本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的修飾方法和含該修飾酶的試劑盒。
背景技術(shù)：
：N-乙酰神經(jīng)氨酸在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化下生成N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸，是唾液酸檢測中重要的酶之一。唾液酸是細(xì)胞膜糖蛋白的重要組成部分，與生物體的許多生物學(xué)功能有關(guān)，且與細(xì)胞惡變、癌轉(zhuǎn)移、浸潤、失去接觸性抑制、細(xì)胞粘附性降低以及腫瘤抗原性密切相關(guān)。測定血清唾液酸(SA)濃度，可作為腫瘤診斷輔助性指標(biāo)和療效觀察指標(biāo)。SA明顯升高的疾病有：急性白血病、食道癌、賁門癌、胃癌、腸癌、肝癌、肺癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者為最高。腫瘤患者血清唾液酸增高可能是腫瘤細(xì)胞涎糖蛋白合成增加和代謝的改變在血中的反映。癌癥患者SA水平動(dòng)態(tài)變化與病情相關(guān)，可以用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。唾液酸檢測的原理：樣本中的唾液酸受神經(jīng)氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神經(jīng)氨酸，進(jìn)而在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NANA-醛縮酶)的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脫氫酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+。測定該NADH的吸光下降的速率可求得樣本中唾液酸濃度。因?yàn)镹-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶側(cè)鏈還有羧基，羧基具有一定的氧化性，試劑2中含有還原型輔酶，長時(shí)間的儲存會使還原型輔酶被N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶氧化，導(dǎo)致了試劑的穩(wěn)定性不佳。目前，普遍的SA檢測試劑盒的穩(wěn)定性為6個(gè)月至10個(gè)月。主要原因便在于試劑中N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和還原型輔酶相互的影響。含使用本發(fā)明方法修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的試劑盒，穩(wěn)定性能達(dá)到14個(gè)月，穩(wěn)定性大大提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的修飾方法和含該修飾酶的試劑盒。本發(fā)明提供一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的修飾方法，同時(shí)利用該方法修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，發(fā)明了一種穩(wěn)定的唾液酸檢測試劑盒。該試劑盒靈敏度好、穩(wěn)定性佳，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供了一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，其特征在于，所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的氨基酸側(cè)鏈經(jīng)烷基化修飾及酶空間結(jié)構(gòu)修飾。第二方面，本發(fā)明提供了一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的制備方法，包括以下步驟：A1、將N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與烷基化試劑進(jìn)行反應(yīng)，去除其氨基酸側(cè)鏈的羧基；A2、將去除羧基后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶用鹽酸胍進(jìn)行修飾，即可。使用鹽酸胍對N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶進(jìn)行修飾，可使酶分子重新折疊，改變其空間結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，步驟A1中，所述烷基化試劑包括碳化二亞胺、碘乙酸和碘乙酰胺中的一種或幾種混合。優(yōu)選地，步驟A1中，所述的反應(yīng)具體為：使用三乙胺作為溶劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與烷基化試劑以1:3～5的質(zhì)量比混合，在室溫下攪拌過夜。優(yōu)選地，步驟A2中，所述修飾的具體方法為：在所述含去除羧基的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的溶液中加入一定質(zhì)量的鹽酸胍，使用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至5.0～6.0下，室溫?cái)嚢柽^夜。優(yōu)選地，所述去除羧基后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與鹽酸胍的質(zhì)量比為1:5～10。第三方面，本發(fā)明提供了一種含有修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的試劑盒，包括試劑R1和試劑R2；所述試劑R1包括以下濃度的各組分：試劑R2包括以下濃度的各組分：優(yōu)選地，所述的緩沖液為Good’s緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、HEPES緩沖液、MES緩沖液中的一種或幾種；所述R1中緩沖液的PH為5.0-7.0，試劑R2中緩沖液的PH為8.0-10.0。