本發(fā)明涉及生物試劑盒領(lǐng)域，尤其涉及一種基于型特異性單抗的Asia1型口蹄疫病毒抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。

背景技術(shù)：

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄類動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，會(huì)給畜牧業(yè)生產(chǎn)和進(jìn)出口貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病不僅嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，也對(duì)人類健康構(gòu)成很大危害。我國(guó)作為一個(gè)牛羊養(yǎng)殖大國(guó)，口蹄疫是危害牛羊養(yǎng)殖極為重要疾病，加強(qiáng)對(duì)口蹄疫的診斷和檢測(cè)新技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)，突破口蹄疫診斷試劑產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)與工藝，是解決制約我國(guó)畜牧業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問(wèn)題的重大國(guó)家和社會(huì)需求，必將對(duì)提高我國(guó)畜牧業(yè)的整體發(fā)展水平和總體疫病防控能力，推動(dòng)畜牧業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生積極、深遠(yuǎn)的影響，而且對(duì)食品安全和人類健康有著特殊的意義。并且要從根本上控制口蹄疫的發(fā)生與流行，必須首先加強(qiáng)對(duì)本病的診斷學(xué)的研究，為控制我國(guó)口蹄疫提供技術(shù)支撐。

目前，口蹄疫病毒的血清型多，持續(xù)感染無(wú)癥狀帶毒嚴(yán)重，準(zhǔn)確診斷血清型和精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)隱性帶毒，是防控該病的首要環(huán)節(jié)。與生命領(lǐng)域的診斷監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)展同步，口蹄疫診斷監(jiān)測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程可分為3個(gè)階段，即早期的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)，隨后以酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)為核心的病原和抗體檢測(cè)方法，現(xiàn)今的以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的多種分子診斷技術(shù)。然而，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已有方法表現(xiàn)出了這樣或那樣的不足，或煩瑣費(fèi)時(shí)，或沒(méi)有達(dá)到十分精準(zhǔn)的程度。目前應(yīng)用于口蹄疫診斷有病毒分離、ELISA、PCR、凝集試驗(yàn)、免疫膠體金層析技術(shù)等，應(yīng)用最廣泛的是液相阻斷ELISA，但LPB-ELISA程序較多、操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)至少需要一天的時(shí)間才能獲得結(jié)果，因此在疫情突發(fā)時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)大量的樣品的即時(shí)檢測(cè)。要克服現(xiàn)狀就必須研制新型ELISA診斷技術(shù)。

固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法是OIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過(guò)篩選和制備診斷關(guān)鍵標(biāo)識(shí)物(型特異性單抗)，解決型間交叉、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，突破了使用多抗交叉、不穩(wěn)定的問(wèn)題；通過(guò)HRP標(biāo)記單抗，替代現(xiàn)有液相阻斷ELISA中的口蹄疫兔抗、豚鼠抗血清及抗豚鼠酶標(biāo)抗體，簡(jiǎn)化ELISA方法步驟，這樣就減少可實(shí)驗(yàn)操作步驟，底物直接和一抗反應(yīng)，節(jié)省了時(shí)間，提高了敏感性和特異性。提高穩(wěn)定性，突破了原來(lái)ELISA需要一抗和二抗等反應(yīng)過(guò)程，大 幅度縮短檢測(cè)時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于型特異性單抗的Asia1型口蹄疫病毒抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于型特異性單抗的Asia1型口蹄疫病毒抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，其特征在于，含有HRP標(biāo)記的Asia1型口蹄疫特異性單抗。

進(jìn)一步，所述HRP標(biāo)記的Asia1型口蹄疫特異性單抗制備方法為，

脾細(xì)胞的細(xì)胞懸液的制備：采用常規(guī)免疫方法對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，共4次，首先用卡介苗致敏小鼠，200μl/只；一周后將純化的Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏完全佐劑等質(zhì)量混勻、充分乳化后，按0.3ml/只免疫小鼠，腋窩，腹股溝注射，共免疫5只；初次免疫后每間隔3周再免疫一次，純化的Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏不完全佐劑等質(zhì)量混勻，在小鼠頸背部皮下分次多點(diǎn)注射，細(xì)胞融合前3天腹腔加強(qiáng)免疫一次；3天后摘該小鼠眼球取血，得到脾細(xì)胞的細(xì)胞懸液；

