本申請(qǐng)涉及超分辨熒光顯微成像領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)遠(yuǎn)場光學(xué)顯微分辨率主要受到衍射極限的限制，其在物鏡焦點(diǎn)處形成的焦點(diǎn)大小，即點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)決定了其分辨能力。受激輻射損耗(Stimulated emission depletion，STED)成像技術(shù)是一種遠(yuǎn)場光學(xué)超分辨成像技術(shù)，它突破了傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限的限制，把遠(yuǎn)場光學(xué)分辨率提高至50nm甚至更高。

受激輻射損耗成像原理是采用兩路波長不同的激光，一路激光叫做激發(fā)光，用于激發(fā)生物等樣品內(nèi)熒光物質(zhì)至激發(fā)態(tài)，從而輻射出可探測的熒光；另一路激光叫做損耗光，同樣作用于被激發(fā)的熒光物質(zhì)，可使其在激發(fā)態(tài)返回基態(tài)，然而該過程并不輻射熒光，而是輻射與損耗光相同的光，并可以從探測光路中濾除。通過損耗光的使用，可以人為地控制熒光輻射，達(dá)到光開關(guān)的作用，實(shí)現(xiàn)熒光開/關(guān)狀態(tài)的可逆切換。

成像系統(tǒng)中，損耗光路中采用了0-2π渦旋相位調(diào)制損耗光波前，使其在物鏡焦平面處形成一個(gè)中空的圓環(huán)形焦點(diǎn)(即面包圈光斑)，該光斑與激發(fā)光形成的實(shí)心圓形光斑空間重合。這樣一來，光斑中央的中空位置沒有損耗光的影響，熒光分子可以正常輻射熒光，而周邊的熒光分子受到損耗光的作用，產(chǎn)生了熒光關(guān)閉的狀態(tài)，使得有效的激發(fā)區(qū)域被抑制在圓環(huán)光斑之內(nèi)。如此，就可以直接的減小物鏡焦點(diǎn)PSF的大小，從而提高成像分辨率。類似共聚焦成像，采用逐點(diǎn)掃描的方式成像，從而獲得樣品二維或三維的熒光強(qiáng)度分布圖像。

但是，在探測方，大都使用的是點(diǎn)探測器裝置，在探測器前使用針孔濾波，或者用多模光纖的端面替代針孔，針孔大小一般設(shè)置為1倍艾里斑直徑左右，針孔點(diǎn)探測存在以下問題：

裝調(diào)困難：兩路激光需要在空間重合，激發(fā)光的最大值與損耗光中空最小值需要嚴(yán)格重合，才能實(shí)現(xiàn)高分辨成像。如果重合偏差較大，則成像分辨率和信噪比均顯著降低。點(diǎn)探測系統(tǒng)無法實(shí)時(shí)監(jiān)控兩路激光重合的程度，一般需采用對(duì)金粒子成像，分別探測兩路激光PSF的方式進(jìn)行精密的合束，實(shí)際樣品成像前，需要更換為金粒子樣品，并對(duì)金粒子樣品多次反復(fù)的掃描成像確定兩路激光相對(duì)位置，并精密調(diào)節(jié)，操作過程極為復(fù)雜。此外，系統(tǒng)中針孔位置如果偏離主光軸，也會(huì)造成信號(hào)強(qiáng)度的急劇下降，因此需要保持針孔與主光軸的高度重合，但是由于針孔直徑只有1倍艾里斑大小(50-100微米)，很容易由于機(jī)械等原由產(chǎn)生偏離，造成系統(tǒng)成像質(zhì)量下降，每次成像前需要調(diào)整針孔位置，增加了操作的復(fù)雜性。

能量損失：受激輻射損耗屬于弱光成像，信號(hào)值很低，而1倍艾里斑大小的針孔會(huì)在空間阻止熒光的通過，造成了光能利用率的進(jìn)一步下降，不利于弱光探測，嚴(yán)重影響了成像質(zhì)量。

