本發(fā)明涉及化學(xué)分析方法，尤其涉及β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)分析方法。

背景技術(shù)：

β-葡聚糖來(lái)源廣泛，市場(chǎng)上β-葡聚糖主要來(lái)源為燕麥葡聚糖、真菌葡聚糖、海藻葡聚糖、酵母葡聚糖等。不同來(lái)源的β-葡聚糖結(jié)構(gòu)不同，從而導(dǎo)致生物活性的不同。β-葡聚糖存在兩種結(jié)構(gòu)：一種是β-1,3-葡聚糖與β-1,4-葡聚糖的混合物，如燕麥β-葡聚糖；另一種是以1,3-糖苷鍵為主鏈、1,6-糖苷鍵為支鏈的β-葡聚糖，如真菌葡聚糖、海藻葡聚糖等。研究結(jié)果表明，由1,3-、1,6-糖苷鍵鏈結(jié)的β-葡聚糖具有抑制腫瘤、激活機(jī)體免疫、抗衰老、抗過(guò)敏、穩(wěn)定腸道菌群等多重功能，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了由1,3-、1,4-糖苷鍵鏈結(jié)的燕麥葡聚糖。因此，不同結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖功效差別很大，對(duì)其結(jié)構(gòu)的檢測(cè)顯得尤為重要。

目前，對(duì)于β-葡聚糖結(jié)構(gòu)分析方法還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的方法里主要是紅外光譜、核磁共振等結(jié)合使用，利用譜圖的數(shù)據(jù)分析得到相應(yīng)結(jié)構(gòu)。但是，紅外光譜和核磁共振的相關(guān)設(shè)備昂貴，費(fèi)用非常高，測(cè)定條件苛刻，對(duì)設(shè)備要求高，不適合一般實(shí)驗(yàn)室操作；并且，β-葡聚糖為大分子多糖結(jié)構(gòu)，粘度大，溶解度不高，這直接影響到紅外光譜以及核磁共振的測(cè)定結(jié)果，很難得到高清譜圖，對(duì)解譜造成一定的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)分析方法，能夠用化學(xué)分析方法鑒別以1,3-、1,6-糖苷鍵鏈結(jié)的β-葡聚糖和以1,3-、1,4-糖苷鍵鏈結(jié)的β-葡聚糖。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取待測(cè)樣品溶于水形成溶液，用堿性酒石酸銅溶液滴定法測(cè)出還原糖量x₀；

(2)取淀粉酶溶于水形成溶液，加入待測(cè)樣品，反應(yīng)完全后用堿性酒石酸銅溶液滴定法測(cè)出還原糖量x₁；

(3)取蝸牛酶溶于磷酸緩沖液形成溶液，加入待測(cè)樣品，反應(yīng)完全后用堿性酒石酸銅溶液滴定法測(cè)出還原糖量x₂；

(4)取待測(cè)樣品溶于水，加入足量的高碘酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)完全后加入乙二醇破壞過(guò)量的高碘酸鈉，測(cè)試溶液于223nm波長(zhǎng)處的光密度，計(jì)算得到高碘酸的消耗量n₁摩爾；

(5)取步驟(4)得到的溶液，用氫氧化鈉溶液滴定，計(jì)算得到甲酸釋放量n₂摩爾。

淀粉酶是專(zhuān)一性水解1,4-糖苷鍵的酶；蝸牛酶是專(zhuān)一性水解1,3-糖苷鍵的酶。x₀是未做處理的樣品中的還原糖量，x₁是通過(guò)淀粉酶水解后的樣品中的還原糖量，x₂是蝸牛酶水解后的樣品中的還原糖量。當(dāng)x₁-x₀≠0時(shí)，說(shuō)明樣品中存在1,4-糖苷鍵；當(dāng)x₂-x₀≠0時(shí)，說(shuō)明樣品中存在1,3-糖苷鍵。通過(guò)測(cè)定水解后有無(wú)還原糖存在，可以判定樣品是否存在1,4-糖苷鍵或1,3-糖苷鍵。

