本發(fā)明涉及獸藥檢測的
技術領域：
，特別是涉及一種獸藥中多種抗菌成分(尤其是非法添加的)同時檢測的方法。
背景技術：
：獸藥是用于預防、治療、診斷動物疾病或有目的地調節(jié)動物生理機能的物質(含藥物飼料添加劑)，主要包括血清制品、疫苗、診斷制品、微生態(tài)制品、中藥材、化學藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲劑、消毒劑等。由于市場經(jīng)濟的調節(jié)，市場上獸藥品種較多，雖然國家出臺了《獸藥管理條例》，但很多企業(yè)為了追求利潤，擅自改變獸藥制劑組方、非法添加標準處方外的藥物甚至違禁藥物，這種造假行為極大地擾亂了獸藥市場秩序，也成為農(nóng)業(yè)部近年來重點打擊查處的違法行為之一?；前奉愃幬锖袜Z酮類藥物是獸藥中常用的成分，具有吸收好、抗菌譜廣等優(yōu)點，但部分企業(yè)盲目追求獸藥的療效，不按照批準的處方生產(chǎn)獸藥，而在批準的處方外額外添加其他的藥物，磺胺類藥物和喹諾酮類藥物是經(jīng)常被部分企業(yè)非法添加到多種獸藥制劑中兩類藥物，這樣做很容易造成用藥安全性的不可控，因此這種行為是被禁止的。為了維持獸藥市場的正常秩序，有關部門需要定期/不定期檢查/抽查上市獸藥的實際成分與其批準成分是否一致，是否有非法添加的物質。目前，針對獸藥中是否非法添加上述兩類藥物的檢測手段中，最常用的有普通高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用法。然而普通液相色譜法由于分離效率低、分析時間長等缺點，無法實現(xiàn)高通量、同時檢測多種抗菌藥物的目的。液相色譜-質譜聯(lián)用法雖然可以做到高通量定性鑒別，但是質譜儀造價昂貴，且獸藥制劑中非法抗菌藥物的濃度較高，遠超過質譜檢測器的線性范圍，也限制了該方法的推廣應用。鄭和輝.超高效液相色譜法檢測化妝品中的12種磺胺抗生素[J].分析測試學報，2007,25(2):238-240.和陳靜.超高效液相色譜法同時測定化妝品中的19種喹諾酮類抗生素[J].分析化學，2013,41(6):931-935.兩篇文獻中分別公開了用UPLC-PDA方法測定化妝品中的磺胺類藥物或喹諾酮類藥物，由于化妝品的劑型與獸藥不同，樣品的前處理方法也不一致，無法用來檢測獸藥中的磺胺類藥物和喹諾酮類藥物。另外，文獻中兩種方法分別對磺胺類藥物或喹諾酮類藥物進行檢測，通常獸藥中這兩類藥物都會添加，用文獻的方法需要進行兩次檢測，檢測效率低。不僅如此，文獻中的兩種方法對磺胺類藥物的檢測種類和數(shù)量都比較少(只能檢測12種)，用于獸藥的檢測時，會造成漏檢、結果不準確等問題，無法用于獸藥中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的檢測。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的技術缺陷，提供一種能夠同時分離、并測定獸藥中多種抗菌成分(22種磺胺類藥物和9種喹諾酮類藥物)的方法，包括以下步驟：步驟1)、制備對照儲備液：分別將多種抗菌成分用溶劑A配制成濃度均為1mg/ml的對照儲備液；步驟2)、制備樣品溶液：稱取獸藥樣品，用溶劑A配制成樣品溶液；步驟3)、UPLC-PDA檢測：分別將步驟1)得到的對照儲備液和步驟2)得到的樣品溶液注入超高效液相色譜儀(UPLC)，以PDA為檢測器進行梯度洗脫程序，得到對照圖譜和樣品圖譜(所述圖譜包括色譜圖和光譜圖)；步驟4)、比對圖譜：將步驟3)得到的樣品圖譜與對照圖譜分別進行比對，得出獸藥樣品中添加的抗菌成分的種類和添加量。所述抗菌成分為磺胺類藥物和/或喹諾酮類藥物。