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一種時間分辨熒光免疫層析法定量測定降鈣素原的試劑盒的制作方法

文檔序號:12466880閱讀:2322來源:國知局
一種時間分辨熒光免疫層析法定量測定降鈣素原的試劑盒的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及一種定量檢測用于降鈣素原(PCT)的試劑盒(時間分辨熒光免疫層析法)。



背景技術(shù):

細菌或病毒等經(jīng)由創(chuàng)面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵,在嚴重創(chuàng)傷,全身抵抗力下降,體內(nèi)正常菌群失調(diào),細菌移位等時,均可引起機體出現(xiàn)嚴重的感染癥狀,是引起臨床各種并發(fā)癥,如膿毒癥、敗血癥休克,多器官功能障礙癥(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),乃至死亡的主要原因。據(jù)美國2001年統(tǒng)計資料顯示,該年僅重度膿血癥就有75.1萬例,平均死亡率高達28.5%,這意味著該年死亡的人數(shù)是愛滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的近三倍。對感染性疾病及其并發(fā)癥的早期診斷和及時治療,能有效的降低死亡率。而目前常規(guī)使用的診斷指標(如白細胞分類和計數(shù),C-反應(yīng)蛋白,血常規(guī)檢查等),是非特異性的,易引起誤診或漏診。

1990年發(fā)現(xiàn)的降鈣素原(procalcitonin,PCT)經(jīng)證實其在血清中濃度的增高與感染的發(fā)生有密切關(guān)系,能為疾病的診斷、鑒別,治療方案的選擇,預(yù)后判斷等提供新的實驗室標準。在正常及健康的個體中,其血清濃度極低,僅為10-50pg/ml,一般方法檢測不到。在全身性細菌、真菌及寄生蟲感染,系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活動性肝炎、創(chuàng)傷等患者的血清PCT水平異常增高,其濃度比正常水平大幾倍甚至上萬倍;其在病毒感染,自身免疫性疾病,器官移植排除反應(yīng)等患者血清中的濃度不增高或輕微增高。這現(xiàn)象決定了PCT的高度特異性,因此可用于此類疾病的鑒別診斷,在全身性細菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、預(yù)后判斷、療效觀察等方面有很高的臨床價值,可廣泛用于ICU病房、血液科、外科、內(nèi)科、器官移植科、治療實驗室等。

目前PCT在醫(yī)院和血液系統(tǒng)廣泛使用標記免疫分析技術(shù)的檢測方法,此技術(shù)具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于PCT的基礎(chǔ)研究和臨床各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究。最常用的標記免疫分析技術(shù)是放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA),但在實際應(yīng)用中存在以下缺陷:RIA的放射性核素污染、標記物的貨架期短;EIA酶的活性容易失活,導(dǎo)致其靈敏度不高,酶的大分子標記容易影響被標記物的空間結(jié)構(gòu),使得EIA靈敏度的提高受到限制。

免疫層析(Lateral Flow Immunoassay,LFIA)技術(shù)是近幾年來國內(nèi)外興起的一種快速診斷技術(shù)。LFIA以硝酸纖維素膜(NC膜)為載體,先將特異的抗體(抗原)固定于NC膜的某 一區(qū)帶,當(dāng)膜條一端滴加樣品(尿液或血清)后,由于毛細管作用,樣品將沿著該膜向前移動,當(dāng)移動至固定有抗體(抗原)的區(qū)域時,樣品中相應(yīng)的抗原(抗體)即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合,用免疫膠體金等染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色,從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。

目前的LFIA快速檢測試劑盒多以膠體金、彩色乳膠顆?;蛘邿晒馑刈鳛闃擞浳?。基于膠體金標記技術(shù)開發(fā)的快速檢測產(chǎn)品,存在靈敏度低、主要應(yīng)用于定性或者半定量、批間差異較大等問題;基于彩色乳膠顆粒雖然批間差異有所改善,但靈敏度依然較低,也只能定性或半定量;基于熒光素標記技術(shù)的免疫層析靈敏度得到很大提高,能進行定量檢測,但是由于樣本中含有較高的熒光本底信號,且stock位移較小,會對檢測產(chǎn)生較大的影響。

時間分辨熒光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一種非同位素?zé)晒鈽擞浳铮c普通熒光相比,具有stock位移大,熒光壽命長等特點,可以有效的避免樣品中的本底熒光,以及激發(fā)光等雜散光的影響,因此相比普通的熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。

本發(fā)明集合了時間分辨免疫熒光微球標記技術(shù)與免疫層析技術(shù)的各自優(yōu)點,兩大技術(shù)相結(jié)合得到一種新的方法,時間分辨熒光免疫層析法,開發(fā)出能精確定量的快速免疫層析檢測試劑盒。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種新型的、快速定量檢測降鈣素原(PCT)的時間分辨熒光免疫層析定量檢測試劑盒。

為了實現(xiàn)本發(fā)明,我們采用了以下技術(shù)方案:

1)根據(jù)和對照同類進口試劑盒進行臨床測值比較:

為了實現(xiàn)本發(fā)明,需要對試劑盒所使用的原料進行篩選,從而確定最佳的原料,這一篩選過程包括反應(yīng)模式、定標品與質(zhì)控品、原料的組合配對、硝酸纖維素膜、試劑參數(shù)優(yōu)化及性能評估等;

2)確定試劑盒的組分;

本發(fā)明提供的一種時間分辨免疫熒光層析法定量測定降鈣素原試劑盒,包括:定標品、質(zhì)控品、說明書、鋁膜袋、干燥劑及其包裝這些試劑瓶、試紙卡的包裝盒。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,采用雙抗體夾心法對人血清(漿)中的PCT進行檢測。試劑含有被事先固定于NC膜上的測試區(qū)(T)的PCT特異性的單克隆抗體2和質(zhì)控區(qū)(C)的羊抗鼠IgG,時間分辨熒光微球標記的PCT特異性單克隆抗體1。測試時,樣本滴加入加樣孔,隨之在毛細效應(yīng)下向觀察窗方向?qū)游?,并引發(fā)時間分辨熒光微球標記抗體的釋放,樣本中的PCT、時間分辨熒光微球標記的單克隆抗體PCT1以及固定于NC膜測試區(qū)的PCT特異 性單克隆抗體2形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu),無論樣本中有沒有PCT存在,質(zhì)控區(qū)羊抗鼠IgG都會與時間分辨熒光微球標記的PCT特異性單克隆抗體1結(jié)合,時間分辨熒光微球在特定波長的激發(fā)光作用下發(fā)射出特定波長的發(fā)射光,檢測區(qū)發(fā)射光信號的強弱與樣本中PCT的含量成正比。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,將濃度為100ng/ml的定值PCT血清用1.5%標準品稀釋液配制成定標品A-F,其濃度依次為:A:0ng/mL、B:0.5ng/mL、C:2ng/mL、D:10ng/mL、E:20ng/mL、F:40ng/mL。將濃度為100ng/ml的定值PCT血清用PCT陰性血清配制成濃度為0ng/mL、2ng/mL以及10ng/mL的質(zhì)控品。1.5%標準品稀釋液為50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.8),含0.9%NaCl、0.1%NaN3、0.01%Tween-20、1.5%BSA,2-8℃保存。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,選擇MJG03作為標記原料,購自杭州啟泰生物,16B5作為包被原料,購自Hytest。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,選擇MDI公司的70CNPH-N-SS40作為實驗用硝酸纖維素膜。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,最終選擇微球標記抗體用稀釋液稀釋為0.1mg/ml、噴量為0.1μl/mm,稀釋液主要組分為7.5%的BSA,使用時終濃度為0.1%。

根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案,最終選擇檢測線抗體16B5用15mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至4.2mg/ml及質(zhì)控線羊抗鼠IgG用10mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至1mg/ml,分別以0.08μl/mm劃線,稀釋液組分分別為:15mM PBS包被緩沖液(1L),取Na2HPO4·12H2O 5.37g,NaN31g,NaCl 8.77g和海藻糖30g,加適量純化水充分溶解,調(diào)節(jié)pH至7.4,再用純化水稀釋至1000ml;10mM PBS包被緩沖液(1L):取Na2HPO4·12H2O 3.58g,NaN31g,NaCl 8.77g和海藻糖30g,加適量純化水充分溶解,調(diào)節(jié)pH至7.4,再用純化水稀釋至1000ml。

本發(fā)明的試劑盒采用樣本類型為人血清或血漿標本。

利用本發(fā)明的試劑盒進行檢測,具有快速、操作簡單、可定量、無放射性污染等特點,非常適用于臨床檢測。

附圖說明

圖1為本試劑盒的反應(yīng)模式示意圖。

圖2為本試劑盒劑量-反應(yīng)曲線圖。

圖3為本試劑盒與Elecsys BRAHMS PCT試劑盒234例臨床血清樣本分析結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1試劑盒的組成

1)定標品,1套,分別編號A-F

2)質(zhì)控品,1套,分別編號C1-C3

3)鋁膜袋,1個/人份

4)干燥劑,1個/人份

5)說明書,1份

實施例2試劑盒的使用方法

步驟1:

試劑的準備:將試劑以及樣本平衡至室溫(指20-25℃范圍,下同)。

步驟2:

1)試劑的準備

試驗前,所有試劑及樣品均需平衡至室溫(指20-25℃范圍,下同)。

2)每孔加入40μl樣本。

3)室溫層析,充分反應(yīng)15min-30min。

4)測定各試劑卡熒光值。以定標品濃度的對數(shù)為橫坐標,熒光值的對數(shù)為縱坐標,參見附圖1。根據(jù)各待測樣本的CPS值在相應(yīng)劑量-反應(yīng)曲線上擬合出該樣本中PCT的濃度。

