本發(fā)明涉及免疫測(cè)定法，具體是一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及使用方法。

背景技術(shù)：

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在歐美國家較為常見，是男性最常見的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的第二位。我國是傳統(tǒng)的前列腺癌發(fā)病率較低的國家，但是近年來隨著人民生活水平的提高，環(huán)境的改變，以及疾病篩查普及率的提高，我國的前列腺癌發(fā)病率正在逐年上升。前列腺癌已成為威脅我國男性健康的一種重要疾病，正在受到越來越多的關(guān)注和重視。

前列腺癌最重要的治療方式之一就是去勢(shì)療法，包括藥物抗雄激素治療以及手術(shù)去勢(shì)治療，以阻止雄激素結(jié)合到雄激素受體上的方式來抑制腫瘤的生長。在前列腺癌早期，去勢(shì)治療有較好的效果，但是經(jīng)過一段時(shí)間的治療之后，前列腺癌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆缘模瑢?duì)去勢(shì)治療不再敏感，病情再度惡化，即去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）階段。去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，也沒有較好的治療方法，是前列腺癌基礎(chǔ)與臨床領(lǐng)域的難題。

目前對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌的診斷并沒有很好的方法，主要是依靠監(jiān)測(cè)前列腺特異性抗原和睪酮的變化，以及根據(jù)臨床表現(xiàn)來綜合判斷，缺乏較好的特異性，不能準(zhǔn)確地判斷出去勢(shì)抵抗性前列腺癌。及早地發(fā)現(xiàn)去勢(shì)抵抗性前列腺癌，對(duì)后期治療策略的制定和對(duì)前列腺癌更加深入地從分子水平認(rèn)識(shí)，有著非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的產(chǎn)品或方法特異性差、準(zhǔn)確性不高的問題，所提出的一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及使用方法。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括FGγ抗體，以及雙抗體夾心ELISA法所需的檢測(cè)試劑。

一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括包被FGγ抗體的ELISA 酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液、生物素標(biāo)記的FGγ抗體、親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、洗滌液、底物溶液、反應(yīng)終止液、覆膜中的一種或幾種。

檢測(cè)樣本為前列腺癌患者的血清。

一種上述用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

Ⅰ.采集前列腺癌患者全血樣品，離心取上清；

Ⅱ.分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，混勻；酶標(biāo)板加覆膜，孵育；

Ⅲ.棄去孔內(nèi)液體，甩干；每孔加入生物素標(biāo)記的FGγ抗體，酶標(biāo)板加覆膜，溫育；

Ⅳ.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板，再甩干；

Ⅴ.每孔加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，酶標(biāo)板加覆膜，溫育；

Ⅵ. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板，再甩干；

Ⅶ.每孔加入底物溶液，酶標(biāo)板加覆膜，避光孵育；

Ⅷ.每孔加入反應(yīng)終止液；

Ⅸ. 450nm波長下測(cè)量各孔的OD值；

Ⅹ.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值計(jì)算血清樣本FGγ的檢測(cè)值，并判斷其與判定閾值的大小關(guān)系。

所述步驟Ⅰ中全血樣品于室溫放置0~4小時(shí)或0~8℃過夜后于500~1500×g離心10~30分鐘。

所述步驟Ⅳ中洗滌酶標(biāo)板1~5次，每次浸泡1-2分鐘；步驟Ⅵ中洗滌酶標(biāo)板3~7次，每次浸泡1-2分鐘。

所述步驟Ⅳ中洗滌酶標(biāo)板3次，每次浸泡1.5分鐘；步驟Ⅵ中洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡1.5分鐘。

所述判定閾值為19748.73mg/ml~ 24137.33mg/ml。

所述判定閾值為21943.03mg/ml。

本發(fā)明獲得了以下有益效果。

本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的產(chǎn)品或方法特異性差、準(zhǔn)確性不高的問題。本發(fā)明試劑盒根據(jù)血清中FGγ的含量來診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)單快速、合理可行，可提高去勢(shì)抵抗性前列腺癌的診斷效率，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明非去勢(shì)抵抗性前列腺癌和去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者血清中FGγ檢測(cè)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明以血清FGγ水平來診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ROC曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括FGγ抗體，以及雙抗體夾心ELISA法所需的檢測(cè)試劑。

一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括包被FGγ抗體的ELISA 酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液、生物素標(biāo)記的FGγ抗體、親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、洗滌液、底物溶液、反應(yīng)終止液、覆膜中的一種或幾種。

檢測(cè)樣本為前列腺癌患者的血清。

一種上述用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

Ⅰ.采集前列腺癌患者血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

包被FGγ抗體的ELISA 酶標(biāo)板：包被抗體的濃度為1～100μg/ml，優(yōu)選10μg/ml。

標(biāo)準(zhǔn)品：FGγ 1000ng，配制成以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0ng/mL。

標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液：100ml PBS，加入BSA 2g，至終濃度2%

生物素標(biāo)記的FGγ抗體：0～100μg/ml，優(yōu)選10μg/ml。

親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶：0.0001～0.0005 mg/ml

洗滌液: 0.05%Tween-20 0.5ml加入PBS緩沖液1000ml中。

底物溶液：TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。

反應(yīng)終止液：2M H₂SO₄。

Ⅱ.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。

Ⅲ. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素標(biāo)記的FGγ抗體 100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)。

Ⅳ. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

Ⅴ. 每孔加親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶100μL，加上覆膜， 37℃溫育 30 分鐘。

Ⅵ. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟Ⅳ。

Ⅶ. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。

Ⅷ. 每孔加反應(yīng)終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

Ⅸ. 立即用酶標(biāo)儀（SPECTRA max plus384）在 450nm 波長測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。

Ⅹ. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值代入方程算出血清樣本FGγ的檢測(cè)值，并判斷其與判定閾值的大小關(guān)系。

若FGγ檢測(cè)值大于等于判定閾值時(shí)，則判斷患者已進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，若FGγ檢測(cè)值小于判定閾值則判斷患者未進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。以血清中FGγ檢測(cè)值為19748.73mg/ml~ 24137.33mg/ml、優(yōu)選21943.03mg/ml為判定閾值。

實(shí)施例1

本實(shí)施例以FGγ檢測(cè)值21943.03mg/ml為判斷閾值，若FGγ檢測(cè)值大于等于21943.03mg/ml時(shí)，則判斷患者已進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，若FGγ檢測(cè)值小于21943.03mg/ml則判斷患者未進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。在本實(shí)施例的86例樣本中，使用本發(fā)明試劑盒診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌的敏感性為69%，特異性為86.4%。

本實(shí)施例的血清樣本的檢查值繪制在圖1中，兩組比較P<0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2為FGγ作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌診斷的ROC曲線，橫坐標(biāo)為1-特異度，縱坐標(biāo)為靈敏度，AUC=0.808，其中ROC表示曲線下面積。從圖中可以看出，靈敏度達(dá)到69%，特異度達(dá)到86.4%。

可見，采用本發(fā)明檢測(cè)前列腺癌患者血清中FGγ的含量，可快速準(zhǔn)確地診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。