細(xì)胞融合：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞和所述脾細(xì)胞的細(xì)胞懸液混勻，離心棄上清；將融合管置手掌中來(lái)回摩擦，使細(xì)胞塊松動(dòng)，用滴管往玻璃管中緩慢加入0.7ml 37℃預(yù)熱的50％PEG1000，90s內(nèi)加完，靜置60s，在5min內(nèi)先慢后快逐滴加入37℃預(yù)熱的無(wú)血清DMEM，共加10ml，輕搖混勻后，離心棄上清；用HAT培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，隨即移入60mlHAT培養(yǎng)液中，輕輕混勻，然后按100μl/孔轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5％CO₂、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

雜交瘤細(xì)胞的篩選：培養(yǎng)第六天用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行半量換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔底的1/4～1/3時(shí)吸出上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)；P/N≥2.1的細(xì)胞即為雜交瘤細(xì)胞；

雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)；

單克隆抗體的制備：每只小鼠腹腔注入0.5mL1x10⁶～6x10⁶/mL的雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部慢慢隆起，小鼠精神沉郁、不走動(dòng)、瀕臨死亡時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，收集腹水，室溫、10000r/min離心10min，收集中間透亮液體即為單克隆抗體；

HRP標(biāo)記純化的單克隆抗體：將飽和硫酸銨純化之后濃度為5.284mg/ml的單克隆抗體0.3mL與0.1mL過(guò)氧化物酶加入管中，輕輕吹打混勻，4℃過(guò)夜；再加入40μL的三乙醇胺，混勻，加入50μL的硼氫化鈉，混勻，4℃放置30min后，加入10μL甘氨酸混勻；之后將混合液置于透析袋中透析，透析液為PH 7.2的PBS，所得即為HRP標(biāo)記的ASIA1型口蹄疫特異性單抗。

進(jìn)一步，所述細(xì)胞融合步驟中，脾細(xì)胞數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的比例為5:1到10:1。

本發(fā)明還保護(hù)使用所述固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒進(jìn)行ASIA1型口蹄疫病毒抗體水平監(jiān)測(cè)的用途。

本發(fā)明所涉及的檢測(cè)方法以輕簡(jiǎn)化或精準(zhǔn)為目標(biāo)的新型定性定量技術(shù)。

本發(fā)明針對(duì)口蹄疫現(xiàn)有診斷技術(shù)存在費(fèi)時(shí)、交叉嚴(yán)重、穩(wěn)定性差等技術(shù)缺陷，通過(guò)篩選和制備診斷關(guān)鍵標(biāo)識(shí)物(型特異性單抗)，解決型間交叉、穩(wěn)定性差、費(fèi)時(shí)、步驟繁瑣等問(wèn)題，突破了使用多抗交叉、不穩(wěn)定、費(fèi)時(shí)、步驟繁瑣的問(wèn)題；通過(guò)HRP標(biāo)記該單抗，替代現(xiàn)有ELISA中口蹄疫兔抗、豚鼠抗血清及抗豚鼠酶標(biāo)抗體，簡(jiǎn)化ELISA方法步驟，提高穩(wěn)定性、大幅度縮短檢測(cè)時(shí)間，從24h縮短至1.5小時(shí)內(nèi)，突破了原來(lái)ELISA需要一抗和二抗等反應(yīng)過(guò)程。該方法可為檢測(cè)ASIA1型口蹄疫的免疫和感染狀況提供一種更好的確診方法。

本發(fā)明所制備的檢測(cè)試劑可為ASIA1型口蹄疫流調(diào)及抗體水平監(jiān)測(cè)提供支持。

附圖說(shuō)明

圖1是抗體效價(jià)測(cè)定(定量)檢測(cè)10份樣品布局圖。

圖2是抗體測(cè)定(定性)檢測(cè)20份樣品布局圖。

圖3是檢測(cè)實(shí)施例1中腹水單抗的特異性結(jié)果圖。

圖4是未純化和純化的腹水單抗的SDS-PAGE電泳圖。

圖5是5E5-HRP的特異性的ELISA檢測(cè)結(jié)果圖。

圖6是5E5-HRP的效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖7是型特異性單抗5E5的抗原反應(yīng)譜檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、抗原及細(xì)胞