高碘酸可選擇性斷裂糖分子中的鄰二羥基或鄰三羥基處,生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。反應(yīng)定量進(jìn)行,每開(kāi)裂1個(gè)C—C鍵消耗1分子高碘酸。通過(guò)測(cè)定高碘酸的消耗量及甲酸的釋放量,可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度、分支多糖的分支數(shù)等。將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后酸水解，再鑒定水解產(chǎn)物，從而推斷糖苷鍵的位置與分支點(diǎn)等。以葡萄糖為例，以1-2或1-4位鍵合的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個(gè)糖基消耗1分子高碘酸，且無(wú)甲酸釋放；1-3位鍵合的糖基不被高碘酸氧化；1-6位鍵合的糖基或非還原末端糖基經(jīng)高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同時(shí)釋放1分子甲酸。當(dāng)n₁＝2n₂且均不為零時(shí)，說(shuō)明高碘酸的消耗是甲酸生成的2倍，多糖中以1-6位鍵合的糖基或非還原末端基經(jīng)高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同時(shí)釋放1分子甲酸，由此可以推測(cè)，樣品含有1,6-糖苷鍵。

結(jié)合上述兩個(gè)結(jié)論，可以鑒別被測(cè)β-葡聚糖樣品是以1,3-、1,6-糖苷鍵鏈結(jié)還是以1,3-、1,4-糖苷鍵鏈結(jié)，進(jìn)而鑒別β-葡聚糖的種類(lèi)。

進(jìn)一步地，為了保證一定的水解速度和水解程度，上述步驟(2)的淀粉酶為100-300u/mg活性單位，步驟(3)的蝸牛酶為200-300u/mg活性單位。

進(jìn)一步地，為了使蝸牛酶產(chǎn)生有效的水解作用，上述步驟(3)的磷酸緩沖液的PH為7～8。

進(jìn)一步地，為了保證酶的活性和水解速度，上述步驟(2)和(3)的反應(yīng)溫度均為35℃～45℃。

進(jìn)一步地，上述步驟(1)～(3)中的堿性酒石酸銅溶液滴定法的滴定過(guò)程中溶液保持沸騰狀態(tài)。沸騰的目的一是加快反應(yīng)速度，二是防止次甲基蘭與滴定過(guò)程中形成的氧化亞銅被氧氣氧化，三是盡可能保證一致的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，增加實(shí)驗(yàn)的平行性。

進(jìn)一步地，上述步驟(4)的光密度測(cè)試環(huán)境為20～35℃的避光處。光密度是指入射光與透射光的對(duì)數(shù)或者說(shuō)是光線透過(guò)率倒數(shù)的對(duì)數(shù)，是檢測(cè)方法里出現(xiàn)的專(zhuān)有名詞。特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。因此，光密度值直接對(duì)應(yīng)于檢測(cè)物濃度，光密度值的準(zhǔn)確與否直接決定了檢測(cè)物的濃度，在室溫下、無(wú)光線干擾的避光處測(cè)量，能夠提高測(cè)量的準(zhǔn)確性。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)的反應(yīng)完全指溶液于223nm波長(zhǎng)處的光密度變化小于0.001/天。當(dāng)光密度變化小于0.001/天時(shí)，可以認(rèn)為光密度值達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，說(shuō)明高碘酸的濃度不再發(fā)生變化，樣品中1,6糖苷鍵已經(jīng)反應(yīng)完全。

進(jìn)一步地，所述步驟(5)的滴定過(guò)程中，采用的指示劑為溴甲酚藍(lán)指示劑。

進(jìn)一步地，所述步驟(5)的反應(yīng)過(guò)程中，溶液的PH值保持為3～5，以避免發(fā)生超氧化，且一定要在低溫、避光處進(jìn)行，以保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

1)本發(fā)明能夠用化學(xué)分析方法鑒別以1,3-、1,6-糖苷鍵鏈結(jié)的β-葡聚糖和以1,3-、1,4-糖苷鍵鏈結(jié)的β-葡聚糖；2)本發(fā)明具有可操作性強(qiáng)、儀器及試劑簡(jiǎn)單，成本低，不需要昂貴的測(cè)試儀器和苛刻的測(cè)試條件，也減少了復(fù)雜的解譜過(guò)程，適用性廣；3)本發(fā)明減少了作為多糖大分子的β-葡聚糖的溶解性小、粘度高等性質(zhì)對(duì)測(cè)試帶來(lái)的誤差，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度高、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小、重現(xiàn)性好。

