本發(fā)明涉及一種煙草及煙草制品中農藥殘留量的測定方法，屬于農藥殘留檢測領域。

背景技術：

目前，煙草生長過程中施用的農藥主要包括殺菌劑和殺蟲劑。殺菌劑常用的有多菌靈、腈菌唑、戊菌靈、霜霉威、甲基硫菌靈、三唑醇、三唑酮和嘧菌酯，殺蟲劑常用的有啶蟲脒和吡蟲啉。鑒于上述農藥在煙葉中的高殘留風險，嚴格控制煙草及煙草制品中農藥的殘留量是保證煙草制品吸食安全性的關鍵。國際煙草科學研究中心(CORESTA)于2003年提出對煙草中99種農藥給予指導性殘留限量，并于2013年將監(jiān)控指標擴充到120種。

口含煙制品是新型煙草制品的重要形式之一，不會產生“環(huán)境煙草煙氣”。國外口含型無煙氣煙草制品的常用添加劑包括甜味劑、酸堿調節(jié)劑、香精香料等，其制作工藝的多樣性造成該類制品在外觀、物理表征尤其是化學指標方面的較大差異。袋裝口含型無煙氣煙草制品是將磨碎的煙草顆粒加工后直接裝入小袋中，使用時將其放于口腔中，無需咀嚼，煙草成分經唾液溶解后通過口腔粘膜吸收。由于農藥殘留普遍存在于煙草中，而煙草是口含煙的主要原料，因此口含煙中不免有農藥殘留。但是口含煙的種類較多，基質差別各異，無法采用空白基質配標的方法進行定量分析。

同位素內標稀釋法能夠降低基質效應對定量結果的影響(同位素稀釋質譜法測定奶粉基體中藥物殘留的基質效應研究，楊總，2013；同位素稀釋-固相萃取-LC/MS/MS法測定嬰幼兒配方食品中雙酚類化合物，高夢婕等，分析化學)，同時LC-MS/MS法具有較高的檢測靈敏度以及較強的專屬性，無需使分析物之間完全色譜分離，樣品前處理操作簡單，分析測試時間短，可實現(xiàn)多類型多殘留農藥的同時分析。公布號CN105699538A的發(fā)明專利公開了一種卷煙主流煙氣中常用農藥含量的測定方法，包括：1)樣品前處理：在煙氣捕集氣相物中加入乙腈和內標，漩渦振蕩提取后再依次加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，漩渦振蕩提取后離心取上清，在上清中加入無水硫酸鎂和PSA吸附劑(N-丙基乙二胺)，漩渦振蕩提取后離心取上清，過濾，稀釋定容后待測；2)超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定：將待測溶液注入UPLC-MS/MS系統(tǒng)，色譜條件：UPLC HSST3色譜柱，100×2.1mm，粒徑1.8μm，流動相A：0.1％甲酸水溶液，流動相B：0.1％甲酸甲醇溶液，流速：0.4mL/min，柱溫：35℃，進樣量：2μL，洗脫條件：0～2min(90％A-50％A)，2～2.4min(50％A-30％A)，2.4～4min(30％A-20％A)，4～6min(20％A-5％A)，6～9.8min(5％A-5％A)，9.8～10min(5％A-90％A)，10～12min(90％A-90％A)；質譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓：2.6kV，離子化溫度：350℃，霧化氣流量：800L/Hr，錐孔氣流量：50L/Hr，碰撞氣流量：0.15mL/min，碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣，駐留時間：30msec，采集模式：正離子MRM，監(jiān)測離子對及其對應的碰撞能量見表1。該專利采用乙腈浸提，并利用基質分散固相萃取法提取和凈化樣品，經UPLC-MS/MS分析測定得到煙氣中仲丁靈、多菌靈、吡蟲啉、稻瘟靈、甲霜靈、腈菌唑、二甲戊靈、霜霉威、甲基硫菌靈、三唑酮和三唑醇的殘留量，該方法檢測靈敏度高，選擇性強，但是對煙草中色素等成分的去除效果欠佳，且僅采用TPP一種內標，不能去除基質效應的干擾不能進行準確定量。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種煙草及煙草制品中農藥殘留量的測定方法。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

煙草及煙草制品中農藥殘留量的測定方法，包括樣品的前處理步驟，具體為：在樣品中加入同位素混合內標溶液，平衡后加入乙腈進行提取，再加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉純化，純化后離心取上清液，在上清液中加入C18和中性氧化鋁凈化，凈化后過濾，即得待測溶液。

所述煙草制品如口含煙制品等。

所述同位素混合內標溶液的配制可采用以下步驟：分別將各農藥相應內標的標準品(如氘代物)與乙腈混合后定容，得到各農藥相應內標的標準儲備液；分別取一定量的各農藥相應內標的標準儲備液，混合后用乙腈定容，得到同位素混合內標溶液。

