本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種基于催化信號(hào)放大的ApoE試劑盒。

背景技術(shù)：

載脂蛋白E(ApoE)是一個(gè)含有299個(gè)氨基酸結(jié)合有磷脂的糖蛋白。其分子量為34kD。ApoE可以在各種組織中合成，但肝臟為主，首先合成的是含有317個(gè)氨基酸的前肽，這個(gè)前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過蛋白水解作用除去18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，再經(jīng)過糖基化作用和細(xì)胞外液的脫唾液酸形成成熟的ApoE；ApoE分泌入血液后轉(zhuǎn)移到脂蛋白中。ApoE是脂蛋白所必須的結(jié)構(gòu)蛋白，可通過與各組織細(xì)胞的受體結(jié)合，參與脂蛋白代謝，調(diào)節(jié)膽固醇水平，激活卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)，并具有某種免疫調(diào)節(jié)作用。測(cè)定ApoE對(duì)診斷和治療高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化等疾病提供了重要理論依據(jù)。

ApoE的檢測(cè)原理為：試劑中的ApoE抗體與檢測(cè)標(biāo)本血清中的ApoE相遇，形成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生渾濁。通過測(cè)定340nm波長(zhǎng)吸光度，并與校準(zhǔn)曲線比較，求出標(biāo)本中ApoE的含量。

已知測(cè)定ApoE的方法有層析法、電泳法、免疫分析法、其中層析法和電泳法操作繁瑣，不能進(jìn)行批量樣本分析和直接上全自動(dòng)生化分析儀等缺點(diǎn)，而免疫分析法中的免疫擴(kuò)散法、放射免疫分析法、熒光標(biāo)記免疫分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法也存在諸多不足之處；如需特殊的設(shè)備，樣品需處理，不能上全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行批量監(jiān)測(cè)分析等。臨床常用的免疫比濁法因其樣本用量少，可直接在全自動(dòng)生化分析儀上批量樣本分析、操作簡(jiǎn)單受其歡迎。

目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)ApoE普遍采用免疫比濁法，該方法雖然操作簡(jiǎn)便，但靈敏度不高，不能滿足臨床對(duì)ApoE定量的要求。原因是國(guó)內(nèi)ApoE檢測(cè)試劑所用抗體存在純度不高、批間差大等問題，而且主要抗原來源主要依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于催化信號(hào)放大的ApoE試劑盒。該試劑盒用于檢測(cè)血清中的ApoE的含量，以達(dá)到操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好，快速、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的目的。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種基于催化信號(hào)放大的ApoE試劑盒，包含R1試劑、R2試劑及校準(zhǔn)品；所述R1試劑為含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖體系，所述R2試劑為含有-ApoE抗體和生物胺的磷酸緩沖體系，所述校準(zhǔn)品包括4支不同ApoE濃度的牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品。

優(yōu)選地，所述R1試劑包括以下濃度的各組分：PH 7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，50～200mmol/L聚合物，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，以及體積分?jǐn)?shù)為0.1％～2％(V/V)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。鏈霉親和素能與R2中的生物素發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起，產(chǎn)生生物素沉積。

優(yōu)選地，所述聚合物為聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述R2試劑包括以下濃度的各組分：PH 7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.1‰～2‰(V/V)的吐溫-20，體積分?jǐn)?shù)為10％～50％(V/V)ApoE抗體，10～200mmol/L生物素標(biāo)記的含氮低分子生物胺。所述含氮低分子生物胺的濃度低于10mmol/L，會(huì)導(dǎo)致試劑靈敏度下降；濃度高于200mmol/L,會(huì)導(dǎo)致試劑的檢測(cè)精密度下降。

優(yōu)選地，所述含氮低分子生物胺包括酪胺、鹽酸-3-羥基酪胺、苯乙胺中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述4支牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品的ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl。由于抗原抗體結(jié)合的過程中，吸光度與濃度之間不成線性關(guān)系，一般是三次方程曲線關(guān)系，采用多點(diǎn)定標(biāo)方式，經(jīng)三次曲線方程擬合出一條能反應(yīng)真實(shí)情況的濃度與吸光度的關(guān)系曲線方程，使得檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

優(yōu)選地，所述牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品中還包括以下濃度的各組分：防腐劑0.2～2.2％、吐溫-20 1～10％、保護(hù)劑1～3％。

優(yōu)選地，所述防腐劑包括Proclin 300。

優(yōu)選地，所述保護(hù)劑包括甘油、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品的制備方法包括以下步驟：

在經(jīng)過處理的牛血清，加入保護(hù)劑1～3％吐溫-20 1～10％、防腐劑0.2～2.2％得到校準(zhǔn)品稀釋液；

將ApoE溶于校準(zhǔn)品稀釋液中，即制備得不同ApoE濃度的牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品。