優(yōu)選地，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合劑EDTA類中的一種或幾種；所述防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：(1)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶氨基酸側(cè)鏈中含有羧基。羧基含有一定的氧化性，在試劑中會與還原型輔酶相互影響，使還原型輔酶含量降低，導(dǎo)致試劑故穩(wěn)定性不佳。使用本發(fā)明中的修飾劑修飾后，去除了羧基，從而提高了試劑的整體穩(wěn)定性。(2)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶去除羧基后，酶的空間構(gòu)象發(fā)生了改變，受到酶空間構(gòu)象的影響，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的反應(yīng)速度有所下降。為解決這個(gè)問題，我們使用鹽酸胍對酶進(jìn)行處理，鹽酸胍能使肽鍵充分伸展，對酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，使酶重新進(jìn)行折疊，使得酶空間構(gòu)象發(fā)生改變。進(jìn)過鹽酸胍修飾后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶比羧基修飾前活力更高。(3)通常的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的最佳穩(wěn)定PH值為7.4-8.0，而還原型輔酶穩(wěn)定的PH條件需達(dá)到PH9.0以上。穩(wěn)定PH的差異導(dǎo)致在正常的條件下，不能使得2個(gè)酶都保持最佳穩(wěn)定條件。而使用本發(fā)明方法修飾后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，因酶構(gòu)象的改變，酶的穩(wěn)定PH變化為8.8-9.2。這樣可以使2個(gè)酶都在最佳的穩(wěn)定條件下共存。(4)經(jīng)過修飾后的酶活力更高，在試劑中穩(wěn)定性更佳，同時(shí)不與還原型輔酶互相干擾，使得試劑的靈敏度更佳，可以檢測到更微量的唾液酸，在值相對較低的樣本檢測中，準(zhǔn)確度更佳。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：圖1為本發(fā)明試劑盒的定標(biāo)曲線；圖2為本發(fā)明試劑盒的相關(guān)性分析圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例涉及一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其制備方法，所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的氨基酸側(cè)鏈經(jīng)烷基化修飾。所述制備方法包括如下步驟：使用三乙胺作為溶劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與碳化二亞胺以1:3的質(zhì)量比混合，在室溫下攪拌過夜，去除其氨基酸側(cè)鏈的羧基；在上述含去除羧基的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的溶液中加入鹽酸胍，使用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至5.0～6.0下，室溫?cái)嚢柽^夜。所述去除羧基后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與鹽酸胍的質(zhì)量比為1:5。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種含有實(shí)施例1制備的修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的檢測試劑盒，其組成如下：試劑R1各組分及濃度為：試劑R2各組分及濃度為：本實(shí)施例描述的SA檢測試劑盒，適用于各種類型的全自動(dòng)生化儀，以日立7170全自動(dòng)生化儀為例，其操作如表1。分析方法：速率法，即試劑R1；R2的用量分別為240μl和60μl，樣本量8μl；240μl試劑R1加入8μl樣本于37℃5min后加入60μlR2，延遲120秒開始讀點(diǎn)，讀數(shù)時(shí)間約180秒；檢測波長分別主波長340nm，副波長405nm。采用本試劑及上述測定方法，采用日立7170生化分析儀測得的SA標(biāo)準(zhǔn)品的曲線(如圖1所示)，其中X軸表示SA含量(mg/dl)；Y軸表示吸光度。表1實(shí)施例3：檢測試劑的相關(guān)性試驗(yàn)本實(shí)施例的目的是檢測本發(fā)明實(shí)施例2制備的試劑和現(xiàn)有試劑的相關(guān)性。使用本法發(fā)明試劑(具體配方同實(shí)施例2)和對照試劑日本和光純藥公司的SA試劑，對100份人血清(包括正常和異常標(biāo)本)按各自參數(shù)進(jìn)行測定，對測定值進(jìn)行相關(guān)性分析。測定結(jié)果見圖2，X，Y軸均為測定值(SA的含量mg/dl)。由圖2的結(jié)果看出，兩種試劑的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9928，回歸方程為y＝1.0265x-0.926。結(jié)果表明本試劑與進(jìn)口試劑測定病人血清相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。此外，以上實(shí)驗(yàn)本試劑是采用日立公司制造的7170全自動(dòng)生化儀進(jìn)行的，但本發(fā)明的試劑不限于上述儀器，還適用于其他全自動(dòng)或半自動(dòng)生化分析儀。