所述磺胺類藥物包括磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪鈉、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺異噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。所述喹諾酮類藥物包括馬波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星。所述步驟3)UPLC-PDA檢測的色譜柱選用AgilentZORBAXSB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：1μL。所述步驟3)UPLC-PDA檢測的流動相為：流動相A為0.05％-0.2％(體積百分含量，v/v)甲酸水溶液(pH＝3.35-3.45)，流動相B為乙腈。所述步驟3)UPLC-PDA檢測的梯度洗脫程序分為八個階段：階段①：0-7min,9％-14％流動相B；階段②：7-20min，14％-15.5％流動相B；階段③：20-25min，15.5％-20％流動相B；階段④：25-30min，20％-24％流動相B；階段⑤：30-37min，24％-30％流動相B；階段⑥：37-39min，30％-50％流動相B；階段⑦：39-39.5min，50％-9％流動相B；階段⑧：39.5-42min，9％-9％流動相B。所述步驟4)的比對圖譜具體為：先比對樣品色譜圖與對照色譜圖中是否有保留時間相同的峰；如果沒有，說明樣品中未添加對照圖譜對應的抗菌成分，如果有，再進一步比對該保留時間相同的峰在樣品光譜圖和對照光譜圖中的整體峰型、最大吸收波長是否一致，如果一致，則判斷樣品中含有對照圖譜對應的抗菌成分，得到樣品中添加的抗菌成分的種類，如果不一致，則判斷樣品中不含有對照圖譜對應的抗菌成分；進一步計算樣品色譜圖中該峰的峰面積，得到該抗菌成分的添加量。所述溶劑A為乙腈與0.1％(體積百分含量，v/v)甲酸水溶液的混合液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的體積比為(40:60)-(70:30)。所述步驟2)制備樣品溶液具體為：稱取獸藥樣品，加入溶劑A，搖勻，超聲3分鐘以上，室溫下0.22μm濾膜過濾，即得。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用UPLC法(超高效液相色譜法)聯(lián)合PDA法(Photo-DiodeArray，即光電二極管陣列檢測器)建立了一種能夠同時分離、并測定獸藥中22種磺胺類藥物和9種喹諾酮類藥物的檢測方法，主要對該方法中的流動相和梯度洗脫程序的參數(shù)(包括樣品制備方法、色譜柱和檢測器)進行了篩選和優(yōu)化。本發(fā)明方法采用UPLC將獸藥中的抗菌成分分離，進而對它們進行分別的鑒別測定。本發(fā)明方法既可以定性，也可以定量測定，通過與對照色譜圖中的保留時間和光譜圖中峰型的比較，可對其中的抗菌成分進行定性檢測，在此基礎上，通過外標法計算峰面積，對抗菌成分進行定量檢測。本發(fā)明采用PDA檢測器，利用全波段光譜圖、純度角和保留時間三項指標對色譜峰進行定性，解決了UV檢測器僅依靠保留時間這一項指標，容易產(chǎn)生定性不準確的問題。同時，31種抗菌成分的最大吸收波長差異較大，采用PDA檢測器也保證了各色譜峰均能得到最大吸光度值，提高了該檢測方法的靈敏度。本發(fā)明提出的檢測方法操作簡便、快速、準確，適用范圍寬、設備造價低廉、同時檢出的目標化合物多，可以作為獸藥制劑中非法添加物的檢測方法，為規(guī)范獸藥市場提供了技術保障，為獸藥市場的監(jiān)管提供了技術支持。此外，本發(fā)明方法還適用于水、土壤等對象中磺胺類化合物和喹諾酮類化合物的檢測。