檢測區(qū)，去除非特異結(jié)合物；加入用PBS稀釋的HRP標(biāo)記的AFP抗體，孵育后，用PBST洗滌，去除非特異結(jié)合物；加入HRP底物顯色液，肉眼觀察結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明，所述孵育是指室溫孵育3-5s，例如3s、3.5s、4s、4.5s或5s。

根據(jù)本發(fā)明，所述檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾方法中，可以在如下免疫滲濾裝置中進(jìn)行，但并非僅限于此。

一種檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾裝置，其含有微孔濾膜，在微孔濾膜基質(zhì)上設(shè)置有至少1個(gè)檢測區(qū)，所述檢測區(qū)內(nèi)設(shè)有陽性對照檢測亞區(qū)、血清巖藻糖蛋白檢測亞區(qū)和陰性對照區(qū)，其中陽性對照檢測亞區(qū)固定有甲胎蛋白，血清巖藻糖蛋白檢測亞區(qū)固定有小扁豆素，陰性對照區(qū)固定有牛血清白蛋白；同一檢測亞區(qū)內(nèi)的檢測斑上的物質(zhì)濃度相同。檢測亞區(qū)和對照區(qū)分別至少包括1個(gè)檢測斑，例如可以是2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)等。

本發(fā)明中所述免疫滲濾裝置由韌性好的塑料制品、紙質(zhì)吸水材料和硝酸纖維素膜組成，能夠承受撞擊和碰撞，不容易破碎。

本發(fā)明中，所述微孔濾膜基質(zhì)上具有1個(gè)檢測區(qū)，所述檢測亞區(qū)具有1個(gè)檢測斑，所述陽性對照區(qū)和陰性對照區(qū)各具有1個(gè)對照斑；所述甲胎蛋白為原核表達(dá)人甲胎蛋白。

本發(fā)明的免疫滲濾裝置還包括辣根過氧化酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體和顯色底物液；所述辣根過氧化酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體為兔源抗體；所述免疫滲濾裝置還包括用于洗滌和稀釋的PBST和PBS封閉液。

本發(fā)明優(yōu)選采用具有微孔濾膜的免疫滲濾裝置，其與蛋白芯片相比，具有檢測時(shí)間短、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可將檢測過程控制在3-5min。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種檢測血清巖藻糖蛋白的免疫滲濾裝置，所述免疫滲濾裝置的微孔濾膜基質(zhì)上包括至少1個(gè)檢測區(qū)，所述檢測區(qū)內(nèi)設(shè)有陽性對照檢測亞區(qū)、血清巖藻糖蛋白檢測亞區(qū)和陰性對照區(qū)，其中陽性對照檢測亞區(qū)固定有甲胎蛋白，血清巖藻糖蛋白檢測亞區(qū)固定有小扁豆素，陰性對照區(qū)固定有牛血清白蛋白；同一檢測亞區(qū)內(nèi)的檢測斑上的物質(zhì)濃度相同。

根據(jù)本發(fā)明，所述檢測亞區(qū)至少包括1個(gè)檢測斑，例如可以是2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)等。

根據(jù)本發(fā)明，所述微孔濾膜基質(zhì)上具有1個(gè)檢測區(qū)，所述檢測亞區(qū)具有1個(gè)檢測斑，所述陽性對照區(qū)和陰性對照區(qū)各具有1個(gè)對照斑。

根據(jù)本發(fā)明，所述甲胎蛋白為原核表達(dá)人甲胎蛋白。

根據(jù)本發(fā)明，所述免疫滲濾裝置還包括辣根過氧化酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體和顯色底物液。

根據(jù)本發(fā)明，所述辣根過氧化酶標(biāo)記的甲胎蛋白多克隆抗體為兔源抗體。

根據(jù)本發(fā)明，所述免疫滲濾裝置還包括用于洗滌和稀釋的PBST和PBS封閉液。

本發(fā)明還提供了免疫滲濾裝置在非診斷和/或非治療目的血清巖藻糖蛋白檢測中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明通過利用微孔濾膜，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血清樣本中多種抗原或抗體的一次性同時(shí)檢測，本發(fā)明提供的免疫滲濾檢測方法，能夠準(zhǔn)確地檢測血清巖藻糖蛋白，具有檢測時(shí)間短、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)；

(2)本發(fā)明提供的檢測方法和免疫滲濾裝置需要的原材料和儀器設(shè)備成本都大為減少，免疫滲濾的裝置為紙質(zhì)和塑料制品，成本很低，大約1元人民幣，不需要任何儀器設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)流程的準(zhǔn)備、孵育、結(jié)果掃描，大大降低了檢測成本和費(fèi)用；

(3)本發(fā)明的免疫滲濾方法在時(shí)間上與其他方法進(jìn)行比較，ELISA檢測至少需要3h；蛋白芯片檢測需要1.5h；而本發(fā)明僅需3-5min，檢測時(shí)間上會(huì)大大縮短。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的免疫滲濾裝置示意圖，其中，1-蓋，2-微孔濾膜，3-紙質(zhì)吸水材料，4-塑料底。

圖2是本發(fā)明的免疫滲濾方法的結(jié)果示意圖，其中，1-3是陽性結(jié)果，NC膜上方的陽性對照檢測斑呈現(xiàn)蘭褐色陽性信號，中間的小扁豆素檢測斑呈現(xiàn)蘭褐色陽性信號，下方的BSA對照斑不顯色；4-5是陰性結(jié)果，NC膜上方的陽性對照檢測斑呈現(xiàn)蘭褐色陽性信號，中間的小扁豆素檢測斑和下方的BSA對照斑不顯色。

