本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)磷含量的試劑盒及測(cè)定磷含量的方法。
背景技術(shù)：
乳及乳制品中磷含量的測(cè)定主要依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.22-2010《嬰幼兒食品和乳品中磷的測(cè)定》，其原理為：試樣經(jīng)酸氧化，使磷在硝酸溶液中與釩鉬酸銨生成黃色絡(luò)合物。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)440nm處測(cè)定吸光度，其顏色的深淺與磷的含量成正比。
然而，目前測(cè)定磷含量的方法仍有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于檢測(cè)磷含量的試劑盒及測(cè)定磷含量的方法，由此，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)磷含量的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒包括：指示劑，所述指示劑為0.2體積％的對(duì)硝基酚溶液；顯色劑，所述顯色劑包括鉬酸銨、偏釩酸銨、硝酸及水；以及調(diào)解液，所述調(diào)解液包括0.2mol/L硝酸溶液、6mol/L第一氫氧化鈉溶液以及0.1mol/L第二氫氧化鈉溶液。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述用于檢測(cè)磷含量的試劑盒還可以具有下列附加技術(shù)特征：
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒進(jìn)一步包括：磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液；以及多孔板。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，基于20mL所述顯色劑，所述顯色劑包括0.5g鉬酸銨、0.025g偏釩酸銨、5mL硝酸以及15mL蒸餾水。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
需要說明的是，對(duì)于顯色劑的提供形式不作嚴(yán)格限定，既可以將每種成分以獨(dú)立的包裝提供，需要使用時(shí)按照上述配比配置得到，也可以以混合液的形式提供，無需自行配置，直接使用即可。
還需要說明的是，調(diào)解液中各種溶液是分別以獨(dú)立包裝的形式提供的。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多孔板包括6孔板、24孔板或96孔板。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)磷含量的試劑盒能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)GB5413.22-2010測(cè)定磷含量時(shí)，由于利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，導(dǎo)致每批只能檢測(cè)少量樣品，無法完成樣品的批量處理，效率低。此外，反應(yīng)體系的體積較大，所需試劑量較多，造成浪費(fèi)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒包括多孔板，進(jìn)而能夠批量處理樣品，節(jié)省時(shí)間和成本，提高效率。
發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同體積的反應(yīng)體系，各反應(yīng)物之間的相互作用并不完全相同，進(jìn)而，并不能直接保持國(guó)標(biāo)方法中各試劑濃度，僅將體積等比例縮小后直接用于本申請(qǐng)，否則將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到試劑的濃度及比例關(guān)系，從而使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。
需要說明的是，本發(fā)明對(duì)磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的提供形式不作嚴(yán)格限定，既可以提供多個(gè)不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直接將其應(yīng)用于檢測(cè)，以繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體地，不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別以獨(dú)立包裝形式提供。還可以僅提供一個(gè)高濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后根據(jù)使用者的需要對(duì)其進(jìn)行稀釋，以便于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述用于檢測(cè)磷含量的試劑盒進(jìn)一步包括：高氯酸和硝酸。高氯酸和硝酸用于將樣品進(jìn)行消解。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種利用前面所描述的試劑盒測(cè)定磷含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理，并將所得到的消解產(chǎn)物冷卻，得到預(yù)測(cè)液；將所述預(yù)測(cè)液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，向所述容量瓶中加入所述指示劑，用所述第一氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)至溶液為黃色，再用所述硝酸溶液調(diào)節(jié)至溶液為無色，最后用所述第二氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液為微黃色，并定容，得到待測(cè)液；分別將所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)液置于所述孔板中，向所述孔板中加入所述顯色劑，混勻后靜置，并將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)；以及基于檢測(cè)結(jié)果確定所述待測(cè)樣品中磷含量。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