附圖說明圖1所示為在280nm下按實施例4的色譜條件檢測步驟3)的31種對照儲備稀釋液得到的色譜圖；其中：1、磺胺脒，2、磺胺，3、苯磺酰胺，4、磺胺醋酰，5、磺胺嘧啶，6、甲氧芐啶，7、磺胺吡啶，8、馬波沙星，9、磺胺甲基嘧啶，10、氧氟沙星，11、培氟沙星，12、環(huán)丙沙星，13、磺胺二甲嘧啶，14、洛美沙星，15、磺胺對甲氧嘧啶，16、磺胺甲氧噠嗪，17、達氟沙星，18、恩諾沙星，19、磺胺間甲氧嘧啶，20、磺胺氯噠嗪鈉，21、沙拉沙星，22、磺胺多辛，23、二氟沙星，24、磺胺甲噁唑，25、磺胺異噁唑，26、磺胺苯甲酰，27、磺胺氯吡嗪鈉，28、磺胺地索辛，29、磺胺喹噁啉，30、磺胺苯吡唑，31、磺胺硝苯；圖2-圖7分別為圖1中31種抗菌成分1-31對應的PDA光譜圖；圖8所示為比較例1的結果圖；圖9所示為比較例2的結果圖；圖10所示為比較例3當pH為3.6時的結果圖；圖11所示為比較例3當pH為3.2時的結果圖；圖12所示為比較例6當色譜柱為HypersilGoldC18時的結果圖；圖13所示為比較例6當色譜柱為WatersHssT3時的結果圖；圖14所示為在280nm下按實施例4的色譜條件檢測金芩芍注射液得到的色譜圖；圖15-圖17分別為圖14中峰#Ⅰ-峰#Ⅲ對應的PDA光譜圖；圖18所示為在280nm下按實施例4的色譜條件檢測氟苯尼考粉得到的色譜圖；圖19-圖22分別為比較例7-10的結果圖。具體實施方式本發(fā)明提出的能夠同時檢測獸藥中多種磺胺類藥物和喹諾酮類藥物(以下可簡稱抗菌成分)的方法，包括以下步驟：步驟1)、分別精密稱取22種磺胺類藥物：磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪鈉、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺異噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑和磺胺硝苯；和9種喹諾酮類藥物：馬波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星，各50mg作為對照品，分別置于31個50ml容量瓶中，用溶劑A溶解并稀釋至刻度，制成濃度均為1mg/ml的對照儲備液；溶劑A為乙腈-0.1％(體積百分含量，v/v)甲酸水溶液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的體積比為(40:60)-(70:30)，0.1％甲酸水溶液是由1mL的甲酸置于1000mL的容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度制得。步驟2)、稱取獸藥樣品1.0g，加入20mL溶劑A，搖勻，超聲3分鐘以上，室溫下0.22μm濾膜過濾，制得樣品溶液；溶劑A與步驟1)的溶劑A相同。步驟3)、將步驟1)得到的對照儲備液分別用溶劑A稀釋100倍，得到濃度為0.01mg/ml的對照儲備稀釋液；分別精密吸取對照儲備稀釋液和樣品溶液1μL注入超高效液相色譜儀(UPLC)，按照如下的色譜條件進行測定。色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：1μL；流動相：A為0.05％-0.2％(體積百分含量，v/v)甲酸水溶液(三乙胺調節(jié)pH值至3.35-3.45)，B為乙腈；梯度洗脫程序：階段①：0-7min,9％-14％B(0-7分鐘內(nèi)流動相B的體積百分含量在9％-14％之間線性緩慢增加，對應的，在這段時間內(nèi)流動相A的體積百分含量在91％-86％之間線性緩慢降低，以下同理)；階段②：7-20min，14％-15.5％B；階段③：20-25min，15.5％-20％B；階段④：25-30min，20％-24％B；階段⑤：30-37min，24％-30％B；階段⑥：37-39min，30％-50％B；階段⑦：39-39.5min，50％-9％B；階段⑧：39.5-42min，9％-9％B(即維持流動相B的體積百分含量為9％，流動相A的體積百分含量為91％不變)；得到對照圖譜和樣品圖譜(包括對照色譜圖、對照光譜圖和樣品色譜圖、樣品光譜圖)。