【具體實(shí)施方式】

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

以下所提供的實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明所涵蓋的范圍，所描述的步驟也不是用以限制其執(zhí)行順序。本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有公知常識(shí)對(duì)本發(fā)明做顯而易見(jiàn)的改進(jìn)，亦落入本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例一

一、本實(shí)施例涉及到的試劑及其配制如下：

①0.1mol/L PH 7～8磷酸緩沖液配制：稱(chēng)取4.644g無(wú)水磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄)和21.945g十二水磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·12H₂O),置于燒杯中,加少量蒸餾水溶解.固體全部溶解后,將溶液轉(zhuǎn)移到1000ml容量瓶中.用蒸餾水潤(rùn)洗溶解用的燒杯三次,潤(rùn)洗后的水也加入到容量瓶中,定容,即得。

②堿性酒石酸銅甲液：稱(chēng)取15g硫酸銅(CuSO₄·5H₂O)及0.05g亞甲基藍(lán)，溶于蒸餾水中并稀釋到1000ml。

③堿性酒石酸銅乙液：稱(chēng)取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉(NaOH)，溶于蒸餾水中，再加入4g亞鐵氰化鉀[K₄Fe(CN)₆]，完全溶解后，用蒸餾水稀釋到1000ml，貯存于具橡皮塞玻璃瓶中。

④0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g經(jīng)98～100℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖，加蒸餾水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml濃HCl(防止微生物生長(zhǎng))，用蒸餾水稀釋到1000ml。

⑤溴甲酚藍(lán)指示劑：將0.12g溴甲酚藍(lán)用250ml含有1.43毫升0.1mol/L氫氧化鈉的蒸餾水溶解并定容至250ml；

⑥30mmol/L高碘酸鈉溶液：稱(chēng)取6.838g高碘酸鈉溶于蒸餾水中，定容至1000ml。

⑦0.01mol/L氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取0.4g氫氧化鈉溶解于蒸餾水中，定容至1000ml。

二、在進(jìn)行測(cè)試前，需要標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液、繪制高碘酸濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體過(guò)程如下：

標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液：

吸取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5.00ml，置于250ml錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3-5粒。從滴定管滴加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加熱使其在2-3min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值，按下式計(jì)算：

F＝C×V，

式中：F——10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的量，單位為mg；

C──葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/ml；

V──標(biāo)定時(shí)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，ml。

繪制高碘酸濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線：

取6只支干燥試管，按下表操作。

光密度是指入射光與透射光的對(duì)數(shù)或者說(shuō)是光線透過(guò)率倒數(shù)的對(duì)數(shù)，是檢測(cè)方法里出現(xiàn)的專(zhuān)有名詞。特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。以計(jì)算后得到的高碘酸鈉毫摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)試得到的光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、本實(shí)施例為一種β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)分析方法，包括以下步驟：

(1)取m₀重量份的待測(cè)樣品溶于水形成V_m ml溶液，2mg≤m₀≤10mg；吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積V₀；平行操作3次，取其平均值，得出未處理樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

$x_0=\frac{F\×V_m}{m_0\×V_0\×1000}\×100,$

其中：F──10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的量，mg；V₀──測(cè)定時(shí)平均消耗還原糖或總糖樣品溶液的總體積，ml；V_m─還原糖或總糖樣品溶液的總體積，ml；1000──mg換算成g的系數(shù)；

(2)取100-300u/mg活性單位淀粉酶溶于水，加入m₁重量份的待測(cè)樣品，30mg≤m₁≤50mg，形成V_aml溶液，反應(yīng)溫度為35℃～45℃，反應(yīng)時(shí)間為3天；然后吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積V₁；平行操作3次，取其平均值，得出淀粉酶處理后樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