8周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠，購(gòu)買于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；SP/20及BHK-21細(xì)胞購(gòu)自中科院武漢病毒所國(guó)家典藏物保存中心。O型口蹄疫病毒滅活抗原，A型口蹄疫病毒滅活抗原，Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原均購(gòu)自中農(nóng)威特生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

液體石蠟，山羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自Sigma公司，96孔酶標(biāo)板購(gòu)自CORNING公司，2mol/L的H₂SO₄由蘭州獸醫(yī)研究所檢測(cè)組提供，胎牛血清購(gòu)自GIBICO公司，TMB購(gòu)自SurModics公司，改良型RPM1-1640購(gòu)自Hyclone公司，碳酸鹽緩沖液膠囊購(gòu)自Sigma公司，未預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas。

1.2 方法

2.1 動(dòng)物免疫

采用常規(guī)免疫方法對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，共4次，首先用卡介苗致敏小鼠，200μl/只。一周后將純化的Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏完全佐劑等質(zhì)量混勻、充分乳化后，按0.3ml/只免疫小鼠，腋窩，腹股溝注射，共免疫5只；初次免疫后每間隔3周再免疫一次，免疫的Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏不完全佐劑等質(zhì)量混勻，在小鼠頸背部皮下分次多點(diǎn)注射，細(xì)胞融合前3天腹腔加強(qiáng)免疫一次。

1.2.2 篩選方法的建立

篩選時(shí)采用間接ELISA檢測(cè)法，用方陣滴定試驗(yàn)選擇最佳抗原包被濃度。辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗，最佳二抗?jié)舛炔捎帽緦?shí)驗(yàn)室通用工作濃度1:1 000。具體步驟如下：

(1)將抗原作1:250，1:500和1:1 000的稀釋，100μl/孔包被，37℃作用2h，4℃過(guò)夜。

(2)次日，將酶標(biāo)板中包被液拍干，用封閉液按120μl/孔封閉，37℃作用2h后，拍干待測(cè)。

(3)陽(yáng)性血清自1:40開(kāi)始倍比稀釋至第9列(1:10240)，同時(shí)設(shè)1組陰性對(duì)照(即為未免疫Asia1型口蹄疫抗原的老鼠血清)，一組空白對(duì)照(即為不加任何血清的對(duì)照孔)；加樣后37℃作用0.5h，洗滌3次。

(4)加入酶標(biāo)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，50μl/孔，37℃作用30min，洗滌3次。

(5)加入底物A,B各50μl/孔，于37℃下顯色10min，用終止液終止反應(yīng)，50μl/孔。用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定OD450值。

用間接ELISA檢測(cè)法篩選時(shí)，選擇陽(yáng)性血清和陰性血清的比值最大，且OD450值接近于1的抗原稀釋度作為間接ELISA反應(yīng)體系的最佳工作濃度。篩選雜交瘤細(xì)胞時(shí)用該體系對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)，判為陽(yáng)性。

1.2.3 小鼠效價(jià)的測(cè)定

間接ELISA方法建立后，選用最佳包被濃度檢測(cè)免疫小鼠的抗體效價(jià)。選取免疫效價(jià)檢測(cè)值最高的小鼠腹腔追加免疫一次，三天后取該鼠的脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.4.雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.2.4.1 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備

于融合前兩周復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞SP/20(購(gòu)自自中科院武漢病毒所國(guó)家典藏物保存中心)。

將凍存管自液氮中取出，立即放到37℃溫水中，讓其溶解，待完全溶解后，1000rpm離心10min，棄上清，沉淀用含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液小心混懸，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程在培養(yǎng)液中加入8-氮鳥嘌呤，按100μl/瓶細(xì)胞加入，每日處理一次，連續(xù)處理三次。使SP/20細(xì)胞對(duì)HAT培養(yǎng)液更加敏感。傳至8瓶，并使融合當(dāng)天的骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，備用。