圖3是制備免疫滲濾硝酸纖維素膜的示意圖，陽性對照區(qū)固定AFP，中間檢測區(qū)固定小扁豆素，陰性對照區(qū)固定BSA。

下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

如圖1所示，其是本發(fā)明中免疫滲濾裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，該免疫滲濾裝置具有微孔濾膜，其由上到下依次設(shè)置為蓋1、微孔濾膜2、紙質(zhì)吸水材料3和塑料底4。在組裝時(shí)，事先將微孔濾膜裁剪成直徑大約1.5cm的圓形，將紙質(zhì)吸收材料3放在塑料底4內(nèi)，紙質(zhì)吸水材料上面中央放置預(yù)先裁剪的微孔濾膜2，然后蓋上蓋1。

本發(fā)明中所用到的微孔濾膜可以是硝酸纖維素膜，本發(fā)明采用GE Healthcare RPN303B；紙質(zhì)吸水材料可以是吸水紙；蓋和底均采用塑料制品。

如圖2所示，其示出了采用本發(fā)明的免疫滲濾方法的結(jié)果示意圖，陽性血清時(shí)(圖2中的1-3)，陽性對照和巖藻糖基化甲胎蛋白的檢測區(qū)域均顯示藍(lán)色；如果是陰性血清時(shí)(圖2中的4-6)，巖藻糖基化甲胎蛋白的檢測區(qū)域則不顯色，陽性對照顯示藍(lán)色；無論陽性和陰性血清，陰性對照都不顯色。

圖3是制備免疫滲濾硝酸纖維素膜的示意圖，陽性對照區(qū)固定AFP，中間檢測區(qū)固定小扁豆素，陰性對照區(qū)固定BSA。

為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1免疫滲濾裝置的制備及使用流程

實(shí)驗(yàn)所用試劑和儀器：原核表達(dá)AFP(美國abcam公司)；小扁豆素(Sigma公司)；硝酸纖維素膜(GE Healthcare)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔源抗體(美國abcam公司)；HRP顯色底物液(美國Millipore公司)。

PBS配方：氯化鈉(NaCl)8g，氯化鉀(KCl)0.2g，磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)1.44g，磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)0.24g，調(diào)pH值至7.4，定容至1L。

PBST配方：PBS，1L+Tween-20，1mL。

硝酸纖維素膜(GE Healthcare)，每個(gè)免疫滲濾裝置包含1個(gè)檢測區(qū)，每個(gè)檢測區(qū)可檢測一份血清，一次檢測AFPL3標(biāo)志物。

每個(gè)檢測區(qū)域內(nèi)，將鼠源原核表達(dá)人AFP(美國abcam公司)、小扁豆素Sigma公司)各0.5μL依次點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，點(diǎn)樣濃度AFP 0.5mg/mL，小扁豆素4mg/mL；10％牛血清白蛋白(BSA)作為陰性對照，0.5μL點(diǎn)成對照斑。

免疫滲濾操作流程：

用制備好的免疫滲濾檢測健康對照組和肝癌實(shí)驗(yàn)組動(dòng)態(tài)血清標(biāo)本中AFP L3腫瘤標(biāo)志物。

室溫條件下，用血清樣本10μL滴加在免疫滲濾裝置的膜片上，利用小扁豆素和巖藻糖結(jié)合的特性，使小扁豆素與血清中的巖藻糖結(jié)合形成小扁豆素抗原復(fù)合物；3秒鐘后，血清液體滲透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗滌，去除非特異結(jié)合，反復(fù)3次。再加入PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔源一抗，兔源抗體與血清中的AFP抗原結(jié)合，小扁豆素-(AFP)巖藻糖-兔源辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體復(fù)合物；兔源抗體同時(shí)與固定膜上的陽性對照AFP結(jié)合，AFP-兔源辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。3秒鐘后，血清液體滲透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗滌，去除非特異結(jié)合，反復(fù)3次，加入HRP顯色底物，避光1分鐘，滴加10μL PBST洗滌。陽性血清檢測斑呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。

實(shí)施例2

用制備好的免疫滲濾檢測健康對照組和肝癌實(shí)驗(yàn)組動(dòng)態(tài)血清標(biāo)本中AFP L3腫瘤標(biāo)志物。

室溫條件下，用血清樣本2.5μL稀釋4倍后，滴加在免疫滲濾裝置的膜片上，利用小扁豆素和巖藻糖結(jié)合的特性，使小扁豆素與血清中的巖藻糖結(jié)合形成小扁豆素抗原復(fù)合物；5秒鐘后，血清液體滲透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗滌，去除非特異結(jié)合，反復(fù)5次。再加入PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔源一抗，兔源抗體與血清中的AFP抗原結(jié)合，小扁豆素-(AFP)巖藻糖-兔源辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體復(fù)合物；兔源抗體同時(shí)與固定膜上的陽性對照AFP結(jié)合，AFP-兔源辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。5秒鐘后，血清液體滲透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗滌，去除非特異結(jié)合，反復(fù)5次，加入HRP顯色底物，避光1分鐘，滴加10μL PBST洗滌。陽性血清檢測斑呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。

綜上可以看出，本發(fā)明利用微孔濾膜，在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血清樣本中多種抗原或抗體的一次性同時(shí)檢測，其檢測過程只需3-5min即可完成，具有檢測時(shí)間短、靈成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。