本發(fā)明涉及一種利用納米二氧化錳和納米銀顆粒構(gòu)建的病原體檢測(cè)傳感器，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

如何實(shí)現(xiàn)病原體的快速的靈敏的檢測(cè)仍然是科研人員不斷追求的目標(biāo)。近幾十年來(lái)，科研人員發(fā)展了大量用于病原體檢測(cè)的方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA傳感器、比色分析法和質(zhì)譜分析法。在這些方法中，當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)物出現(xiàn)時(shí)，基于肉眼直接觀測(cè)顏色變化的簡(jiǎn)便直接的可視化分析方法得到了廣泛和持續(xù)性的關(guān)注。目前在臨床的檢測(cè)中最廣泛應(yīng)用的是基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)所設(shè)計(jì)的比色分析檢測(cè)。但是基于ELISA的測(cè)定卻存在著很多的問(wèn)題，中等程度的敏感性使得測(cè)定物必須達(dá)到臨界閾值濃度才能夠進(jìn)行檢測(cè)，這就限制了其在病原體的早期檢測(cè)上的應(yīng)用。另外，ELISA測(cè)定方法局限于天然酶的應(yīng)用范圍存在著嚴(yán)重的缺陷，例如，天然酶較難大批量生產(chǎn)，在某些環(huán)境如強(qiáng)酸、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中和高溫下不穩(wěn)定，易分解。

近年來(lái)，各種以多功能重金屬為材料設(shè)計(jì)合成的高選擇性和靈敏性的比色分析試劑盒逐漸發(fā)展起來(lái)，尤其的金、銀納米粒子。銀納米粒子(AgNPs)的表面等離子共振(SPR)特性、良好的穩(wěn)定性和分散性、化學(xué)惰性和在不同聚合程度呈現(xiàn)顏色變化等的性質(zhì)使得其適合用于比色分析檢測(cè)。另外，AgNPs具有較高的消光系數(shù)和較低的成本、所需的樣品也更少。因此，檢測(cè)細(xì)菌毒素及其他生物分子所運(yùn)用的AgNPs基比色分析試劑盒得到發(fā)展。然而，這種聚合形式的比色免疫試劑的靈敏性還是較低，缺乏信號(hào)放大的過(guò)程。因此提高基于金屬材料的比色分析試劑盒的靈敏性迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種功能化的納米二氧化錳聯(lián)合納米銀探針；

本發(fā)明的另一目的在于提供一種功能化的納米二氧化錳聯(lián)合納米銀探針的制備方法；

本發(fā)明的再一目的是提供一種利用所述的納米二氧化錳聯(lián)合納米銀探針作為疾病標(biāo) 識(shí)物檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種功能化的納米二氧化錳聯(lián)合納米銀探針，其特征為，包括以下三部分：含有檢測(cè)抗體及具有功能化修飾的二氧化錳納米材料，和可以還原二氧化錳的還原劑，及銀納米顆粒溶液。

其中，所述的二氧化錳納米材料可以包括二氧化錳納米粒子、二氧化錳納米片、二氧化錳納米花。本文中優(yōu)選二氧化錳納米花。

其中，所述的銀納米顆?？梢园ㄣy納米粒子、銀納米線、銀納米片或者介孔銀納米顆粒中的至少一種。

其中所述的銀納米顆粒的修飾包括酪氨酸、4-鄰巰基苯甲酸、三聚氰胺或者4-鄰巰基苯甲酸(4-MBA)和三聚氰胺(MA)共同修飾，本文中優(yōu)選4-鄰巰基苯甲酸和三聚氰胺共同修飾。

其中，所述的抗體為一種或多種檢測(cè)抗體，其根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)而定。本發(fā)明選擇了EV71單克隆抗體。

