本發(fā)明屬于細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于電流型便攜式葡萄糖傳感器(PGM)和磁性納米微球快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法。

背景技術(shù)：

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii,簡(jiǎn)稱C.sakazakii)，是一種革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科，來(lái)源廣泛，對(duì)成年人而言是一種條件致病菌，危害不大，但對(duì)嬰幼兒危害卻非常嚴(yán)重，特別是對(duì)于早產(chǎn)和免疫功能低下嬰兒的危害特別嚴(yán)重，其感染嬰兒的死亡率高達(dá)40-80％。目前對(duì)C.sakazakiisyn檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)檢測(cè)方法和各種PCR法，我國(guó)對(duì)于C.sakazakiisyn的國(guó)標(biāo)傳統(tǒng)的檢測(cè)方法完成整個(gè)檢測(cè)程序需要6～7d，耗時(shí)且過(guò)程復(fù)雜。PCR法雖然具有敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，但是成本高、操作復(fù)雜以及對(duì)工作人員要求高等缺陷，而使其難以在基層檢測(cè)單位普及和推廣。因此，研制出更好的快速檢測(cè)方法對(duì)該菌的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)有技術(shù)中S.aureus的定性和定量檢測(cè)方法不足之處在于如果樣品中目的菌的含量較少時(shí)，對(duì)6h培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果不確實(shí)，需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行培養(yǎng)24h再進(jìn)行檢測(cè)，才能獲得準(zhǔn)確結(jié)果，雖然已經(jīng)是比較快且具有準(zhǔn)確穩(wěn)定簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)等突出優(yōu)點(diǎn)，但怎樣使低污染樣品也能在6h培養(yǎng)物檢測(cè)時(shí)獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的結(jié)果，就需要進(jìn)一步有效改善檢測(cè)方法的敏感性。

電流型便攜式葡萄糖傳感器(簡(jiǎn)稱便攜式血糖儀，Personal glucose meters，PGM)具有體積微小、便攜、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，己被廣泛應(yīng)用于糖尿病患者血糖的醫(yī)院隨時(shí)檢測(cè)和自我監(jiān)測(cè)。將具有如此突出優(yōu)點(diǎn)和成熟的檢測(cè)技術(shù)引入到繁瑣的食品致病菌和抗生素殘留的快速檢測(cè)領(lǐng)域，具有很好的創(chuàng)新性、研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。目前僅有的基于PGM構(gòu)建的對(duì)非糖類物質(zhì)檢測(cè)的方法所必須用到的蔗糖轉(zhuǎn)化酶標(biāo)記抗體或核酸類物質(zhì)等生物制劑的制備較繁瑣，活性等易受貯存時(shí)間和貯存環(huán)境等條件作用而降低，不但影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)，在簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)方面的優(yōu)勢(shì)也受到了很大影響。

免疫磁性分離技術(shù)是(Immunomagnetic separation,IMS)以其高特異性、快速高效、操作簡(jiǎn)便和不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用在微生物學(xué)檢測(cè)、生物分離、醫(yī)學(xué)治療及環(huán)境檢測(cè)等。免疫磁珠(Immunemagnetic beads，簡(jiǎn)稱IMB)，目前應(yīng)用最廣的為核殼免疫磁珠，其核心部分為穩(wěn)定的高磁性材料(Fe₃O₄，F(xiàn)e₂O₃)，核外包裹一層高分子材料(如聚氯乙稀，二氧化硅)，最外層是功能基層(如羥基，氨基，醛基)。IMBS具有特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，效率高和不需要昂貴的外用儀器等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于食源性致病菌的前處理中，可以直接從樣品中或前增菌物中分離靶細(xì)菌，可以取代傳統(tǒng)的增菌過(guò)程，能高效地富集樣品中的少量目標(biāo)菌，可使采樣和檢測(cè)的時(shí)間減少1d，提高對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的效率，同時(shí)也提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性。