本發(fā)明基于催化信號(hào)放大技術(shù)，采用免疫比濁法檢測(cè)血清中的ApoE含量。采用低分子含氮生物胺催化信號(hào)放大，由于其敏感度極強(qiáng)，使得本發(fā)明的方法靈敏度能夠檢測(cè)到0.05mg/dl提高，而且可以減少抗體的使用量，降低了試劑的成本。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明試劑盒校準(zhǔn)品采用牛血清基質(zhì)，該牛血清基質(zhì)由無HBV、HIV、HAV、HCV、TP傳染源，對(duì)操作者危害極?。?/p>

(2)在試劑R1、R2中分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的含氮低分子生物胺，利用生物胺的過氧化物酶反應(yīng)，生物胺在HRP催化下形成共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生大量酶促產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以與周圍的蛋白殘基結(jié)合，使得抗原-抗體結(jié)合部位有大量的生物素沉積，引起明顯的濁度變化，使試劑靈敏度大大提高，在樣品濃度低至0.05mg/dl時(shí)仍可檢測(cè)出結(jié)果，而市售試劑的最低檢測(cè)限為0.2mg/dl；

(3)本發(fā)明試劑盒與市售試劑(強(qiáng)盛生物試劑)相比靈敏度明顯提高，如本發(fā)明試劑盒測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為1.4(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為1064.8(1/10000A)，而強(qiáng)盛生物試劑測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為17.6(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為617.4(1/10000A)。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為4種不同含量的ApoE參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為分別采用本發(fā)明試劑和英國(guó)朗道公司的ApoE試劑對(duì)50份人血清測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種基于信號(hào)放大的ApoE檢測(cè)試劑盒，組成如下：

1.試劑R1為：

2.試劑R2為：

3.校準(zhǔn)品

4支ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品；每支牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品中還包括甘油1％，Proclin300 0.5％，吐溫-20 1％。

所述牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品制備：

將經(jīng)過處理的牛血清，加入甘油1％，Proclin300 0.5％，吐溫-20 1％得到校準(zhǔn)品稀釋液。用ApoE溶于制備的類似人血清基質(zhì)的溶液，制備不同濃度的校準(zhǔn)品(1.25mg/dl，2.5mg/dl，5mg/dl，10mg/dl)。

本實(shí)施例描述的ApoE檢測(cè)試劑盒，適用于各種類型的全自動(dòng)生化儀，以日立7170全自動(dòng)生化儀為例，其操作如表1。分析方法：兩點(diǎn)終點(diǎn)法，即試劑R1、R2的用量分別為300ul和100ul，樣本量3ul；300ul試劑R1加入3ul樣本于37℃5min后,讀取吸光度，然后加入100ul R2，反應(yīng)5min后讀取另一點(diǎn)；檢測(cè)主波長(zhǎng)為340nm。

采用本試劑及上述測(cè)定方法，采用日立7170生化分析儀測(cè)得的4種不同含量的ApoE校準(zhǔn)品(自制)的曲線(如圖1所示)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)含量的參考校準(zhǔn)品，其中X軸表示ApoE含量(mg/dl)；Y軸表示吸光度。

表1

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種基于信號(hào)放大的ApoE檢測(cè)試劑盒，組成如下：

1.試劑R1為：

2.試劑R2為：

3.校準(zhǔn)品

4支ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品；每支牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品中還包括甘油2.5％，Proclin300 1.5％，吐溫-20 8％。

所述牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品制備：

將經(jīng)過處理的牛血清，加入甘油2.5％，Proclin300 1.5％，吐溫-20 8％得到校準(zhǔn)品稀釋液。用ApoE溶于制備的類似人血清基質(zhì)的溶液，制備不同濃度的校準(zhǔn)品(1.25mg/dl，2.5mg/dl，5mg/dl，10mg/dl)。

試劑盒具體操作方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種基于信號(hào)放大的ApoE檢測(cè)試劑盒，組成如下：

1.試劑R1為：

2.試劑R2為：

3.校準(zhǔn)品

4支ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品；每支牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品中還包括甘油3％，Proclin300 2.2％，吐溫-20 10％。

所述牛血清基質(zhì)校準(zhǔn)品制備：

將經(jīng)過處理的牛血清，加入甘油3％，Proclin300 2.2％，吐溫-20 10％得到校準(zhǔn)品稀釋液。用ApoE溶于制備的類似人血清基質(zhì)的溶液，制備不同濃度的校準(zhǔn)品(1.25mg/dl，2.5mg/dl，5mg/dl，10mg/dl)。

所述試劑盒具體操作方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例4、檢測(cè)試劑的相關(guān)性試驗(yàn)

使用實(shí)施例1制備的試劑盒和對(duì)照試劑英國(guó)朗道公司的ApoE試劑，采用自動(dòng)7170全自動(dòng)生化分析儀對(duì)50份人血清(包括正常和異常標(biāo)本)按各自參數(shù)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)性分析。按照與上述“表1”中的參數(shù)進(jìn)行測(cè)定測(cè)定結(jié)果見圖2，X，Y軸均為測(cè)定值(ApoE的含量mg/dl)。