步驟4)、將步驟3)得到的樣品圖譜與對照圖譜進行比對，即可以判斷出獸藥樣品中是否添加了磺胺類藥物和/或喹諾酮類藥物，添加了哪些種類的抗菌成分，以及每種抗菌成分的添加量。步驟4)的比對過程具體為：先比對色譜圖：樣品色譜圖與對照色譜圖中是否有保留時間相同的峰；如果沒有，說明樣品中沒有對照色譜圖中的抗菌成分，如果有，再比對光譜圖：進一步比較該保留時間相同的峰在樣品光譜圖和對照光譜圖中的整體峰型、最大吸收波長是否一致，如果一致，則判斷樣品中含有對照圖譜對應的物質，如果不一致，則判斷樣品中不含有對照圖譜對應的抗菌成分；還可以根據(jù)UPLC不同保留時間下的峰面積直接計算出對應峰的含量，得到含有的抗菌成分的添加量。超高效液相色譜儀購自Waters公司的ACQUITYUPLC?；前奉愃幬镔徸缘聡鳧r.Ehrenstorfer公司；喹諾酮類藥物購自中國食品藥品檢定研究院和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，均可商購得到。以下結合具體實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明進行限制。實施例1、標準樣品的制備：按上述步驟1)得到22種磺胺類藥物、9種喹諾酮類藥物濃度均為1mg/ml的共31個對照儲備液，量取31種對照儲備液各0.1ml，置于同一10ml容量瓶中，用溶劑A稀釋至刻度，即得標準樣品。2、檢測樣品的制備：按上述步驟2)制得樣品溶液，檢測樣品包括市場上售賣的氟苯尼考粉、阿莫西林可溶性粉、鹽酸林可霉素注射液、伊維菌素注射液、恩諾沙星注射液、鹽酸環(huán)丙沙星可溶性粉、煙酸諾氟沙星注射液、氧氟沙星注射液、金芩芍注射液、止痢散、黃芪多糖注射液、健胃散共12種30批不同類型的獸藥制劑。3、檢測：按上述步驟3)對標準樣品和樣品溶液進行檢測，檢測參數(shù)見表1。表1本發(fā)明檢測方法的參數(shù)4、比對：將檢測樣品中的檢出峰與標準樣品色譜圖中各種抗菌成分的保留時間及PDA光譜圖進行比對，得到上述獸藥制劑中是否含有31種抗菌成分以及含有哪些抗菌成分的定性檢測結果；用UPLC計算檢出峰的峰面積，得到含有的抗菌成分的添加量。以金芩芍注射液和氟苯尼考粉為例，以實施例4為例，標準樣品的檢測結果見圖1，檢測樣品的結果見圖14和圖18。通過比較圖14和圖18中色譜峰的保留時間與對照圖譜中的保留時間是否一致，同時比較保留時間一致的相應峰的光譜圖(圖15-圖17)，看二者之間的峰型和最大吸收波長是否相同，定性得出這兩種獸藥制劑中是否含有31種抗菌成分，以及含有哪些種抗菌成分的結論。圖1的結果顯示：31種化合物之間的分離度良好，圖2-7的PDA光譜圖特征明顯；根據(jù)圖1中的保留時間，結合圖2-7中的光譜圖特征，可以實現(xiàn)對添加物定性檢測的目的；在此基礎上，還可以利用外標法對檢測出來的添加物進行定量測定。當甲酸濃度在0.05％-0.2％之間(如實施例1-6)，只能使部分色譜峰的位置改變(如，當以0.05％甲酸水溶液為流動相A時，只能使沙星類的色譜峰的出峰時間整體推遲)，但不會改變同類化合物峰之間的分離度。由圖14和圖18的結果表明，金芩芍注射液中非法添加了甲氧芐啶、氧氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶，其中甲氧芐啶的含量為0.037mg/ml，氧氟沙星的含量為0.031mg/ml，磺胺間甲氧嘧啶的含量為0.074mg/ml；氟苯尼考粉中未發(fā)現(xiàn)添加物。