食品中組分復(fù)雜，含有多種雜菌，嚴(yán)重干擾了目標(biāo)菌的檢測(cè)，檢測(cè)前通常需要對(duì)樣品進(jìn)增菌、分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)，達(dá)到富集目標(biāo)菌的目的。免疫磁性分離技術(shù)是具有高特異性和快速、簡(jiǎn)便和易分離的一種分離技術(shù)，通過(guò)IMNS對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行富集分離，目標(biāo)菌與IMNS發(fā)生特應(yīng)性反應(yīng)從而被捕獲到微球表面。應(yīng)用免疫磁性技術(shù)能從病原菌很少的用品中快速富集目標(biāo)菌，用集菌來(lái)取代増菌步驟，提高檢出率，縮短檢出時(shí)間，以提供更快捷的快速檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種基于PGM和磁性納米微球快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法。

基于PGM和磁性納米微球快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)用化學(xué)共沉淀法合成磁性二氧化硅納米微球；

(2)將磁性二氧化硅納米微球選混于乙醇中，完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；然后將氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球與戊二醛反應(yīng)，離心分離得到醛基化的磁性二氧化硅微球；將醛基化的磁性二氧化硅微球顆粒與阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體結(jié)合，制得表面修飾有阪崎克羅諾桿菌抗體的免疫磁珠；

(3)取步驟(2)所得免疫磁珠60μL，加入到1mL檢測(cè)樣本菌懸液中，37℃下孵育45min后，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌，混合均勻，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每個(gè)離心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，用電流型便攜式葡萄糖傳感器檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化ΔC，ΔC＝C₁－C₂，C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度；

(4)根據(jù)線性方程為ΔC(mmol/L)＝5.36lg[CFU·ml^-1]-5.74，計(jì)算檢測(cè)樣本中阪崎克羅諾桿菌的數(shù)量。

進(jìn)一步地，步驟(1)用化學(xué)共沉淀法合成磁性二氧化硅納米微球的具體步驟包括：取1.35mM FeCl₂·4H₂O溶解于盛有70mL蒸餾水的三頸燒瓶中，在N₂保護(hù)下劇烈攪拌，再將2.7mM FeCl3·6H2O和5mL氨水迅速加入到體系中，迅速升溫至80℃持續(xù)反應(yīng)80min；反應(yīng)結(jié)束后，將得到的黑色沉淀物用磁鐵磁性分離，用蒸餾水洗滌數(shù)次，定容于60mL蒸餾水中，得Fe₃O₄溶液；取Fe₃O₄溶液30mL置于250mL的燒瓶中，在燒杯中再加入60mL乙醇和9mL氨水，混合后攪拌，然后再加入50μL TEOS和200μL APTMS，在35℃下攪拌反應(yīng)1h，取出攪拌子靜置過(guò)夜；將其依次用乙醇和蒸餾水洗滌，分離得到沉淀物即為磁性二氧化硅微球。

步驟(2)的具體步驟是：取250μL磁性二氧化硅微球懸混于20mL乙醇中，加入100μL APTMS，于室溫下攪拌反應(yīng)12h，離心分離；然后依次采用乙醇和pH7.3的PBS溶液進(jìn)行洗滌，再離心分離，即完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化；取20mL氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球懸濁液，再加入10mL2.5％戊二醛，于室溫下攪拌反應(yīng)3h，再離心分離，即完成微球的醛基化；將醛基化的磁性二氧化硅微球顆粒懸混于10mL PBS溶液，加入40μL阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體，于37℃下溫育3h，離心分離，即制得表面修飾有阪崎克羅諾桿菌抗體的免疫磁性微球；將免疫磁性微球混合于10mL PBS溶液中，加入1mL濃度為1％的BSA，在室溫下攪拌2h，以封閉免疫磁性微球表面非特異性結(jié)合醛基位點(diǎn)，離心分離，最后以PBS溶液洗滌，并懸混于10mL PBS溶液，4℃下保存。