其中，所述的還原劑，包括谷胱甘肽、檸檬酸鈉、草酸或者維生素C，本文中優(yōu)選維生素C。

其中，所述二氧化錳納米材料的功能化修飾，優(yōu)選為聚乙二醇修飾。

其中，作為優(yōu)選，功能化修飾的二氧化錳納米材料，在溶液中的濃度范圍為0.01-20mg/mL；

該二氧化錳納米材料連接的檢測(cè)抗體，其濃度范圍為1-1000μg/mL；

還原劑的濃度范圍為0.1-100mM；

銀納米顆粒溶液的濃度范圍為0.001-1mM。

其中，進(jìn)一步優(yōu)選，功能化修飾的二氧化錳納米材料，在溶液中的濃度范圍為0.1-2mg/mL。

其中，進(jìn)一步優(yōu)選，該二氧化錳納米材料連接的檢測(cè)抗體，其濃度范圍為20-100μg/mL。

進(jìn)一步優(yōu)選，還原劑的濃度范圍為1-10mM。

進(jìn)一步優(yōu)選，銀納米顆粒溶液的濃度范圍為0.01-0.1mM。

功能化的二氧化錳聯(lián)合銀納米顆粒探針的制備方法，包括以下步驟：

1)將250mg高錳酸鉀(KMnO₄)加入到125mL水中攪拌30min，得到均一的分散溶液。加大攪拌力度下，加入2.5mL油酸得到穩(wěn)定的乳液。將乳液在室溫下進(jìn)一步攪拌24h后變?yōu)樽睾谏?。接著，使用乙醇將所得棕黑色溶液離心清洗以便去除殘余反應(yīng)物。最終將其凍干得干燥的二氧化錳納米花棕黑色固體。

2)將所得二氧化錳納米花納米材料與內(nèi)消旋-2,3-二巰基丁二酸(DMSA)反應(yīng)，從而在二氧化錳納米花表面修飾上羧基基團(tuán)。具體而言，取100mg二氧化錳納米花分散于10mL甲苯，后將分散有200mg DMSA和200mg碳酸氫鈉(NaHCO₃)的100mL丙酮加入其中。將上述所得混合溶液置于80℃油浴中回流反應(yīng)6h。最后將所得羧基化二氧化錳納米花用丙酮離心清洗三次，然后凍干。

3)取1mL羧基化二氧化錳納米花溶液(1mg/mL)，在其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC,20mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,10mg/mL)混合溶液，并且反應(yīng)30min。通過(guò)離心將多余的試劑去除。二氧化錳納米花重懸后，將0.5mL氨基化聚乙二醇(NH₂-PEG-NH₂,1mg/mL)加入其中，再次反應(yīng)30min以后離心清洗；

4)在2mg PEG修飾的二氧化錳納米花中加入1mL新鮮配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)和2mL EV71二抗溶液(20μg/mL,pH 7.4)。將所得混合液振蕩10min后，將其轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，靜置2h。接著借助離心的辦法，使用PBS(pH 7.4)清除其多余的EDC/NHS和二抗。并且取2mL牛血清白蛋白(BSA，1％)與上述所得混合溶液中，置于4℃冰箱孵育2h。去除剩余BSA后，將最終所得的二抗標(biāo)記的二氧化錳納米花分散于2mL PBS(pH 7.4)中，最終保存在4℃中備用。

5)在大力攪拌下，將10mg硼氫化鈉(NaBH₄)快速加入到100mL硝酸銀(AgNO₃，10^-4M)溶液中，溶液即刻變?yōu)榈S色，反應(yīng)10min后既得亮黃色溶液。接著，在所得亮黃色溶液中加入2mL 4-MBA(10^-4M)和4mL MA(10^-4M)，繼續(xù)攪拌30min，AgNPs則組裝上4-MBA和MA。