比較例1：以實施例4為例，將步驟3)流動相B中的乙腈替換成甲醇，其它步驟和參數(shù)不變，結果見圖8。結果顯示：用甲醇做流動相B時，部分色譜峰重疊，完全分不開，尤其是保留時間在8-14min期間的峰發(fā)生大量地重疊，說明針對磺胺類藥物和喹諾酮類藥物甲醇的洗脫力弱于乙腈，所有色譜峰之間的分離度均遠小于乙腈，甲醇不適用于分離磺胺類藥物和喹諾酮類藥物。比較例2：以實施例4為例，僅調整步驟3)流動相A甲酸水溶液中甲酸的濃度至0.5％、0.01％，其它步驟和參數(shù)不變，結果見圖9。結果顯示：用流動相A中甲酸的濃度過高或過低，都會發(fā)生部分色譜峰重疊，完全分不開的情況，尤其是保留時間在7-13min期間的峰發(fā)生大量地重疊，分離度變差，甲酸的濃度過高或過低均不適用于分離磺胺類藥物和喹諾酮類藥物。比較例3：以實施例4為例，僅調整步驟3)流動相A甲酸水溶液的pH值為3.6、3.2，其它步驟和參數(shù)不變，結果見圖10和圖11。結果顯示：當流動相A的pH值≧3.5時(如3.6)，沙拉沙星和磺胺多辛之間的分離度降低(見圖10中保留時間為23min附近兩個重疊峰)；當流動相A的pH值≦3.3時(如3.2)，磺胺甲氧噠嗪和達氟沙星之間的分離度降低(見圖11中保留時間為14min附近的兩個重疊峰)。比較例4：以實施例4為例，僅調整步驟2)溶劑中乙腈和0.1％甲酸水溶液之間的配比，其它步驟和參數(shù)不變。發(fā)現(xiàn)：當乙腈：0.1％甲酸水溶液的體積比＞70：30時(如80:20)，二氟沙星、洛美沙星等化合物不能完全溶解，試管底部有肉眼可見的未溶解固體；當乙腈：0.1％甲酸水溶液的體積比＜40：60(如20:80)時，磺胺硝苯、磺胺喹噁啉等化合物不能完全溶解，試管底部有肉眼可見的未溶解固體。比較例5：以實施例4為例，僅調整步驟2)超聲時間，其它步驟和參數(shù)不變?？疾旎厥章蕘肀容^超聲時間對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)：當超聲時間大于3分鐘時，上述31種藥物的回收率均大于95％。當超聲時間小于3min，即2分鐘時，磺胺喹噁啉、磺胺地索辛、磺胺苯吡唑的回收率低于40％，這是由于這些化合物未能完全溶解造成的。比較例6：以實施例4為例，僅調整步驟3)中所用的色譜柱，用HypersilGoldC18(2.1mm×100mm，1.9μm)和WatersHssT3(2.1mm×100mm，1.8μm)替換本發(fā)明的AgilentZORBAXSB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)，其它步驟和參數(shù)不變，結果見圖12和圖13。結果顯示：使用HypersilGoldC18(2.1mm×100mm，1.9μm)或WatersHssT3(2.1mm×100mm，1.8μm)都會發(fā)生部分色譜峰重疊，完全分不開的情況，對HypersilGoldC18(2.1mm×100mm，1.9μm)來說，在保留時間為13-15min和16-19min期間的峰發(fā)生大量地重疊，分離度變差；對WatersHssT3(2.1mm×100mm，1.8μm)來說，在保留時間為11-14min期間的峰發(fā)生大量地重疊，分離度變差，這兩種常用的色譜柱分離效果較差，無法將31種藥物全部分開，均不適用于分離磺胺類藥物和喹諾酮類藥物。比較例7：以實施例4為例，合并步驟3)中度洗脫程序的原階段③和原階段④，將步驟3)中梯度洗脫程序改為：階段①：0-7min,9％-14％B；階段②：7-20min，14％-15.5％B；階段③：20-30min，15.5％-24％B；階段④：30-37min，24％-30％B；階段⑤：37-39min，30％-50％B；階段⑥：39-39.5min，50％-9％B；階段⑦：39.5-42min，9％-9％B，按照該程序進行梯度洗脫，其他步驟和參數(shù)不變，得到圖19。