所述提取、純化、凈化均可采用漩渦振蕩的方式，如在轉速1800～2200rpm下漩渦振蕩1～6min。

所述提取中每1～2g樣品加入5～10mL乙腈。

所述純化中每1～2g樣品加入3～5g無水硫酸鎂、1g氯化鈉、1g檸檬酸鈉和0.5g檸檬酸氫二鈉。

所述凈化中每1mL上清液加入40～60mg C18和40～60mg中性氧化鋁。C18和中性氧化鋁均可購自安捷倫科技。

所述農藥包括多菌靈、腈菌唑、戊菌唑、霜霉威、甲基硫菌靈、三唑醇、三唑酮、啶蟲脒、吡蟲啉、嘧菌酯等。

煙草及煙草制品中農藥殘留量的測定方法，還包括農藥殘留量的測定步驟，具體為：將待測溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，以內標法定量分析，經計算得到煙草制品中農藥的殘留量；液相色譜條件為：色譜柱：Poroshell 120EC-C18，規(guī)格：100mm×3.0mm，粒徑2.7μm；流動相A：0.1％甲酸乙腈溶液(體積分數(shù))，流動相B：10mM甲酸銨水溶液，流速：0.4mL/min，柱溫：40℃，進樣量：10μL，洗脫條件(具體見下表1)：0～5min，90％A-60％A，5～10min，60％A-40％A，10～15min，40％A-10％A，15～20min，10％A-10％A，20～20.1min，10％A-90％A，20.1～30min，90％A-90％A；串聯(lián)質譜條件：電噴霧離子源，離子化溫度：500℃，電離電壓：5500V，掃描方式：正離子掃描，MRM模式采集(參數(shù)見下表2)，霧化氣流量：60psi，氣簾氣流量：20psi，輔助加熱氣流量：60psi，碰撞氣流量：12psi，四種氣體均為氮氣。

表1流動相梯度洗脫條件

表2各農藥及其同位素內標監(jiān)測離子對、去簇電壓及碰撞能量

注：嘧菌酯與吡蟲啉性質相似，二者均以吡蟲啉-d4為內標；其他農藥均以各自對應的氘代物為內標。

所述內標法定量分析為：將系列濃度的混合標準工作溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，以各農藥標準品與其相應內標的色譜峰面積的比值對應其濃度作回歸分析，得到標準曲線；將待測溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，得到各檢出農藥與其相應內標的色譜峰面積的比值，代入標準曲線，即得待測溶液中各農藥的濃度。

所述系列濃度的混合標準工作溶液的配制可采用以下步驟：分別將各農藥的標準品與乙腈混合后定容，得到各農藥的標準儲備液；分別取一定量的各農藥的標準儲備液，混合后用乙腈定容，得到混合標準儲備液；用乙腈將上述混合標準儲備液稀釋成具有濃度梯度的混合標準工作溶液，稀釋過程中分別加入同位素混合內標溶液，即為系列濃度混合標準工作溶液。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中樣品前處理操作簡單、快捷，雜質及干擾物的去除效率高，能大大縮短前處理時間。樣品經乙腈浸提后先用無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉提純，再用C18和中性氧化鋁凈化，能夠有效去除煙草中色素及煙草植物組織的其他共萃物(如脂肪酸、葉綠素等)，避免樣品濃縮、凈化、衍生等操作造成待測農藥組分的損失。

本發(fā)明中煙草制品農藥殘留量的測定方法具有以下優(yōu)點：1)由于口含煙種類繁多，基質差別各異，無法采用空白基質配標的方法進行定量分析，而同位素內標稀釋法能夠降低基質效應對定量結果的影響；2)操作簡單、快捷，檢測靈敏度高，重復性好，檢測限在0.002～0.011μg/g之間，加標回收率為85％～98％，平均相對標準偏差小于6％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中農藥殘留量測定方法的流程示意圖；

圖2為實施例1中混合標準工作溶液4的離子色譜圖；

圖3為實施例1中待測溶液的離子色譜圖。

具體實施方式

下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。

儀器與試劑：API 4000四極桿串聯(lián)質譜儀(美國AB公司)；渦旋振蕩儀(美國Labnet公司)；Sigma 3-30K離心機(德國Sigma公司)；AE 163電子天平(感量0.0001g)與AE 166電子天平(感量0.01g)(瑞士Mettler公司)。農藥均為標準品；乙腈、丙酮、甲酸均為農殘級。

實施例1

口含煙中農藥殘留量的測定方法(流程示意圖見圖1)，包括以下步驟：

1)樣品的前處理

樣品的提純：準確稱取1.0g口含煙樣品于50mL具塞離心管中，搗碎，加入100μL10μg/mL同位素混合內標溶液(溶液中各內標濃度均為10μg/mL)，并置于陰涼干燥處平衡24小時，以與被測物質均勻混合且交換完全，平衡后加入10mL乙腈，然后將離心管置于漩渦混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩5min，再向離心管中加入3g無水硫酸鎂、1g氯化鈉、1g檸檬酸鈉和0.5g檸檬酸氫二鈉(檸檬酸氫二鈉的離子數(shù)較檸檬酸二氫鈉多，鹽析效果更好)，立即置于漩渦混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩5min，然后以6000rpm速率離心3min。