需要說明的是，對(duì)于待測(cè)樣品的種類及來源不作嚴(yán)格限定，可以根據(jù)實(shí)際情況而定，既可以是固態(tài)樣品，也可以是液態(tài)樣品。具體地，可以為食品類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，待測(cè)樣品可以為乳制品。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，基于1μL所述顯色劑，所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液及待測(cè)液的添加量均為0.5μL。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明是在孔板中進(jìn)行的，反應(yīng)體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于國(guó)標(biāo)方法的反應(yīng)體積。對(duì)于不同體積的反應(yīng)體系，各反應(yīng)物之間的相互作用并不完全相同，進(jìn)而，并不能直接將國(guó)標(biāo)方法的反應(yīng)體積比(即待測(cè)液/標(biāo)準(zhǔn)品與顯色劑的體積比)應(yīng)用于本申請(qǐng)，否則將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性低。由此，發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到上述最優(yōu)磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)液及顯色劑的添加量。添加量過高或者過低都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
此外，國(guó)標(biāo)方法中將冷卻的消解產(chǎn)物進(jìn)行定容，再取10mL定容后的溶液于50mL容量瓶中調(diào)節(jié)pH值，而本發(fā)明的方法中直接將冷卻的消解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至容量瓶中，進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值，減少了定容步驟，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：
采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理，并將所得到的消解產(chǎn)物冷卻，得到預(yù)測(cè)液；
將所述預(yù)測(cè)液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，向所述容量瓶中加入0.10～0.15mL所述指示劑，用所述第一氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)至溶液為黃色，再用所述硝酸溶液調(diào)節(jié)至溶液為無色，最后用所述第二氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液為微黃色，并用水定容至100mL，得到待測(cè)液；
分別將100μL所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100μL待測(cè)液置于所述96孔板中，向所述96孔板中加入200μL所述顯色劑，混勻后靜置10～15min，將所述96孔板置于酶標(biāo)儀中，在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度；以及
根據(jù)所述磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將所述待測(cè)液的吸光度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到所述待測(cè)樣品中的磷含量。
發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用96孔板進(jìn)行反應(yīng)，能夠同時(shí)檢測(cè)大量的待測(cè)物質(zhì)，極大地提高了檢測(cè)效率。進(jìn)一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在96孔板的檢測(cè)條件下，所需的磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)液及顯色劑添加量分別為100μL、100μL、200μL。在此條件下能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量。添加量過多或者過少都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用量程為100mL的容量瓶進(jìn)行定容，更有利于檢測(cè)。具體地，由于直接將消解產(chǎn)物進(jìn)行定容，使得后續(xù)調(diào)節(jié)pH值所需要的調(diào)解液量偏多。若采用50mL量程的容量瓶，不容易混勻，且用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)時(shí)需要加入較多體積溶液，容易超出量程。進(jìn)而，發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用100mL量程的容量瓶，不僅能夠快速地混勻調(diào)解液與消解產(chǎn)物，便于滴定，且不會(huì)超出量程，使得檢測(cè)過程操作簡(jiǎn)便、快速。
由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，“采用已知的方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行消解處理”的具體步驟如下：
稱取0.5g固體試樣或2.5g液體試樣(精確至0.1mg)于125mL三角瓶中，放入幾粒玻璃球，加10mL硝酸，然后放在電熱板上加熱。待劇烈反應(yīng)結(jié)束后取下，稍冷卻，再加入10mL高氯酸，重新放于電熱板上加熱。若消化液變黑，需取下再加入5mL硝酸繼續(xù)消化，直到消化液變成無色或淡黃色，且冒出白煙，在消化液剩下3mL～5mL時(shí)停止消解處理。
需要說明的是，對(duì)于高氯酸和硝酸的來源不作嚴(yán)格限定，既可以通過市售獲得，也可以由前面所描述的試劑盒提供。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
在該實(shí)施例中，按照下列方法測(cè)定樣品中磷含量。
1.1樣品測(cè)定
1.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精確吸取100μL磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液于標(biāo)準(zhǔn)板孔內(nèi)，再加入顯色劑200μL，混勻，25～30℃下顯色15分鐘，于酶標(biāo)儀上在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，磷含量為橫坐標(biāo)繪制曲線。