由圖2的結(jié)果看出，兩種試劑的相關(guān)系為R²＝0.9977，回歸方程為y＝1.0189x+0.0204。結(jié)果表明本試劑與進(jìn)口試劑測(cè)定病人血清相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。此外，以上實(shí)驗(yàn)是采用日立公司制造的7170全自動(dòng)生化儀進(jìn)行的，但本發(fā)明的試劑不限于上述儀器，還適用于其他全自動(dòng)或半自動(dòng)生化分析儀。本發(fā)明實(shí)施例2和3制備的試劑盒的特異性和準(zhǔn)確性與實(shí)施例1的相當(dāng)。

試驗(yàn)例5、最低檢測(cè)限試驗(yàn)

本實(shí)施例的目的是檢測(cè)試劑在測(cè)試臨床樣本時(shí)的最小檢出感度。

實(shí)驗(yàn)原料：采用實(shí)驗(yàn)例2制備的試劑盒、對(duì)照試劑(強(qiáng)盛生物)、校準(zhǔn)品、空白溶液(生理食鹽水)、正常人血清樣本，低值樣本。

機(jī)器：日立7170自動(dòng)生化分析儀。

操作步驟：使用生理食鹽水或是去離子水溶解低值樣本，然后50％稀釋成5個(gè)點(diǎn)，和零點(diǎn)一起每一個(gè)樣本測(cè)試5次，計(jì)算平均值，求得SD數(shù)值。

結(jié)果解析：根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，計(jì)算SD數(shù)值和CV數(shù)值，分別計(jì)算1SD，2SD，從最小的開始，其平均值－2SD的數(shù)值在零點(diǎn)平均值+2SD以上的就是試劑的最小檢出感度。表2顯示，本發(fā)明試劑盒試劑測(cè)定稀釋1/16、1/8、1/4、1/2血清時(shí)，稀釋平均值－2SD的數(shù)值均大于零點(diǎn)平均值+2SD，表明本發(fā)明試劑盒試劑最低檢測(cè)限至少可以達(dá)到0.05mg/dl。表3顯示，強(qiáng)盛生物試劑測(cè)定稀釋1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比較血清平均值－2SD與零點(diǎn)平均值+2SD大小，1/8和1/16稀釋血清平均值－2SD的數(shù)值均小于零點(diǎn)平均值+2SD，表明強(qiáng)盛生物試劑最低檢測(cè)限為0.2mg/dl左右。本發(fā)明實(shí)施例1和3制備的試劑盒最低檢測(cè)限與實(shí)施例2的相當(dāng)，至少可以達(dá)到0.05mg/dl。

表2

表3

試驗(yàn)例6、靈敏度實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例的目的是試劑盒試劑在測(cè)試生理鹽水以及一定濃度的管理血清時(shí)的吸光度變化值。

實(shí)驗(yàn)原料：采用實(shí)驗(yàn)例3制備的試劑盒、對(duì)照試劑(強(qiáng)盛生物)、校準(zhǔn)品、空白溶液、0.9％的生理食鹽水，濃度的管理血清時(shí)的吸光度變化值。

機(jī)器：日立7170自動(dòng)生化分析儀。

操作步驟：使用生理食鹽水、低值樣本，每個(gè)樣本測(cè)試5次，計(jì)算吸光度。

表4、5顯示，本發(fā)明試劑測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為1.4(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為1064.8(1/10000A)，而強(qiáng)盛生物試劑測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為17.6(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為617.4(1/10000A)，表明本發(fā)明試劑盒試劑靈敏度要顯著高于強(qiáng)盛生物試劑。表4、5分別表示發(fā)明試劑盒試劑和強(qiáng)盛生物試劑靈敏度，表明本發(fā)明試劑盒試劑靈敏度明顯好于強(qiáng)盛生物試劑。本發(fā)明實(shí)施例1和2制備的試劑盒靈敏度與實(shí)施例3的相當(dāng)。

表4

表5

綜上所述，本發(fā)明試劑盒校準(zhǔn)品采用牛血清基質(zhì)，該牛血清基質(zhì)由無HBV、HIV、HAV、HCV、TP傳染源，對(duì)操作者危害極?。辉谠噭㏑1、R2中分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的含氮低分子生物胺，利用生物胺的過氧化物酶反應(yīng)，生物胺在HRP催化下形成共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生大量酶促產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以與周圍的蛋白殘基結(jié)合，使得抗原-抗體結(jié)合部位有大量的生物素沉積，引起明顯的濁度變化，使試劑靈敏度大大提高，在樣品濃度低至0.05mg/dl時(shí)仍可檢測(cè)出結(jié)果，而市售試劑的最低檢測(cè)限為0.2mg/dl；本發(fā)明試劑盒與市售試劑(強(qiáng)盛生物試劑)相比靈敏度明顯提高，如本發(fā)明試劑盒測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為1.4(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為1064.8(1/10000A)，而強(qiáng)盛生物試劑測(cè)定生理鹽水時(shí)吸光度變化為17.6(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時(shí)吸光度變化為617.4(1/10000A)。

本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。