樣品的凈化：移取1mL離心后的上清液于1.5mL離心管中，并加入50mg C18和50mg中性氧化鋁，于漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，再以6000rpm速率離心3min，吸取上清液，經0.45μm有機相濾膜過濾，得到待測溶液。

同位素混合內標溶液的配制步驟為：分別稱取10mg(精確至0.1mg)各農藥相應內標的標準品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到各農藥相應內標的標準儲備液；分別移取一定量的各農藥相應內標的標準儲備液于同一個100mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到10μg/mL的同位素混合內標溶液，于避光、-18℃下保存即可。

2)農藥殘留量的測定

系列濃度的混合標準工作溶液的配制步驟為：分別稱取10mg(精確至0.1mg)各農藥的標準品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到各農藥的標準儲備液；分別移取一定量的各農藥的標準儲備液于同一個100mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到10μg/mL的混合標準儲備液；分別移取混合標準儲備液20μL、50μL、100μL、250μL、500μL、1000μL于6個10mL的容量瓶中，并分別加入100μL上述同位素混合內標溶液，用乙腈定容，得到具有濃度梯度的混合標準工作溶液。

混合標準工作溶液中各農藥標準品的濃度見下表3。

表3系列濃度的混合標準工作溶液中各農藥標準品的濃度

將系列濃度的混合標準工作溶液分別注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，液相色譜條件為：色譜柱：Poroshell 120EC-C18，規(guī)格：100mm×3.0mm，粒徑2.7μm；流動相A：0.1％甲酸乙腈溶液(體積分數(shù))，流動相B：10mM甲酸銨水溶液，流速：0.4mL/min，柱溫：40℃，進樣量：10μL，洗脫條件(見表1)；串聯(lián)質譜條件：電噴霧離子源，離子化溫度：500℃，電離電壓：5500V，掃描方式：正離子掃描，MRM模式采集(參數(shù)見表2)，霧化氣流量：60psi，氣簾氣流量：20psi，輔助加熱氣流量：60psi，碰撞氣流量：12psi，四種氣體均為氮氣；測得各農藥標準品峰面積和其相應內標峰面積的比值與其濃度關系的一元線性回歸方程(各農藥的保留時間及相關參數(shù)見下表4)，混合標準工作溶液4的選擇離子色譜圖見圖2。

將待測溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，液相色譜及串聯(lián)質譜條件同上，得到各檢出農藥峰面積和其相應內標峰面積的比值，代入標準曲線，得到待測溶液中各農藥的濃度，其中嘧菌酯30ng/mL，多菌靈28ng/mL，選擇離子色譜圖見圖3)，再經計算得到口含煙中各農藥的殘留量，結果為嘧菌酯0.3μg/g，多菌靈0.28μg/g。

表4各農藥的保留時間及相關參數(shù)

實施例2

煙葉中農藥殘留量的測定方法，包括以下步驟：

1)樣品的前處理

樣品的提純：將干煙葉粉碎，準確稱取2.0g樣品于50mL具塞離心管中，搗碎，加入100μL 10μg/mL同位素混合內標溶液(同實施例1)，并置于陰涼干燥處平衡24小時，平衡后加入10mL乙腈，然后將離心管置于漩渦混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩5min，再向離心管中加入5g無水硫酸鎂、1g氯化鈉、1g檸檬酸鈉和0.5g檸檬酸氫二鈉，立即置于漩渦混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩5min，然后以6000rpm速率離心3min。

樣品的凈化：移取1mL離心后的上清液于1.5mL離心管中，并加入50mg C18和50mg中性氧化鋁，于漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，再以6000rpm速率離心3min，吸取上清液，經0.45μm有機相濾膜過濾，得到待測溶液。

2)農藥殘留量的測定

將待測溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，液相色譜及串聯(lián)質譜條件同實施例1，得到各檢出農藥峰面積和其相應內標峰面積的比值，代入實施例1的標準曲線中，得到待測溶液中各農藥的濃度，其中啶蟲脒120ng/mL，多菌靈165ng/mL，再經計算得到煙葉中各農藥的殘留量，結果為啶蟲脒1.2μg/g，多菌靈1.65μg/g。

在本發(fā)明的其他實施例中，提取、純化及凈化用試劑的加量均可適當調整，提取、純化及凈化操作中各參數(shù)也可適當調整。

試驗例

加標回收測試：為判斷實施例1中測定方法的準確性，特在樣品中加入濃度0.10μg/g的混合標準溶液(與同位素混合內標溶液一起加入)，同上進行樣品前處理及后續(xù)測定操作，加標回收測試結果見下表5。

精密度測試：在樣品中加入濃度0.10μg/g的混合標準溶液，同上進行樣品前處理及后續(xù)測定操作，共進行5次重復試驗，結果見下表5。

表5回收率和精密度測試結果