用IMB和PGM檢測(cè)C.sakazakiisyn的各檢測(cè)步驟及其原理如圖1所示，C.sakazakiisyn在生長(zhǎng)代謝時(shí)往往可以利用葡萄糖作為碳源，在葡萄糖-肉湯培養(yǎng)液中，C.sakazakiisyn以葡萄糖作為第一碳源，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中不斷消耗葡萄糖，引起培養(yǎng)液中葡萄糖濃度發(fā)生變化(ΔC)。用免疫磁珠將樣品中的C.sakazakiisyn富集下來(lái)，洗滌數(shù)次，再加200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)7h后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，C.sakazakiisyn利用培養(yǎng)液中的葡萄糖不斷生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致培養(yǎng)液中葡萄糖被消耗而濃度逐漸減小，葡萄糖濃度可由PGM測(cè)得，并且葡萄糖的消耗量與菌濃度有關(guān)。結(jié)果表明，該方法可通過(guò)用PGM測(cè)定培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)來(lái)檢測(cè)C.sakazakiisyn。

基于免疫磁性納米微球(Immunomagnetic nanospheres，IMNs)的特異性和富集作用，結(jié)合PGM及其配套電極，以嬰幼兒配方奶粉中對(duì)嬰幼兒威脅最嚴(yán)重的致病菌--阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakiisyn，C.sakazakiisyn)為檢測(cè)對(duì)象，以創(chuàng)建一種快速、準(zhǔn)確和靈敏的食品致病菌檢測(cè)新技術(shù)。通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成磁性納米粒子，通過(guò)硅烷化和醛基化進(jìn)行活化，在活化后的磁球表面偶聯(lián)上抗C.sakazakiisyn的多克隆抗體，將制成的IMNs的用于捕獲和富集樣品中的C.sakazakiisyn，形成IMNs-C.sakazakiisyn復(fù)合物。經(jīng)磁分離，將IMNs-C.sakazakiisyn復(fù)合物加入到設(shè)計(jì)研究好的專用培養(yǎng)基中。通過(guò)對(duì)IMNs的工作濃度、孵育時(shí)間、磁分離時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化和選擇，并對(duì)其它幾種細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果表明，在最佳檢測(cè)條件下，當(dāng)C.sakazakiisyn濃度在10¹～10⁵cfu/mL變化時(shí)，葡萄糖濃度變化量(ΔC)隨菌濃度對(duì)數(shù)值的增加而呈相應(yīng)的線性增長(zhǎng)，檢出限為5.2×10¹cfu/mL(S/N＝3)。此方法無(wú)需耗時(shí)的増菌和分離純化培養(yǎng)過(guò)程和復(fù)雜的檢測(cè)過(guò)程，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和快速，并且顯著增加了檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，是一種應(yīng)用前景很好的奶粉和牛奶中C.sakazakiisyn的快速檢測(cè)方法。

附圖說(shuō)明

圖1是PGM檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的原理圖。

圖2是Fe₃O₄@SiO₂磁球透射電子顯微鏡(TEM)照片。

圖3是是Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂,Fe₃O₄@SiO₂-NH₂和Fe₃O₄@SiO₂@抗體的紅外光譜圖。

圖4在不同體積免疫磁珠下的葡萄糖濃度變化曲線圖。

圖5是不同孵育時(shí)間下的葡萄糖濃度變化曲線圖。

圖6是不同磁分離時(shí)間下的葡萄糖濃度變化曲線圖。

圖7是特異性試驗(yàn)示意圖。

圖8是葡萄糖濃度變化(ΔC)與阪崎克羅諾桿菌濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

(一)磁性二氧化硅納米微球的合成

利用化學(xué)共沉淀法合成磁性Fe₃O₄，取FeCl₂·4H₂O(1.35mM)溶解于盛有70mL蒸餾水的三頸燒瓶中，在N₂保護(hù)下劇烈攪拌，再將FeCl3·6H2O(2.7mM)和5mL氨水迅速加入到體系中，迅速升溫至80℃持續(xù)反應(yīng)80min。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的黑色沉淀物用磁鐵磁性分離，用蒸餾水洗滌數(shù)次，定容于60mL蒸餾水中。