從圖19中得知，按照上述程序進行梯度洗脫后，磺胺多辛和沙拉沙星之間的分離度降低(見圖19中保留時間為23min附近的兩個重疊峰)。比較例8：以實施例4為例，調整步驟3)中梯度洗脫程序各階段的保留時間和流動相配比，將步驟3)中梯度洗脫程序改為：階段①：0-7min,9％-12.5％B；階段②：7-14min，12.5％-15％B；階段③：14-18min，15％-18％B；階段④：18-25min，18％-20％B；階段⑤：25-30min，20％-24％B；階段⑥：30-37min，24％-30％B；階段⑦：37-39min，30％-50％B；階段⑧：39-39.5min，50％-9％B；階段⑨：39.5-42min，9％-9％B，按照該程序進行梯度洗脫，其他步驟和參數(shù)不變，得到圖20。從圖20中得知，按照上述程序進行梯度洗脫后，環(huán)丙沙星和磺胺二甲嘧啶之間的分離度降低(見圖20中保留時間為13min附近的兩個重疊峰)；二氟沙星和磺胺多辛之間的分離度降低(見圖20中保留時間為22min附近的兩個重疊峰)，不適用于這幾種物質的檢測。比較例9：以實施例4為例，縮短步驟3)中梯度洗脫程序的運行時間，將步驟3)的梯度洗脫程序改為：階段①：0-7min,9％-13％B；階段②：7-13min，13％-20％B；階段③：13-18min，20％-24％B；階段④：18-25min，24％-30％B；階段⑤：25-27min，30％-50％B；階段⑥：27-27.5min，50％-9％B；階段⑦：27.5-30min，9％-9％B，按照該程序進行梯度洗脫，其他步驟和參數(shù)不變，得到圖21。從圖21中得知，按照上述程序進行梯度洗脫后，磺胺二甲嘧啶和洛美沙星之間的分離度降低(見圖21中保留時間為12min附近的兩個重疊峰)；達氟沙星、磺胺甲二唑、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪之間的分離度降低(見圖21中保留時間為12.5-14min附近的重疊峰)；二氟沙星和磺胺多辛之間的分離度降低(見圖21中保留時間為16min附近的兩個重疊峰)，不適用于這幾種物質的檢測。比較例10：以實施例4為例，縮短步驟3)中梯度洗脫程序的運行時間，將步驟3)的梯度洗脫程序改為：階段①：0-18min,10％-24％B；階段②：18-30min，24％-35％B；階段③：30-30.5min，35％-10％B；階段④：30.5-33min，10％-10％B，按照該程序進行梯度洗脫，其他步驟和參數(shù)不變，得到圖22。從圖22中得知，按照上述程序進行梯度洗脫后，磺胺甲二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和恩諾沙星之間的分離度降低(見圖22中保留時間為11-12min附近的重疊峰)；二氟沙星和磺胺氯噠嗪鈉之間的分離度降低(見圖22中保留時間為15min附近的兩個重疊峰)，不適用于這幾種物質的檢測。實驗一：精密度按照實施例1-6的色譜條件，在同一天、由同一實驗員用同一臺UPLC對濃度為0.01mg/mL的同一對照品溶液連續(xù)進樣5次進行測定，計算保留時間和峰面積的RSD，即得到日內(nèi)精密度結果；分別在兩天、由兩名實驗員用兩臺UPLC對濃度為0.01mg/mL的同一對照品溶液連續(xù)進樣5次進行測定，計算保留時間和峰面積的RSD，即得到日間精密度結果。以實施例4為例，具體結果見表2，表2中所列保留時間為5次測定的平均值；由于在對色譜峰定性鑒別時，只需要利用峰的保留時間，所以表中結果中只列出了保留時間，而無峰面積結果。