1.2.4.2 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備

細(xì)胞融合當(dāng)天準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，方法如下：

(1)取一只8～10周齡健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制備陰性血清。斷頸處死，用75％的酒精消毒處理。

(2)將小鼠置于超凈工作臺(tái)中，腹面向上，用鑷子提起小鼠腹部皮膚，在下腹部剪一小口，縱向剝離，充分暴露腹膜，并用酒精消毒。

(3)用一次性滅菌注射器抽取5ml HAT培養(yǎng)液注入小鼠腹腔內(nèi)，右手注射器保持不動(dòng)，輕搖小鼠，隨后抽取細(xì)胞懸液。

(4)將細(xì)胞懸液加入60ml HAT培養(yǎng)基中，混勻后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1～5×105個(gè)/ml。如細(xì)胞數(shù)量過(guò)少，可再按上述步驟制備飼養(yǎng)細(xì)胞。

(5)按100μl/孔轉(zhuǎn)入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.2.4.3 脾細(xì)胞的準(zhǔn)備

(1)取三天前加強(qiáng)免疫的小鼠，摘眼球取血，制備陽(yáng)性血清。斷頸處死，用75％的酒精消毒處理。

(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌摘取脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，置于200目滅菌金屬網(wǎng)上，用滅菌玻璃注射器芯輕輕研磨脾臟，同時(shí)緩慢滴加無(wú)血清DMEM。

(3)收集脾細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，1 000rpm離心5min，棄上清，重懸 于5ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中，脾細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。

1.2.4.4 細(xì)胞的融合

(1)選擇狀態(tài)良好且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SP/20細(xì)胞6～8瓶，將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來(lái)并轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，1 000rpm離心10min。棄上清，用5ml無(wú)血清DMEM懸浮，計(jì)數(shù)。

(2)將SP/20細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞懸液混勻，脾細(xì)胞數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的比例應(yīng)維持在5:1到10:1之間。

(3)1 000rpm離心5min，棄上清。

(4)將融合管置手掌中來(lái)回摩擦，使細(xì)胞塊松動(dòng)，此步為融合關(guān)鍵步驟。

(5)用滴管往玻璃管中緩慢加入0.7ml 37℃預(yù)熱的50％PEG(1000)，90s內(nèi)加完，靜置60s。

(6)在5min內(nèi)先慢后快逐滴加入37℃預(yù)熱的無(wú)血清DMEM，共加10ml，輕搖混勻后，1 000rpm離心5min，棄上清。

(7)用HAT培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，隨即移入60mlHAT培養(yǎng)液中，輕輕混勻，然后按100μl/孔轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選

融合后注意觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，一般培養(yǎng)三天左右即有小克隆出現(xiàn)。第六天用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行第1次半量換液，第8～10天左右，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔底的1/4～1/3時(shí)吸出上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。以P/N≥2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，用SP/20細(xì)胞培養(yǎng)上清及正常小鼠血清作陰性對(duì)照。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。第一次亞克隆時(shí)換用HT培養(yǎng)液，兩周后換為普通完全培養(yǎng)液。

1.2.4.6 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)

對(duì)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞及時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，采用有限稀釋法[59]。步驟如下：

(1)制備飼養(yǎng)細(xì)胞，方法如前所述。HT培養(yǎng)液中，制備飼養(yǎng)細(xì)胞層，每孔100μl。

(2)用移液器將ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔中雜交瘤細(xì)胞輕輕吹打混勻，取樣，于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上作細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用HT培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)。首次亞克隆時(shí)一般調(diào)整細(xì)胞數(shù)至15～20個(gè)/ml，第二、第三次亞克隆時(shí)一般調(diào)整細(xì)胞數(shù)至10個(gè)/ml。

(3)將雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。

在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

(4)每天觀察并記錄每孔細(xì)胞克隆數(shù)，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔底的1/4～1/3時(shí)半量換液，并對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。

(5)選擇克隆數(shù)少、OD450值高的陽(yáng)性孔，將其再次克隆。經(jīng)3～4次克隆化操作，直至 所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100％時(shí)，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株即抗Asia1型FMDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(2D6)，應(yīng)及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.5 雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