表1：100μL標(biāo)準(zhǔn)品+200μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)
備注：每個(gè)濃度點(diǎn)平行檢測(cè)，取吸光度平均值；凈吸光值為各濃度點(diǎn)檢測(cè)值減去零點(diǎn)吸光值的檢測(cè)值。
結(jié)果如表1所示。以凈吸光值為縱坐標(biāo)，磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線方程為y＝0.008x+0.002(R2＝0.997)，曲線線性好，符合方法要求的R2≥0.99。
1.1.2樣品測(cè)定
(1)稱取牛奶2.5g(精確至0.1mg)，于125mL三角瓶中，放入幾粒玻璃球，加10mL硝酸，然后放在電熱板上，在200～300攝氏度下加熱。待劇烈反應(yīng)結(jié)束后取下，稍冷卻，再加入10mL高氯酸，重新放于電熱板上，在200～300攝氏度下加熱。在消化液剩下3mL～5mL時(shí)取下，冷卻，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中；
(2)向容量瓶中加入50mL水，加入0.10～0.15mL二硝基酚指示劑，用6mol/LNaOH調(diào)至黃色，用0.2mol/LHNO3調(diào)至無色，用0.1mol/LNaOH調(diào)至微黃色，定容至100mL作為待測(cè)液，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行試驗(yàn)。同時(shí)做空白試驗(yàn)，作為對(duì)照品；
(3)分別吸取100μL待測(cè)液及對(duì)照品置于標(biāo)準(zhǔn)板孔內(nèi)，再加入顯色劑200μL，25～30℃下顯色15分鐘，于酶標(biāo)儀上在440nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，并計(jì)算磷含量(參與曲線計(jì)算的樣品吸光值是通過實(shí)際測(cè)得的樣品吸光值減去空白吸光值)。
計(jì)算公式：
P(mg/100g)＝(C×V)×100/(M×1000)
式中：
P---樣品中磷含量，mg/100g；
C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的待測(cè)液中磷的濃度，μg/mL；
V---待測(cè)液體積，mL，100；
M---樣品的質(zhì)量，g。
對(duì)比例1
在該對(duì)比例中，按照上述實(shí)施例1中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其區(qū)別在于，標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入量為50μL，顯色劑加入量為150μL，具體檢測(cè)值如下：
表2：50μL標(biāo)準(zhǔn)品+150μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)
根據(jù)表2數(shù)據(jù)，以凈吸光值為縱坐標(biāo)，磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線方程為y＝0.004x+0.003(R2＝0.969)曲線線性不符合方法要求的R2≥0.99。從而說明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量為50μL和150μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)確，進(jìn)而將影響待測(cè)液中磷含量的確定，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性偏低。
對(duì)比例2
在該對(duì)比例中，按照上述實(shí)施例1中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其區(qū)別在于，標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入量為200μL，顯色劑加入量為100μL，具體檢測(cè)值如下：
表3：200μL標(biāo)準(zhǔn)品+100μL顯色劑檢測(cè)數(shù)據(jù)
根據(jù)以上數(shù)據(jù)，以凈吸光值為縱坐標(biāo)，磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線方程為y＝0.011x+0.004(R2＝0.985)曲線線性不符合方法要求的R2≥0.99。從而說明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量為200μL和100μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)確，進(jìn)而將影響待測(cè)液中磷含量的確定，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性偏低。
綜上可知，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的加入量顯著影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與顯色劑的添加量分別為100μL和200μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性較高。進(jìn)一步地，待測(cè)液與顯色劑反應(yīng)時(shí)，待測(cè)液的加入量同樣為100μL時(shí)，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定出樣品中磷含量。
實(shí)施例2
分別按照國(guó)標(biāo)GB5413.22-2010測(cè)定磷含量的方法及實(shí)施例1的方法測(cè)定兒童牛奶及調(diào)制乳中磷含量，具體檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：
表4：檢測(cè)方法比較結(jié)果
根據(jù)以上數(shù)據(jù)，與實(shí)施例1檢測(cè)數(shù)據(jù)與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)數(shù)據(jù)相對(duì)偏差可以滿足GB5413.22-2010中的方法要求的允許差。從而表明本發(fā)明的方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定磷含量。
在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。