探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)固定：系統(tǒng)中使用了針孔探測器，則該系統(tǒng)的探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)固定了下來，沒有可以調(diào)節(jié)的余地，無法從探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)方面入手，提高受激輻射損耗的成像質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要提供一種操作簡便、光能利用率高、探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可調(diào)的面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)。

為解決上述技術(shù)問題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)，包括用于產(chǎn)生激發(fā)光的激發(fā)光光源、用于產(chǎn)生損耗光的損耗光光源、擴(kuò)束系統(tǒng)、渦旋相位調(diào)制板、二色鏡、波片、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、納米位移臺(tái)、長焦會(huì)聚鏡頭及面陣探測器，經(jīng)所述擴(kuò)束系統(tǒng)擴(kuò)束后的激發(fā)光與經(jīng)所述擴(kuò)束系統(tǒng)、渦旋相位調(diào)制板進(jìn)行擴(kuò)束并相位調(diào)制后的損耗光進(jìn)入所述二色鏡反射后進(jìn)入所述波片，通過所述波片的激發(fā)光與損耗光經(jīng)過所述掃描振鏡后，依次通過經(jīng)過所述掃描透鏡、筒鏡和物鏡后，聚焦于所述納米位移臺(tái)處的樣品內(nèi)部，聚焦于所述納米位移臺(tái)處的樣品內(nèi)部的激發(fā)光與損耗光產(chǎn)生的光信號(hào)通過所述長焦會(huì)聚鏡頭匯聚于所述面陣探測器上成像。

優(yōu)選地，所述擴(kuò)束系統(tǒng)包括第一擴(kuò)束系統(tǒng)、第二擴(kuò)束系統(tǒng)、及第三擴(kuò)束系統(tǒng)，所述二色鏡包括第一二色鏡與第二二色鏡。

優(yōu)選地，所述激發(fā)光光源產(chǎn)生的激發(fā)光經(jīng)過所述第一擴(kuò)束系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)束。

優(yōu)選地，所述損耗光光源產(chǎn)生的損耗光經(jīng)過第一、第二擴(kuò)束系統(tǒng)擴(kuò)束后再經(jīng)所述渦旋相位調(diào)制板進(jìn)行相位調(diào)制。

優(yōu)選地，經(jīng)過擴(kuò)束的激發(fā)光與經(jīng)由相位調(diào)制后的損耗光通過所述第一、第二二色鏡反射后進(jìn)入到所述波片中。

優(yōu)選地，所述掃描振鏡用于掃描、或所述納米位移臺(tái)用于掃描、或所述掃描振鏡與所述納米位移臺(tái)配合用于掃描。

優(yōu)選地，所述波片為1/4波片。

本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)，相較于傳統(tǒng)受激輻射損耗成像系統(tǒng)，實(shí)際上是實(shí)現(xiàn)了對(duì)探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的調(diào)節(jié)，所述面陣探測器可以根據(jù)實(shí)際情況需要，對(duì)面陣探測器的每一個(gè)象元進(jìn)行獨(dú)立地讀取數(shù)據(jù)，從而可以獨(dú)立、自由地調(diào)節(jié)探測區(qū)域的大小、位置、增益等參數(shù)，從而可以提高成像質(zhì)量。例如，可以實(shí)現(xiàn)虛擬針孔的作用，利用所述面陣探測器的象元組成的探測區(qū)域虛擬傳統(tǒng)受激輻射損耗成像系統(tǒng)的實(shí)際針孔效果，并根據(jù)選擇所讀取數(shù)據(jù)的象元區(qū)域大小不同，可以方便地轉(zhuǎn)變?yōu)樘摂M針孔的大小。