從液氮罐中取出一支特異性抗Asia1型FMDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(2D6)凍存管(制備方法參考實(shí)施例1中的1.2)，用鑷子夾住后迅速放入37℃水浴鍋中，不停的晃動(dòng)使細(xì)胞迅速融化，無(wú)菌打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞液移入盛有10mL改良型RPM1-1640培養(yǎng)基中，置于含5％CO₂的37℃培養(yǎng)箱中等雜交瘤細(xì)胞完全貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.2.6 單克隆抗體的大量制備

選取8周齡的Balb/c雌鼠，在無(wú)菌條件下，每只腹腔注射0.5mL滅菌的液體石蠟。兩周后，將準(zhǔn)備好的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液(改良型RPMI-1640)注入小鼠的腹腔內(nèi)。

雜交瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：挑選生長(zhǎng)狀況良好的雜交瘤細(xì)胞采用培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)，無(wú)菌條件下，倒掉細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，加入適量的胰酶消化細(xì)胞使其脫落，加入5mL無(wú)血清改良型RPM1-1640培養(yǎng)基，輕輕吹起細(xì)胞，全部移入離心管中，室溫、1000r/min離心10min，棄上清，加入適量無(wú)血清改良型RPM1-1640培養(yǎng)基懸起細(xì)胞，臺(tái)盼蘭細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1x10⁶～6x10⁶/mL，每只小鼠腹腔注入0.5mL所得細(xì)胞，每天觀察小鼠，小鼠腹部慢慢隆起，約7～10d小鼠精神沉郁、不走動(dòng)、瀕臨死亡時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，收集腹水，室溫、10000r/min離心10min，收集中間透亮液體即為2D6也即為單克隆抗體。

1.2.7 腹水特異性的檢測(cè)

將滅活的抗原O、A和Asia1包被于酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過(guò)夜。采用間接ELISA方法對(duì)腹水的特異性進(jìn)行測(cè)定：每孔加入100μL PBS稀釋的2D6(1:2000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μL PBS稀釋好的山羊抗小鼠IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μL TMB，37℃孵育15min，加入2M H₂SO₄，用酶標(biāo)儀讀取OD₄₅₀。

1.2.8 型特異性單抗2D6的反應(yīng)譜分析

將近年來(lái)我國(guó)流行的Asia1型口蹄疫滅活抗原(購(gòu)自中農(nóng)威特生物科技有限公司)包被ELISA板，100μL/孔，4℃過(guò)夜。采用間接ELISA方法對(duì)Asia1型單抗的型內(nèi)反應(yīng)譜進(jìn)行測(cè)定：每孔加入100μL PBS稀釋的2D6(1:2000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μL PBS稀釋好的山羊抗小鼠IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μL TMB，37℃孵育15min，加入2MH₂SO₄，用酶標(biāo)儀讀取OD₄₅₀值。

1.2.9 HRP標(biāo)記純化的單克隆抗體

將飽和硫酸銨純化之后濃度為5.284mg/mL的抗體0.3mL與0.1mL過(guò)氧化物酶加入1.5mL的EP管中，輕輕吹打混勻，4℃過(guò)夜。向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混勻，加入50μL 的硼氫化鈉，混勻，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混勻。之后將混合液置于透析袋中透析(PH 7.2的PBS)。

1.2.10 Asia1型口蹄疫病毒兔抗血清的制備

1.2.10.1 病毒純化用無(wú)RNase的蔗糖(Sigma公司生產(chǎn))制備150、250、350、450g/L的蔗糖密度梯度，4℃靜置平衡過(guò)夜。次日將樣品加于頂部，10℃35000r/min(日立CP70VB離心機(jī))離心150min，以0.5mL為1個(gè)級(jí)分，從低濃度到高濃度進(jìn)行收集。根據(jù)Bachrach等的研究，取蔗糖密度處于350～450g/L，此處為口蹄疫病毒有效滅活抗原富集區(qū)域，-80℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.10.2 免疫程序取上述充分乳化的弗氏完全佐劑抗原，于每只兔兩后腿足部皮下，腘淋巴結(jié)處及背部皮下多點(diǎn)接種，接種總量為2ml，14日后仍以上述抗原和劑量由背部皮下多點(diǎn)接種，進(jìn)行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐劑抗原，由每只兔肩部肌肉兩點(diǎn)，背部皮下多點(diǎn)接種，接種總量為2ml，為其第三次免疫。