本發(fā)明研制出一種功能化的納米二氧化錳聯(lián)合納米銀探針及其制備方法。該探針主要有兩部分構(gòu)成：其一就是功能化的二氧化錳納米顆粒，其特征是具有很好的水溶液穩(wěn)定性以及快速的被還原劑還原為Mn²⁺；其二為銀納米顆粒溶液，特點(diǎn)是能夠在Mn²⁺存在的情況下引起團(tuán)聚反應(yīng)。病原體二抗修飾的二氧化錳納米顆粒再層層免疫反應(yīng)后被捕獲在96-微孔板上，加入還原劑以后Mn²⁺并且引起銀納米顆粒的團(tuán)聚反應(yīng)，從而導(dǎo)致金納米顆粒溶液的吸光值的變化。吸光值的變化與加入的病原體的濃度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系，從而達(dá)成病原體的測(cè)定。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中利用納米二氧化錳粒子進(jìn)行二抗的標(biāo)記，通過(guò)還原劑的作用可以釋放出大量的Mn²⁺，相對(duì)應(yīng)與單獨(dú)信號(hào)測(cè)定，該種方法具有快速的實(shí)驗(yàn)信號(hào)方法的作用。這也使得改傳感器能夠具有較高的靈敏度、較低檢測(cè)線。

另外，本發(fā)明中也可以利用肉眼對(duì)納米銀顆粒溶液的顏色變化進(jìn)行觀察，也能為病原體的含量進(jìn)行初步的研究。

附圖說(shuō)明

圖1為二氧化錳納米花對(duì)二抗的修飾(A)，基于二氧化錳納米花和4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子的病原體傳感器的檢測(cè)原理圖(B)。

圖2(A)4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子在Mn²⁺存在下的電鏡圖，插圖：4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子的電鏡圖；(B)4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子在Mn²⁺存在(b)和不存在(a)情況下的粒度分析；(C)4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子在不同Mn²⁺(0,5,10,50,100nM)存在下的吸收變化；(D)4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子不同波長(zhǎng)吸光度比率(A408nm/A550n)和Mn²⁺的線性關(guān)系。

圖3(A)二氧化錳納米花的電鏡圖；(B)氨基化聚乙二醇修飾的二氧化錳納米花電鏡圖；(C)放大了的氨基化聚乙二醇修飾的二氧化錳納米花電鏡圖；(D)氨基化聚乙二醇修飾的二氧化錳納米的粒度分析。

圖4為利用構(gòu)建的傳感器中吸收隨著病原體EV71不同濃度(1,2,5,20,50,100x 10³ particles/mL)的變化(A)，不同波長(zhǎng)吸光度比率(A408nm/A550nm)和EV71不同濃度的變化(B)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體的制備例和實(shí)施例可使本發(fā)明得到更清楚地說(shuō)明：

實(shí)施例1

1)將250mg KMnO₄加入到125mL水中攪拌30min，得到均一的分散溶液。加大攪拌力度下，加入2.5mL油酸得到穩(wěn)定的乳液。將乳液在室溫下進(jìn)一步攪拌24h后變?yōu)樽睾谏?。接著，使用乙醇將所得棕黑色溶液離心清洗以便去除殘余反應(yīng)物。最終將其凍干得干燥的二氧化錳納米花棕黑色固體。

2)將所得二氧化錳納米花納米材料與DMSA反應(yīng)，從而在二氧化錳納米花表面修飾上羧基基團(tuán)。具體的來(lái)說(shuō)，取100mg二氧化錳納米花分散于10mL甲苯，后將分散有200mg DMSA和200mg NaHCO₃的100mL丙酮加入其中。將上述所得混合溶液置于80℃油浴中回流反應(yīng)6h。最后將所得羧基化二氧化錳納米花用丙酮離心清洗三次，然后凍干。

3)取1mL羧基化二氧化錳納米花溶液(1mg/mL)，在其中加入1mL新鮮配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)，并且反應(yīng)30min。通過(guò)離心將多余的試劑去除。二氧化錳納米花重懸后，將0.5mL NH₂-PEG-NH₂(1mg/mL)加入其中，再次反應(yīng)30min以后離心清洗；

4)如圖1A所示，在2mg PEG修飾的二氧化錳納米花中加入1mL新鮮配制的EDC/NHS溶液(EDC 20mg/mL,NHS 10mg/mL)和2mL EV71二抗溶液(20μg/mL,pH 7.4)。將所得混合液振蕩10min后，將其轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，靜置2h。接著借助離心的辦法，使用PBS(pH 7.4)清除其多余的EDC/NHS和二抗。并且取2mL牛血清白蛋白(BSA，1％)與上述所得混合溶液中，置于4℃冰箱孵育2h。去除剩余BSA后，將最終所得的二抗標(biāo)記的二氧化錳納米花分散于2mL PBS(pH 7.4)中，最終保存在4℃中備用。