取上述Fe₃O₄溶液30mL置于250mL的燒瓶中，在燒杯中再加入60mL乙醇和9mL氨水，混合后攪拌，然后再加入50μL TEOS和200μL APTMS，在35℃下攪拌反應(yīng)1h，取出攪拌子靜置過(guò)夜。將其依次用乙醇和蒸餾水洗滌。在每次清洗過(guò)程中，都應(yīng)利用外加磁場(chǎng)使磁性微球從分散的溶液中沉淀下來(lái)，分離最終得到的沉淀物即為磁性二氧化硅微球。

(二)磁性二氧化硅顆粒的氨基硅烷化及抗體標(biāo)記

利用戊二醛作為偶聯(lián)劑合成磁性免疫微球。①取一定量(250μL)磁性二氧化硅微球懸混于20mL乙醇中，加入100μL APTMS，于室溫下攪拌反應(yīng)12h，離心分離；然后依次采用乙醇和PBS溶液(pH7.3)進(jìn)行洗滌，再離心分離，即完成磁性二氧化硅微球的氨基硅烷化。②取20mL氨基硅烷化的磁性二氧化硅微球懸濁液，再加入10mL 2.5％戊二醛，于室溫下攪拌反應(yīng)3h，再離心分離，即完成微球的醛基化。③將醛基化的磁性二氧化硅微球顆粒懸混于10mL PBS溶液，加入40μL C.sakazakiisyn多克隆抗體，于37℃下溫育3h，離心分離，即制得表面修飾有C.sakazakiisyn抗體的免疫磁性微球。然后，將顆?；旌嫌?0mL PBS溶液中，加入1mL濃度為1％的BSA，在室溫下攪拌2h，以封閉免疫磁性微球表面非特異性結(jié)合(醛基)位點(diǎn)，離心分離，最后以PBS溶液洗滌，并懸混于10mL PBS溶液，直接用于分析或于4℃下保存。

利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察磁性納米粒子的顆粒形態(tài)和分散狀態(tài)，并測(cè)定其粒徑大小。將合成好的磁性納米粒子用超純水稀釋到合適的濃度，取一到兩滴滴在銅網(wǎng)的碳支持膜上，在室溫下晾干，并放置一段時(shí)間(約15-20min)，在透射電子顯微鏡下觀察磁性納米粒子的大小及狀態(tài)。如圖2所示，TEM照片可以看出磁性Fe₃O₄納米顆粒已經(jīng)被二氧化硅包裹，可以明顯看到核殼結(jié)構(gòu)，中間深色部分為磁性Fe₃O₄納米顆粒，外面一層灰色的為二氧化硅。從圖中也可看出，所制得的Fe₃O₄@SiO₂磁球具有外觀成球性較好，球體表面均勻，無(wú)雜質(zhì)粘連，很好的分散性，且粒徑均勻，粒徑在160-200nm之間，平均約為180nm,球與球之間無(wú)粘連，分散性好。