(3)取200-300u/mg活性單位蝸牛酶溶于PH7～8磷酸緩沖液形成溶液，加入m₂重量份的待測(cè)樣品，25mg≤m₁≤40mg，形成V_bml溶液，反應(yīng)溫度為35℃～45℃，反應(yīng)時(shí)間為3天；然后吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積v₂；平行操作3次，取其平均值，得出蝸牛酶處理后樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

(4)取1～5摩爾的待測(cè)樣品溶于水，加入足量的30mmol/L高碘酸鈉溶液，定容至25ml，置于暗處，室溫下進(jìn)行反應(yīng)，于0,24,36,48,54...小時(shí)間隔取樣0.1ml，用蒸餾水稀釋250倍后，于223nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。當(dāng)光密度變化小于0.001/天時(shí)，可以認(rèn)為光密度值達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，說(shuō)明高碘酸的濃度不再發(fā)生變化，樣品中1,6糖苷鍵已經(jīng)反應(yīng)完全。當(dāng)光密度值達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值時(shí)，加入乙二醇破壞過(guò)量的高碘酸以終止反應(yīng)。測(cè)試此時(shí)溶液于223nm波長(zhǎng)處的光密度，由此光密度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出高碘酸的消耗量n₁(mmol)＝(反應(yīng)前高碘酸濃度-反應(yīng)后高碘酸濃度)*反應(yīng)體積；

(5)取2ml上述步驟(4)得到的溶液，加入一滴溴甲酚藍(lán)做指示劑，用0.01mol/L氫氧化鈉溶液滴定甲酸釋放量n₂(mmol)＝(NaOH的準(zhǔn)確濃度*滴定用的體積/2ml)*反應(yīng)體積。溶液的PH值保持為3～5，以避免發(fā)生超氧化，且一定要在低溫、避光處進(jìn)行，以保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。

淀粉酶是專(zhuān)一性水解α-1,4-糖苷鍵的酶；蝸牛酶是專(zhuān)一性水解β-1,3糖苷鍵的酶。x₀是未做處理的樣品中的還原糖量，x₁是通過(guò)淀粉酶水解后的樣品中的還原糖量，x₂是蝸牛酶水解后的樣品中的還原糖量。高碘酸可選擇性斷裂糖分子中的鄰二羥基或鄰三羥基處,生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。反應(yīng)定量進(jìn)行,每開(kāi)裂1個(gè)C—C鍵消耗1分子高碘酸。通過(guò)測(cè)定高碘酸的消耗量及甲酸的釋放量,可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度、分支多糖的分支數(shù)等。將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后酸水解，再鑒定水解產(chǎn)物，從而推斷糖苷鍵的位置與分支點(diǎn)等。以葡萄糖為例，以1-2或1-4位鍵合的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個(gè)糖基消耗1分子高碘酸，且無(wú)甲酸釋放；1-3位鍵合的糖基不被高碘酸氧化；1-6位鍵合的糖基或非還原末端糖基經(jīng)高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同時(shí)釋放1分子甲酸。

在本實(shí)施例中，x₁-x₀＝0時(shí)，說(shuō)明樣品中不存在α-1,4-糖苷鍵；當(dāng)x₂-x₀≠0時(shí)，說(shuō)明樣品中存在β-1,3糖苷鍵；當(dāng)n₁＝0.58mol，n₂＝0.28mol，說(shuō)明高碘酸的消耗約為甲酸生成的2倍，由此可以推測(cè)，樣品中含有β-1,6糖苷鍵。結(jié)合上述兩個(gè)結(jié)論，可以確定被測(cè)β-葡聚糖樣品是以1-3、1-6糖苷鍵鏈結(jié)的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例二

本實(shí)施例的試劑配制和前期處理同實(shí)施例一。

本實(shí)施例為一種β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)分析方法，包括以下步驟：

(4)取m₀重量份的待測(cè)樣品溶于水形成V_m ml溶液，2mg≤m₀≤10mg；吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積V₀；平行操作3次，取其平均值，得出未處理樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

$x_0=\frac{F\×V_m}{m_0\×V_0\×1000}\×100,$

其中：F──10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的量，mg；V₀──測(cè)定時(shí)平均消耗還原糖或總糖樣品溶液的總體積，ml；V_m─還原糖或總糖樣品溶液的總體積，ml；1000──mg換算成g的系數(shù)；

