本發(fā)明涉及醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同位素稀釋質(zhì)譜法定量檢測(cè)血清低豐度蛋白前處理流程。
背景技術(shù)：
同位素稀釋質(zhì)譜法特異性強(qiáng)、復(fù)現(xiàn)性好，因此是血清低豐度蛋白絕對(duì)定量的最佳方法，但是該方法的準(zhǔn)確性顯著依賴于蛋白的前處理優(yōu)劣?，F(xiàn)有的血清低豐度蛋白前處理流程較多，不同流程間差異較大，普遍存在重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性差的缺陷，嚴(yán)重影響了同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)血清低豐度蛋白的準(zhǔn)確定量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供同位素稀釋質(zhì)譜法定量檢測(cè)血清低豐度蛋白前處理流程。
為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明的同位素稀釋質(zhì)譜法定量檢測(cè)血清低豐度蛋白前處理流程，它的步驟如下：
步驟一：高豐度蛋白去除：將100μL血清按試劑說明書步驟用Blue Albumin&IgG Depletion Kit去除絕大部分白蛋白和IgG，取180μL去除高豐度蛋白后的血清，并與70μL 25mM的碳酸氫銨溶液混合；
步驟二：變性：將上述混合樣本首先在100℃水浴下熱變性5min，再冰浴5min冷卻，然后加入約96.1mg尿素進(jìn)行化學(xué)變性，漩渦30s后靜置5min，最后加入250μL 25mM碳酸氫銨溶液稀釋；
步驟三：還原：加入50μL 100mM二硫蘇糖醇，60℃水浴30min，使變性蛋白已打開的二硫鍵保持還原狀態(tài)；
步驟四：烷基化：加入50μL 550mM碘乙酰胺，黑暗中室溫下作用30min，使半胱氨酸上的巰基烷基化，防止二硫鍵的形成；
步驟五：終止烷基化：加入185μL 100mM二硫蘇糖醇終止烷基化，且二硫蘇糖醇與碘乙酰胺的摩爾比為1∶2，室溫下作用30min，防止過量的碘乙酰胺烷基化非胱氨酸殘基；
步驟六：胰酶消化：加入1mL 25mM碳酸氫銨溶液稀釋尿素，使其終濃度小于1M，然后加入100μL 1mg/L同位素標(biāo)記肽，再加入胰酶，且胰酶與底物的質(zhì)量比為1∶20，37℃作用30min，使蛋白質(zhì)水解成多肽，最后加入35μL 5％三氟乙酸終止消化；
步驟七：固相萃?。簩⒚附猱a(chǎn)物用Waters Sep-pak C18固相萃取柱純化富集，首先用3mL甲醇和3mL超純水分別活化和平衡柱子，然后加入酶解產(chǎn)物，再用2mL超純水清洗柱子兩次，最后用1mL 100％乙腈萃??；
步驟八：蒸干：將萃取產(chǎn)物用氮吹儀蒸干，氮?dú)饬魉贋?L/min，蒸干溫度為45℃；
步驟九：復(fù)溶：將蒸干產(chǎn)物用400μL含0.1％甲酸的超純水復(fù)溶。
本發(fā)明有益效果為：重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性好，且覆蓋面廣，適用于同位素稀釋質(zhì)譜法檢測(cè)血清中各種低豐度蛋白的前處理。
具體實(shí)施方式
本具體實(shí)施方式采用如下技術(shù)方案：它的步驟如下：
步驟一：高豐度蛋白去除：將100μL血清按試劑說明書步驟用Blue Albumin&IgG Depletion Kit(Sigma-Aldrich)去除絕大部分白蛋白和IgG，取180μL去除高豐度蛋白后的血清，并與70μL 25mM的碳酸氫銨(ABC)溶液混合；
步驟二：變性：將上述混合樣本首先在100℃水浴下熱變性5min，再冰浴5min冷卻，然后加入約96.1mg尿素(終濃度8M)進(jìn)行化學(xué)變性，漩渦30s后靜置5min，最后加入250μL 25mM ABC溶液稀釋；
步驟三：還原：加入50μL 100mM二硫蘇糖醇(DTT)(終濃度10mM)，60℃水浴30min，使變性蛋白已打開的二硫鍵保持還原狀態(tài)；
步驟四：烷基化：加入50μL 550mM碘乙酰胺(IAM)(終濃度50mM)，黑暗中室溫下作用30min，使半胱氨酸上的巰基(-SH)烷基化，防止二硫鍵的形成；
步驟五：終止烷基化：加入185μL 100mM DTT終止烷基化(DTT/IAM(mol/mol)＝1∶2)，室溫下作用30min，防止過量的IAM烷基化非胱氨酸殘基；
步驟六：胰酶消化：加入1mL 25mM ABC溶液稀釋尿素，使其終濃度小于1M，然后加入100μL 1mg/L同位素標(biāo)記肽，再加入胰酶(胰酶/底物(w/w)＝1∶20)37℃作用30min，使蛋白質(zhì)水解成多肽，最后加入35μL 5％三氟乙酸(TFA)終止消化；
步驟七：固相萃?。簩⒚附猱a(chǎn)物用Waters Sep-pak C18固相萃取柱純化富集，首先用3mL甲醇和3mL超純水分別活化和平衡柱子，然后加入酶解產(chǎn)物，再用2mL超純水清洗柱子兩次，最后用1mL 100％乙腈(ACN)萃?。?/p>
步驟八：蒸干：將萃取產(chǎn)物用氮吹儀蒸干，氮?dú)饬魉贋?L/min，蒸干溫度為45℃；
步驟九：復(fù)溶：將蒸干產(chǎn)物用400μL含0.1％甲酸(FA)的超純水復(fù)溶。
以上所述，僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其它修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。