取少量所測(cè)樣品干燥過(guò)夜，與KBr粉末混研、壓片，在Thermo Nicolet 380傅立葉變換紅外光譜儀上，4000-400cm^-1，測(cè)定紅外光譜。分辨率為0.4cm^-1，，掃描次數(shù)為32次，測(cè)定吸收信號(hào)。圖3是Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂,Fe₃O₄@SiO₂-NH₂和Fe₃O₄@SiO₂@抗體的紅外光譜圖。(a)是Fe₃O₄納米粒子的紅外圖譜，582cm^-1是Fe₃O₄納米粒子的Fe-O鍵的特征吸收峰。(b)是Fe₃O₄@SiO₂納米粒子的紅外圖譜，可看到在1050cm^-1處有較大并且較寬的吸收峰，而SiO₂的標(biāo)準(zhǔn)圖譜中1103cm^-1處較大并且較寬的吸收峰，為Si-O的伸縮振動(dòng)峰，因此與純SiO₂的標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比，1103cm^-1處較大且較寬的吸收峰Si-O的伸縮振動(dòng)峰發(fā)生了“紅移”，向低波數(shù)方向移動(dòng)，證明了Fe₃O₄的表面羥基與SiO₂層發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。(b)是修飾上氨基的Fe₃O₄@SiO₂納米粒子的紅外圖譜，觀察到的1543和1389cm^-1兩處的峰為-NH₂的特征峰，并且在2925和2850cm^-1處對(duì)應(yīng)的為APTMS的C-H伸縮振動(dòng)峰，表明氨基已經(jīng)修飾到Fe₃O₄@SiO₂納米粒子上(b)是修飾上抗體的Fe₃O₄@SiO₂納米粒子的紅外圖譜，在1543和1389cm^-1兩處-NH₂的特征峰的消失表明抗體已經(jīng)成功的修飾到了Fe₃O₄@SiO₂納米粒子上。(三)菌株制備

取C.sakazakiisyn斜面菌種1支，在無(wú)菌操作臺(tái)下進(jìn)行操作，用接種環(huán)挑取一環(huán)，接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，靜置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，制備獲得C.sakazakiisyn菌懸液，將菌懸液用生理鹽水稀釋為10¹-10⁵cfu/mL。

實(shí)施例2：免疫磁珠及血糖儀檢測(cè)C.sakazakiisyn方法的建立

(一)免疫磁珠最佳工作濃度的確定

分別取免疫磁珠(IMB)20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，120μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌懸液(10⁵cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，用磁鐵吸附2min-3min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌懸浮，充分混勻，用磁鐵吸附2min-3min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每管加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化(ΔC)，ΔC＝C₁－C₂,C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度。

(二)免疫磁珠與菌液最佳作用時(shí)間

取IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌懸液(10⁵cfu/mL)中，37℃下分別孵育5min、15min、30min、45min、60min后，用磁鐵吸附2min-3min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌，混合均勻，用磁鐵吸附2min-3min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每個(gè)離心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化(ΔC)，ΔC＝C₁－C₂,C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度。

用PGM測(cè)定7h后培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)，若加入的免疫磁珠過(guò)多或過(guò)少時(shí)ΔC都會(huì)變小，即細(xì)菌的富集量減少，因此選用60μL作為免疫磁珠的最適工作濃度，確定菌液中免疫磁珠的最適工作體積為60μL，結(jié)果見圖4。

(三)磁孵育和分離的最佳時(shí)間

IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn菌懸液(10⁵cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，分別用磁鐵吸附0.5min、1min、1.5min、2min、5min、10min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌，充分混勻，用磁鐵吸附0.5min、1min、2min、3min、5min、10min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每個(gè)離線管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化(ΔC)，ΔC＝C₁－C₂,C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度。

孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，免疫磁珠越有利于吸附目標(biāo)菌，磁珠越小會(huì)使粒子的布朗運(yùn)動(dòng)越激烈，和目標(biāo)菌結(jié)合的速度就越快，但是孵育時(shí)間太長(zhǎng)不僅會(huì)增加非特異性吸附，又延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。用PGM測(cè)定7h后培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到45min時(shí)，ΔC達(dá)到最大值，并且之后趨于平緩，因此為使達(dá)到最佳捕獲效率，在之后的試驗(yàn)中孵育時(shí)間均為45min。

免疫磁珠吸附目標(biāo)菌后，在吸鐵石的作用下會(huì)被磁鐵吸附聚集起來(lái)，從而達(dá)到分離的效果，其分離速度受磁場(chǎng)的大小、免疫磁珠的大小、目標(biāo)菌表面結(jié)合的免疫磁珠的量、目標(biāo)菌大小和樣品粘稠力等因素的影響。用PGM測(cè)定7h后培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)磁分離時(shí)間為2min時(shí)，ΔC達(dá)到最大值，并且之后趨于平緩，考慮到磁分離時(shí)間可能會(huì)受到樣品基質(zhì)的影響，為得到最佳的富集效率，在后面的試驗(yàn)中選定的最適磁分離時(shí)間為2min。