相較于現(xiàn)有的點(diǎn)探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)需要采用復(fù)雜的金粒子進(jìn)行點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的測量，本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)采用面陣探測器進(jìn)行探測，可以方便、實(shí)時(shí)的監(jiān)控和調(diào)節(jié)激發(fā)光和損耗光的反射光在面陣探測器上的位置，從而實(shí)現(xiàn)高精度合束調(diào)節(jié)過程的可視化、簡便化。且能夠有效降低探測光路輕微離軸所造成的偏差影響，本申請(qǐng)大大提高了整體系統(tǒng)的穩(wěn)定性與操作的簡便性。所述面陣探測器收集了所有熒光能量，提高了光能利用率，這對(duì)于屬于弱光探測受激輻射損耗成像系統(tǒng)來說，具有非常重大的意義。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)的示意圖；

圖2為本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)的面陣探測示意圖；

圖3為本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)的面陣探測合束偏差時(shí)的示意圖；

圖4為本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)的面陣探測器中心離軸時(shí)的示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具體實(shí)施例及相應(yīng)的附圖對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本申請(qǐng)保護(hù)的范圍。

以下結(jié)合附圖，詳細(xì)說明本申請(qǐng)各實(shí)施例提供的技術(shù)方案。

請(qǐng)參閱圖1所示，本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)包括激發(fā)光源1、損耗光光源2、擴(kuò)束系統(tǒng)3、渦旋相位調(diào)制板5、二色鏡4、波片6、掃描振鏡7、掃描透鏡8、筒鏡9、物鏡10、納米位移臺(tái)11、長焦會(huì)聚鏡頭12、及面陣探測器13。所述擴(kuò)束系統(tǒng)3包括第一擴(kuò)束系統(tǒng)3-1、第二擴(kuò)束系統(tǒng)3-2、及第三擴(kuò)束系統(tǒng)3-3。所述二色鏡4包括第一二色鏡4-1與第二二色鏡4-2。所述納米位移臺(tái)11用于承載掃描樣品。

所述激發(fā)光光源1產(chǎn)生激發(fā)光并經(jīng)過所述第一擴(kuò)束系統(tǒng)3-1進(jìn)行擴(kuò)束。所述損耗光光源2產(chǎn)生損耗光并經(jīng)過第一、第二擴(kuò)束系統(tǒng)3-2,3-3擴(kuò)束后再經(jīng)所述渦旋相位調(diào)制板5進(jìn)行相位調(diào)制。

經(jīng)由所述第一擴(kuò)束系統(tǒng)3-1擴(kuò)束的激發(fā)光與經(jīng)由所述渦旋相位調(diào)制板5相位調(diào)制后的損耗光均進(jìn)入所述第一、第二二色鏡4-1,4-2反射后進(jìn)入到所述波片6中。通過所述波片6的激發(fā)光與損耗光經(jīng)過所述掃描振鏡7后，依次通過經(jīng)過所述掃描透鏡8、筒鏡9和物鏡10后，聚焦于所述納米位移臺(tái)11處的樣品內(nèi)部。本申請(qǐng)的掃描方式可以使用所述掃描振鏡7進(jìn)行掃描，也可以使用所述納米位移臺(tái)11進(jìn)行掃描。

聚焦于所述納米位移臺(tái)11處的樣品內(nèi)部的激發(fā)光與損耗光產(chǎn)生的光信號(hào)則通過所述長焦會(huì)聚鏡頭12匯聚于所述面陣探測器13上。所述面陣探測器13的探測平面移動(dòng)于所述長焦會(huì)聚鏡頭12的焦平面上。

所述波片6為1/4波片。所述面陣探測器13通過所述長焦會(huì)聚鏡頭12收集熒光信號(hào)。

所述面陣探測器13的探測面成像示意圖如圖2所示，其中，標(biāo)號(hào)14表示激發(fā)光在面探測器上形成的光斑，標(biāo)號(hào)15表示損耗光在面探測器上形成的光斑。標(biāo)號(hào)16所示方格表示面陣探測器上的若干象元。