實(shí)施例4靈敏度試驗(yàn)本實(shí)施例的目的是檢測本發(fā)明試劑盒在測試樣本時(shí)的靈敏度。采用實(shí)驗(yàn)例2的試劑、對照試劑、標(biāo)準(zhǔn)品。操作步驟：測定水樣本20次，計(jì)算試劑最低檢測限。表2顯示，含使用本發(fā)明方法修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的試劑盒，最低檢測限可到達(dá)0.5mg/dl。含未修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的試劑盒的最低檢測限為5mg/dl。試劑的靈敏度大幅提高。表2實(shí)施例5穩(wěn)定性試驗(yàn)本實(shí)施例的目的是檢測試劑的穩(wěn)定性。采用實(shí)驗(yàn)例1試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品。操作步驟：1.試劑盒在加熱(37℃)條件下保存7天后，取出試劑盒測定各質(zhì)控3次，結(jié)果如表3所示。2.試劑盒在冷藏(2～8℃)條件下，每2個(gè)月取出試劑盒測定質(zhì)控，結(jié)果如表4所示。表3顯示，試劑在加熱(37℃)條件下保存7天后，檢測的準(zhǔn)確度仍然很好。表4顯示，試劑盒在冷藏(2～8℃)條件下，保存14個(gè)月后，試劑準(zhǔn)確度保持良好。從表中結(jié)果可以看出本發(fā)明試劑穩(wěn)定性良好，能長時(shí)間保存。適合臨床要求。表3樣品37℃加熱7天后的檢測結(jié)果低值質(zhì)控高值質(zhì)控159.51102.93258.07102.52359.6798.90平均值59.083101.450靶值59100相對偏差0.14％1.45％表4.樣品保存14個(gè)月的穩(wěn)定性實(shí)施例6本實(shí)施例涉及一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其制備方法，所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的氨基酸側(cè)鏈經(jīng)烷基化修飾。所述制備方法包括如下步驟：使用三乙胺作為溶劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與碘乙酸以1:5的質(zhì)量比混合，在室溫下攪拌過夜，去除其氨基酸側(cè)鏈的羧基；在上述含去除羧基的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的溶液中加入鹽酸胍，使用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至5.0～6.0下，室溫?cái)嚢柽^夜。所述去除羧基后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與鹽酸胍的質(zhì)量比為1:10。本實(shí)施例還提供一種含有上述方法制備的修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的檢測試劑盒，其組成如下：試劑R1各組分及濃度為：試劑R2各組分及濃度為：本實(shí)施例制備的試劑盒的相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例3基本相同，與進(jìn)口試劑測定病人血清相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。其靈敏度試驗(yàn)結(jié)果為最低檢測限可達(dá)0.5mg/dl。其穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果為：加熱(37℃)條件下保存7天后，檢測的準(zhǔn)確度仍然很好；在冷藏(2～8℃)條件下，保存14個(gè)月后，試劑準(zhǔn)確度保持良好。本實(shí)施例制備的試劑盒能長時(shí)間保存，適合臨床要求。實(shí)施例7本實(shí)施例涉及一種修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其制備方法，所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的氨基酸側(cè)鏈經(jīng)烷基化修飾。所述制備方法包括如下步驟：使用三乙胺作為溶劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶碘乙酰胺以1:4的質(zhì)量比混合，在室溫下攪拌過夜，去除其氨基酸側(cè)鏈的羧基；在上述含去除羧基的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的溶液中加入鹽酸胍，使用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至5.0～6.0下，室溫?cái)嚢柽^夜。所述去除羧基后的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與鹽酸胍的質(zhì)量比為1:7。本實(shí)施例提供一種含有實(shí)施例1制備的修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的檢測試劑盒，其組成如下：試劑R1各組分及濃度為：試劑R2各組分及濃度為：本實(shí)施例制備的試劑盒的相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例3基本相同，與進(jìn)口試劑測定病人血清相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。其靈敏度試驗(yàn)結(jié)果為最低檢測限可達(dá)0.5mg/dl。其穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果為：加熱(37℃)條件下保存7天后，檢測的準(zhǔn)確度仍然很好；在冷藏(2～8℃)條件下，保存14個(gè)月后，試劑準(zhǔn)確度保持良好。本實(shí)施例制備的試劑盒能長時(shí)間保存，適合臨床要求。本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3