(四)特異性試驗(yàn)

取IMB 60μL，加入到1mL的C.sakazakiisyn,S.aureus,E.coli,V.parahaemolyticus,B.cereus,B.subtillis和S.gallinarum菌懸液(10⁵cfu/mL)中，37℃下孵育45min后，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌，混合均勻，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每個(gè)離心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化(ΔC)，ΔC＝C₁－C₂,C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度。

用PGM分別測(cè)定7h后的C.sakazakiisyn,S.aureus,E.coli,V.parahaemolyticus,B.cereus,B.subtillis和S.gallinarum培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)，如圖7所示，C.sakazakiisyn培養(yǎng)物中的ΔC最大，其他幾種菌培養(yǎng)物中的ΔC明顯低于C.sakazakiisyn的，結(jié)果表明此方法對(duì)C.sakazakiisyn的檢測(cè)有較好的特異性。

實(shí)施例3：葡萄糖濃度變化量(ΔC)與菌液濃度的關(guān)系

IMB 60μL，加入到1mL的濃度梯度為10¹-10⁵cfu/mL的C.sakazakiisyn菌懸液中，37℃下孵育45min后，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，加入PBS洗滌，混合均勻，用磁鐵吸附2min，分離上清和磁珠，棄去上清，重復(fù)洗滌3次，每個(gè)離心管中加入200μL含20.0mmol/L葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)7h后，檢測(cè)并計(jì)算各培養(yǎng)物中葡萄糖濃度的變化(ΔC)，ΔC＝C₁－C₂,C₁為0h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度，C₂為7h培養(yǎng)物中葡萄糖濃度。

在最佳條件下，各濃度梯度C.sakazakiisyn標(biāo)準(zhǔn)菌液在葡萄糖-肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)7h后，培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)與C.sakazakiisyn濃度如圖8所示。當(dāng)C.sakazakiisyn濃度在10¹-10⁵cfu/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，培養(yǎng)物中葡萄糖濃度變化量(ΔC)與C.sakazakiisyn濃度對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔC(mmol/L)＝5.36lg[CFU·ml^-1]-5.74，相關(guān)系數(shù)R為0.9844，檢出限為5.2×10¹cfu/mL(S/N＝3)。

實(shí)施例4：準(zhǔn)確性試驗(yàn)

將牛奶三類樣品分別隨機(jī)分成5組，每組3份，分別用PGM進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品測(cè)定5次，并將檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比。

在最佳條件下，分別用本發(fā)明方法與國(guó)標(biāo)法對(duì)各樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下表所示。由表可知，與國(guó)標(biāo)法相比，該方法具有較高的準(zhǔn)確率，結(jié)果表明便攜式PGM對(duì)奶粉中C.sakazakiisyn的檢測(cè)有良好的準(zhǔn)確度和靈敏度。

本發(fā)明基于PGM和免疫磁性分離技術(shù)，以葡萄糖為信號(hào)轉(zhuǎn)換分子，利用合成的免疫磁球富集分離樣品中的目標(biāo)菌，發(fā)展了一種新穎的、簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的方法用于C.sakazakiisyn的檢測(cè)。合成免疫磁性微球，富集分離C.sakazakiisyn，利用附著在免疫磁性微球的C.sakazakiisyn在生長(zhǎng)過(guò)程中消耗葡萄糖，將C.sakazakiisyn的檢測(cè)轉(zhuǎn)換成對(duì)葡萄糖的檢測(cè)。本方法具有良好的特異性，并且與GB方法相比，具有較好的準(zhǔn)確性。研究證明，PGM結(jié)合磁性分離技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的C.sakazakiisyn，因此為C.sakazakiisyn的快速檢測(cè)提供了一種新的手段和方法。