在調(diào)節(jié)光路過程中，通過所述面探測器13可以實(shí)時(shí)的監(jiān)控成像狀況，確定激發(fā)光和損耗光中心在所述面陣探測器13上的位置，從而實(shí)現(xiàn)兩路激光(激發(fā)光和損耗光)的高精度、簡便合束，使調(diào)節(jié)過程直觀可視化。而當(dāng)激發(fā)光與損耗光合束存在偏差時(shí)，所述面陣探測器13的CCD上的成像效果如圖3所示，此時(shí)需要調(diào)節(jié)光路使激發(fā)光與損耗光合束一致，在調(diào)節(jié)光路的過程中依據(jù)所述面陣探測器13的CCD屏幕可視化進(jìn)行，操作簡便。

所述面陣探測器13的探測面積遠(yuǎn)大于一倍艾里斑，所有光能完全被所述面陣探測器13接收，無需擔(dān)心探測光路輕微離軸所造成的影響，僅需要根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)節(jié)讀取象元的位置即可，所述面陣探測器13在探測光路輕微離軸時(shí)的效果如圖4所示，雖然激發(fā)光在面陣探測器13上形成的光斑14與損耗光在面陣探測器13上形成的光斑15不在預(yù)定位置，但其仍然可以在屏幕上完整展示出來，而不會(huì)造成光能損失。

本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)，相較于傳統(tǒng)受激輻射損耗成像系統(tǒng)，實(shí)際上是實(shí)現(xiàn)了對(duì)探測點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的調(diào)節(jié)，所述面陣探測器13可以根據(jù)實(shí)際情況需要，對(duì)面陣探測器13的每一個(gè)象元進(jìn)行獨(dú)立地讀取數(shù)據(jù)，從而可以獨(dú)立、自由地調(diào)節(jié)探測區(qū)域的大小、位置、增益等參數(shù)，從而可以提高成像質(zhì)量。例如，可以實(shí)現(xiàn)虛擬針孔的作用，利用所述面陣探測器13的象元組成的探測區(qū)域虛擬傳統(tǒng)受激輻射損耗成像系統(tǒng)的實(shí)際針孔效果，并根據(jù)選擇所讀取數(shù)據(jù)的象元區(qū)域大小不同，可以方便地轉(zhuǎn)變?yōu)樘摂M針孔的大小。

相較于現(xiàn)有的點(diǎn)探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)需要采用復(fù)雜的金粒子進(jìn)行點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的測量，本申請(qǐng)面陣探測型受激輻射損耗成像系統(tǒng)采用面陣探測器13進(jìn)行探測，可以方便、實(shí)時(shí)的監(jiān)控和調(diào)節(jié)激發(fā)光和損耗光的反射光在面陣探測器上的位置，從而實(shí)現(xiàn)高精度合束調(diào)節(jié)過程的可視化、簡便化。且能夠有效降低探測光路輕微離軸所造成的偏差影響，本申請(qǐng)大大提高了整體系統(tǒng)的穩(wěn)定性與操作的簡便性。所述面陣探測器13收集了所有熒光能量，提高了光能利用率，這對(duì)于屬于弱光探測受激輻射損耗成像系統(tǒng)來說，具有非常重大的意義。

本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)明白，本發(fā)明的實(shí)施例可提供為方法、系統(tǒng)、或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。因此，本發(fā)明可采用完全硬件實(shí)施例、完全軟件實(shí)施例、或結(jié)合軟件和硬件方面的實(shí)施例的形式。而且，本發(fā)明可采用在一個(gè)或多個(gè)其中包含有計(jì)算機(jī)可用程序代碼的計(jì)算機(jī)可用存儲(chǔ)介質(zhì)(包括但不限于磁盤存儲(chǔ)器、CD-ROM、光學(xué)存儲(chǔ)器等)上實(shí)施的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品的形式。

還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、商品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、商品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、商品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

以上所述僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。