實施例3反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

硝酸纖維素膜的優(yōu)化:在反應(yīng)其它條件不變的情況下,我們將Millipore公司的HF 125、HF 150和MDI公司的70CNPH-N-SS40作為層析實驗用膜備選膜,通過一系列實驗對其性能進行研究,綜合考慮陽性熒光值、陰性本底以及檢測線與質(zhì)控線的均勻性效果,最終選擇MDI公司的70CNPH-N-SS40。

配對抗體原料的優(yōu)化:在反應(yīng)其它條件不變的情況下,對MJG03與16B5組合、138與118組合以及118與138組合分別進行如下3組時間分辨免疫熒光檢測實驗,并將結(jié)果統(tǒng)計如下,根據(jù)軟件SPSS 13.0以定標品濃度的對數(shù)為橫坐標,熒光值的對數(shù)為縱坐標,由雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,計算劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)(r),同時輔以時間分辨免疫熒光法方法學(xué)的評判標準,選擇TRF1A檢測中效果最好的一組,綜合以上結(jié)果,最終選擇MJG03作為標記原料,16B5作為包被原料。TRFIA法篩選結(jié)果見表1。

表1抗體篩選結(jié)果

劃線量的優(yōu)化:在反應(yīng)其它組分不變的情況下,以不同包被量包被于NC膜上,具體如下:

組合一:將檢測線抗體16B5用15mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至4.2mg/ml及質(zhì)控線羊抗鼠IgG用10mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至1mg/ml,分別以0.08μl/mm劃線,制成檢測線T及質(zhì)控線C,劃線結(jié)束后在濕度低于40%的條件下,20~37℃干燥。

組合二:將檢測線抗體16B5用15mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至4.2mg/ml及質(zhì)控線羊抗鼠IgG用10mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至1mg/ml,分別以0.12μl/mm以及0.08μl/mm劃線,制成檢測線T及質(zhì)控線C,劃線結(jié)束后在濕度低于40%的條件下,20~37℃干燥。

將干燥后的時間分辨熒光微球標記抗體結(jié)合墊,NC膜以及其它輔料進行組裝并切條,通過下一步的性能檢測,最終選擇檢測線抗體16B5用15mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至4.2mg/ml及質(zhì)控線羊抗鼠IgG用10mM PBS(pH 7.4)包被緩沖液稀釋至1mg/ml,分別以0.08μl/mm劃線。檢測結(jié)果如下表:

表2標記抗體使用量

實施例4試劑盒的實驗室性能

對實施例1的試劑盒進行實驗室性能分析,結(jié)果如下:

1)最低檢測量

0.08ng/ml。

2)準確性

取高值PCT血樣一份,德國Roche Diagnstics Gmbu公司生產(chǎn)的降鈣素原檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)測得其濃度為62.8ng/ml,用PCT陰性血清對其進行倍比稀釋作為樣品,在自制試劑盒上測定,計算其理論值及實測值的比值。各設(shè)3個平行實驗,計算回收率。見表3。實測濃度與期望濃度測值的比值在0.90-1.13之間,回收率在90%-113%之間。

表3準確度檢測結(jié)果

3)劑量-反應(yīng)曲線的線性

按試劑盒操作步驟測定定標品A-F(A:0ng/mL、B:0.5ng/mL、C:2ng/mL、D:10ng/mL、E:20ng/mL、F:40ng/mL)。在定標品B(0.5ng/mL)與定標品F(40ng/mL)之間的濃度范圍內(nèi),以定標品濃度的對數(shù)為橫坐標,熒光值的對數(shù)為縱坐標,由雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,線性回歸方程為Y=0.872X+3.088,計算劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù),r=0.9994。試劑盒的劑量-反應(yīng)曲線圖見附圖2。

4)精密度(CV%)

測定低、中、高3個質(zhì)控品(質(zhì)控品I、II、III),分析內(nèi)精密度實驗設(shè)5個試劑條,分析間精密度實驗設(shè)同一批次試劑,3個不同人獨立操作,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及變異系數(shù)(CV)。結(jié)果分析內(nèi)變異系數(shù)為5.4%-7.7%,分析間變異系數(shù)為5.7%-13.4%。

5)特異性

將CRP、IL-6、人降鈣素、人抗鈣素以定標品稀釋液分別稀釋至50ng/mL、1IU/mL、60ng/mL及30ng/mL作為樣本,用配套儀器測定,結(jié)果均小于0.08ng/mL。結(jié)果表明本試劑盒與CRP、IL-6、人降鈣素和人抗鈣素?zé)o交叉反應(yīng)。

實施例6試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比較

采用盲法對照的臨床試驗設(shè)計,用本試劑盒與羅氏Elecsys BRAHMS PCT試劑盒共同檢測臨床樣本,共檢測樣本234例次,其中臨床確診為PCT陽性樣本151例,陰性樣本83例。使用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0,對數(shù)據(jù)進行分析,Y=0.898X+0.750,相關(guān)系數(shù)R=0.977,R2=0.955,P<0.0001,研究結(jié)果表明待考核試劑可靠、準確、安全、簡便、穩(wěn)定,具有較高的臨床應(yīng)用價值。

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