表231種化合物精密度考察結果表2顯示，保留時間的日內(nèi)精密度均不大于0.5％，峰面積的日內(nèi)精密度均小于0.5％。保留時間和峰面積的日間精密度均小于1.0％。在獸藥檢測領域，通常要求檢測方法的日內(nèi)精密度的RSD≤2％，日間精密度的RSD≤4％(《中國獸藥典》二〇一五年版一部)。該結果表明本發(fā)明檢測方法的精密度良好，可以用來檢測獸藥中的磺胺類藥物和喹諾酮類藥物。實驗二：線性關系和檢出限精密量取31種對照品儲備液適量，用溶劑A(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝60:40)稀釋，制得濃度分別為0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的對照品溶液。按照實施例1-6的色譜條件，進樣測定，以信噪比＝3時的濃度作為檢出限，記錄色譜圖，以濃度x(mg/mL)對峰面積y作圖，并進行統(tǒng)計學處理，得到31種抗菌成分的回歸方程，并計算得到相關系數(shù)R2，以實施例4的色譜條件為例，具體結果見表3。表331種抗菌成分的對照品溶液的線性關系和檢出限峰編號R2檢出限(μg/L)峰編號R2檢出限(μg/L)10.999613.8171.000019.721.000010.6180.999923.531.000014.8190.999645.540.999612.6200.999861.950.999717.7210.999868.560.999778.8221.000057.070.999923.4230.999768.580.999930.6241.000050.590.999919.5251.000040.5100.999925.7260.999940.7111.000021.1271.000041.7121.000017.4280.99988.1131.000029.3290.999635.7140.999923.9301.000052.5150.999830.7310.99959.6160.999934.4表3的結果顯示當樣品中抗菌成分的濃度在0.005mg/mL-1mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好，可見，本發(fā)明方法用于檢測31種抗菌成分時，其線性關系范圍大，對0.005mg/mL-1mg/mL的濃度范圍的樣品均能準確測定，表明本發(fā)明方法的適用性廣。本發(fā)明檢測方法的檢出限最低能夠不到10μg/L，最高不超過80μg/L，而本發(fā)明方法的線性關系的濃度范圍為5000-106μg/L，遠超過檢出限；該檢出限也遠低于抗菌成分的起效濃度1250μg/L(此數(shù)值為31種抗菌成分中最低的起效濃度，出自《獸藥使用指南化學藥品卷》)，說明本發(fā)明方法能夠滿足獸藥制劑中抗菌成分檢測的要求。實驗三：回收率向不含抗菌成分的獸藥制劑中添加兩種不同濃度水平的以上31種抗菌成分，添加量見表4，按照實施例1-6的色譜條件平行測定5次，計算平均回收率，以實施例4的色譜條件為例，具體結果見表4。表431種抗菌成分的回收率考察結果獸藥檢測領域用回收率來評價檢測結果與真實值的接近程度，通常規(guī)定：在μg/L的數(shù)量級濃度下，其回收率應在75％-120％之間(出自《中國獸藥典》二〇一五年版一部)。表4的結果顯示在添加量較少的情況下(μg/L的數(shù)量級)，31種抗菌成分的平均回收率為87.7％-114.7％；在添加量較大的情況下，31種抗菌成分的平均回收率為92.9％-105.1％，滿足獸藥檢測中對回收率的要求，適合用于獸藥中31種抗菌成分的檢測。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的內(nèi)容。當前第1頁1 2 3