5)在大力攪拌下，將10mg NaBH₄快速加入到100mL AgNO₃(10^-4M)溶液中，溶液即刻變?yōu)榈S色，反應(yīng)10min后既得亮黃色溶液。接著，在所得亮黃色溶液中加入2mL 4-MBA (10^-4M)和4mL MA(10^-4M)，繼續(xù)攪拌30min，AgNPs則組裝上4-MBA和MA。

實(shí)施例2

6)如圖1B所示在96-微孔板中加入散于碳酸鹽緩沖液(100mM,pH 9.6)的EV71病原體一抗(4μg/mL)，并且在4℃環(huán)境中孵育過(guò)夜。然后利用PBS清洗三次去除多余的抗體。在各微孔中加入1％BSA PBS溶液進(jìn)行封閉。最后用PBS清洗后，4℃保存待用。

7)接著在每個(gè)孔中加入不同濃度的EV71病原體，并且置于37℃中孵育1h,后用PBS清洗3遍。

8)然后加入100μL的二抗標(biāo)記的二氧化錳納米花，進(jìn)一步37℃中孵育1h，利用PBS清洗3遍去除多余的二氧化錳納米花。

9)然后加入100μL Vc溶液到微孔中。在反應(yīng)5min后，加入100μL 4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子再次反應(yīng)5min。最后，測(cè)量溶液在408nm和550nm的吸收值。

1、制備的4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子為分布均勻的納米球(圖2A插圖)，并且在Mn²⁺存在下能夠引起團(tuán)聚反應(yīng)(圖2A)。通過(guò)粒度分析可以看出來(lái)在Mn²⁺存在下4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子的粒度發(fā)生了明顯的變化(圖2B)。隨著Mn²⁺加入量的不同，混合溶液亮黃色逐漸變?yōu)榈凵?，最終消失。并且吸收值發(fā)生了明顯的變化(圖2C)，兩處峰吸收值的比(A408nm/A550nm)也隨著Mn²⁺加入量的增加呈現(xiàn)線性遞減的趨勢(shì)(圖2D)。

2、制備的二氧化錳納米花的結(jié)構(gòu)通過(guò)電鏡圖確認(rèn)(圖3A)。在修飾了聚乙二醇后，二氧化錳納米花仍然是納米花結(jié)構(gòu)(圖3B和圖3C)。這種結(jié)構(gòu)也為了快速的被還原劑還原提供了條件。聚乙二醇修飾的二氧化錳納米花的平均粒徑約為138nm(圖3D)。

3、隨著加入EV71病原體量的不同，測(cè)定溶液的吸收發(fā)生著變化(圖4A)。另外，吸收曲線兩吸收峰的比值A(chǔ)550nm/A408nm隨著EV71病原體濃度的減少而降低，且其濃度在～10³–2x 10⁴particles/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。檢測(cè)線比傳統(tǒng)的ELISA試劑盒明顯降低， 充分說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)中于所設(shè)計(jì)的比色免疫分析傳感器優(yōu)越的靈敏性。

本發(fā)明，我們引入了一種無(wú)酶比色分析傳感器，其基于4-MBA/MA共同修飾銀納米粒子的設(shè)計(jì)展示了對(duì)病原體檢測(cè)上優(yōu)越的靈敏性。此外，我們合成的標(biāo)記材料聚乙二醇修飾的納米二氧化錳顆粒在PBS展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，Mn²⁺可通過(guò)簡(jiǎn)單的Vc還原反應(yīng)從中釋放出。檢測(cè)過(guò)程產(chǎn)生的離子螯合產(chǎn)物的量可簡(jiǎn)單的利用肉眼或者UV-vis檢測(cè)器定性或定量的判定出。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫比色分析法相比，本方法具有更快速、更靈敏和更加簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。