(5)取100-300u/mg活性單位淀粉酶溶于水，加入m₁重量份的待測(cè)樣品，30mg≤m₁≤50mg，形成V_a ml溶液，反應(yīng)溫度為35℃～45℃，反應(yīng)時(shí)間為3天；然后吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積V₁；平行操作3次，取其平均值，得出淀粉酶處理后樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

(6)取200-300u/mg活性單位蝸牛酶溶于PH7～8磷酸緩沖液形成溶液，加入m₂重量份的待測(cè)樣品，25mg≤m₁≤40mg，形成V_bml溶液，反應(yīng)溫度為35℃～45℃，反應(yīng)時(shí)間為3天；然后吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣品溶液消耗的體積v₂；平行操作3次，取其平均值，得出蝸牛酶處理后樣品的還原糖量(以葡萄糖計(jì)，％)

(4)取1～5摩爾的待測(cè)樣品溶于水，加入足量的30mmol/L高碘酸鈉溶液，定容至25ml，置于暗處，室溫下進(jìn)行反應(yīng)，于0,24,36,48,54...小時(shí)間隔取樣0.1ml，用蒸餾水稀釋250倍后，于223nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。當(dāng)光密度變化小于0.001/天時(shí)，可以認(rèn)為光密度值達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，說(shuō)明高碘酸的濃度不再發(fā)生變化，樣品中1,6糖苷鍵已經(jīng)反應(yīng)完全。當(dāng)光密度值達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值時(shí)，加入乙二醇破壞過(guò)量的高碘酸以終止反應(yīng)。測(cè)試此時(shí)溶液于223nm波長(zhǎng)處的光密度，由此光密度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出高碘酸的消耗量n₁(mmol)＝(反應(yīng)前高碘酸濃度-反應(yīng)后高碘酸濃度)*反應(yīng)體積；

(5)取2ml上述步驟(4)得到的溶液，加入一滴溴甲酚藍(lán)做指示劑，用0.01mol/L 氫氧化鈉溶液滴定甲酸釋放量n₂(mmol)＝(NaOH的準(zhǔn)確濃度*滴定用的體積/2ml)*反應(yīng)體積。溶液的PH值保持為3～5，以避免發(fā)生超氧化，且一定要在低溫、避光處進(jìn)行，以保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。

淀粉酶是專(zhuān)一性水解1,4-糖苷鍵的酶；蝸牛酶是專(zhuān)一性水解1,3糖苷鍵的酶。x₀是未做處理的樣品中的還原糖量，x₁是通過(guò)淀粉酶水解后的樣品中的還原糖量，x₂是蝸牛酶水解后的樣品中的還原糖量。高碘酸可選擇性斷裂糖分子中的鄰二羥基或鄰三羥基處,生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。反應(yīng)定量進(jìn)行,每開(kāi)裂1個(gè)C—C鍵消耗1分子高碘酸。通過(guò)測(cè)定高碘酸的消耗量及甲酸的釋放量,可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度、分支多糖的分支數(shù)等。將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后酸水解，再鑒定水解產(chǎn)物，從而推斷糖苷鍵的位置與分支點(diǎn)等。以葡萄糖為例，以1-2或1-4位鍵合的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個(gè)糖基消耗1分子高碘酸，且無(wú)甲酸釋放；1-3位鍵合的糖基不被高碘酸氧化；1-6位鍵合的糖基或非還原末端糖基經(jīng)高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同時(shí)釋放1分子甲酸。

在本實(shí)施例中，x₁-x₀≠0時(shí)，說(shuō)明樣品中不存在α-1,4-糖苷鍵；當(dāng)x₂-x₀≠0時(shí)，說(shuō)明樣品中存在β-1,3糖苷鍵；當(dāng)n₁＝0.58mol，n₂＝0mol，無(wú)甲酸生成，由此可以推測(cè)，樣品中含有1,6-糖苷鍵。結(jié)合上述兩個(gè)結(jié)論，可以確定被測(cè)β-葡聚糖樣品是以1,3-、1,4-糖苷鍵鏈結(jié)的結(jié)構(gòu)。