本發(fā)明屬于微生物鑒定培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是常見霉菌黃曲霉和寄生曲中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。主要毒素是B1、B2、G1和G2,其中B1是毒性和危害最大的一種,B2和G2是B1和G1的雙羥基衍生物。黃曲霉毒素是目前所知致癌性最強(qiáng)的化合物,廣泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕點(diǎn)等糧油食品和動(dòng)物飼料中,嚴(yán)重影響人們的健康,甚至威脅著人們的生命安全。更重要的是,黃曲霉毒素與環(huán)境因素密切相關(guān),是一種天然的毒素,普通的食物處理方法不會(huì)減少黃曲霉毒素的含量,因此,國際上對(duì)黃曲霉毒素尤其是B1的限量要求日益嚴(yán)格,世界各國都對(duì)食品中的黃曲霉毒素的含量制定出了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法，本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測(cè)定花生糖中黃曲霉素的含量，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，滿足了檢疫標(biāo)準(zhǔn)確定量分析的需要。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法，包括如下具體步驟：
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，調(diào)節(jié)pH為6-8的范圍，之后倒入均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)5-10min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機(jī)溶液靜置一段時(shí)間，用濾紙吸去上層石油醚層，過濾后得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理20-30min，超聲功率800-1200w；
S5、將S3中得到的濾液稀釋，離心取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液用酶標(biāo)儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取并計(jì)算花生糖中黃曲霉素B1含量。
進(jìn)一步地，所述S1中過10-30目篩。
進(jìn)一步地，S2中所述石油醚-甲醇混合溶液中石油醚和甲醇的體積比為1:6。
進(jìn)一步地，所述S2中用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH。
進(jìn)一步地，所述S3中靜置時(shí)間為30-60min。
進(jìn)一步地，所述S5中加入等體積蒸餾水稀釋。
進(jìn)一步地，所述S5中離心速率為1000-2000r/min，離心時(shí)間為5-10min。
進(jìn)一步地，所述S6中培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)環(huán)境為避光環(huán)境，培養(yǎng)時(shí)間為20-40min。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測(cè)定花生糖中黃曲霉素的含量，超聲波的輻射壓強(qiáng)可以增大花生糖樣品中物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，提高提取效率，本發(fā)明降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，滿足了檢疫標(biāo)準(zhǔn)確定量分析的需要。
當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過10目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6，之后倒入均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)5min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機(jī)溶液靜置30min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾2次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理20min，超聲功率800w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于1000r/min離心機(jī)中離心5min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液用酶標(biāo)儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取并計(jì)算花生糖中黃曲霉素B1含量。
實(shí)施例2
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過30目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8，之后倒入均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)10min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機(jī)溶液靜置60min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾3次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理30min，超聲功率1200w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于2000r/min離心機(jī)中離心10min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液用酶標(biāo)儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取并計(jì)算花生糖中黃曲霉素B1含量。
實(shí)施例3
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過20目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7，之后倒入均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)7min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機(jī)溶液靜置45min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾2次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理25min，超聲功率1000w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于1500r/min離心機(jī)中離心7min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測(cè)液和黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液用酶標(biāo)儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取并計(jì)算花生糖中黃曲霉素B1含量。
本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測(cè)定花生糖中黃曲霉素的含量，超聲波的輻射壓強(qiáng)可以增大花生糖樣品中物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，提高提取效率，本發(fā)明降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，滿足了檢疫標(biāo)準(zhǔn)確定量分析的需要。
以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。