1.2.10.3 試血第三次免疫之后采血，通過(guò)Asia1型口蹄疫液相阻斷ELISA測(cè)定兔抗血清效價(jià)，若效價(jià)達(dá)到1:1024，則采用頸動(dòng)脈分離兔抗血清，若沒(méi)有達(dá)到，則進(jìn)行第四次免疫，直到血清效價(jià)達(dá)到1:1024，采血分離血清備用。

1.3 基于酶標(biāo)抗體的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

1.3.1 各試劑最佳使用濃度的確定

本發(fā)明利用Asia1型口蹄疫病毒兔抗血清(1.2.10制備的O型兔抗血清)和HRP標(biāo)記的Asia1型口蹄疫特異性單抗(也就是1.2.9制備得到的HRP標(biāo)記純化的單克隆抗體)建立固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。采用方陣滴定法確立該方法中包被的多抗、抗原和競(jìng)爭(zhēng)抗體的最佳使用濃度。

1.3.2 O型口蹄疫固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

◆準(zhǔn)備

根據(jù)不同的需要，選擇下圖中的一種布局來(lái)設(shè)定相應(yīng)的檢測(cè)目的。圖1.抗體效價(jià)測(cè)定(定量)檢測(cè)10份樣品布局圖；圖2.抗體測(cè)定(定性)檢測(cè)20份樣品布局圖。

◆稀釋血清

建議在血清稀釋板上按照實(shí)驗(yàn)需求稀釋血清，之后整體移至包被板反應(yīng)板中。

在血清稀釋板中，以60μL/孔的量用樣品稀釋液2倍連續(xù)稀釋血清，被檢血清在第1～10 列從1:4(即A1～A10孔，75μL樣品稀釋液加25μL被檢血清)稀釋至1:512；在第11列稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清，方法同稀釋待檢血清；在第12列稀釋陰性對(duì)照血清，從A12～D12，方法同稀釋待檢血清；E12～H12為空白對(duì)照(僅為樣品稀釋液)。

注：由于本方法是競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，當(dāng)稀釋血清移至反應(yīng)板后，再加入等量的酶標(biāo)抗體工作液，此時(shí)血清的稀釋度加倍，被檢血清從1:8～1:1024，由于陽(yáng)性對(duì)照血清已經(jīng)預(yù)先做了1:8倍稀釋，則變?yōu)?:32～1:4096。

◆加樣

將稀釋板整體平移至包被反應(yīng)板中，每孔50μL；隨后給所有反應(yīng)孔加50μL，標(biāo)抗體工作液，輕輕震蕩，37℃反應(yīng)30分鐘。

◆洗滌 取出酶標(biāo)板，將其甩干，用洗滌液洗滌3～5次，在吸水紙上甩干。

◆顯色 每孔加入底物溶液50μL，于37℃溫箱靜置避光反應(yīng)5～10分鐘。

◆終止 每孔加入50μL終止液。

◆結(jié)果計(jì)算及判定 在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處，測(cè)定酶標(biāo)板的每孔光吸收值，求出每份被檢血清和同板單抗對(duì)照的平均光吸收值，根據(jù)公式計(jì)算各樣品抑制率(PI)值，PI＝[1－樣品孔OD/競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)照孔OD]x100％。以競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)照孔平均OD₄₅₀值介于0.9～2.2，陰性對(duì)照血清PI值＜40％，陽(yáng)性對(duì)照血清PI值＞50％時(shí)，空白對(duì)照PI值＜5％，試驗(yàn)成立。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：PI＞60％，抗體陽(yáng)性；PI＜60％，抗體陰性；PI＝60％，判定陽(yáng)性可疑，重復(fù)檢測(cè)一次，如果仍然為60，判定為陽(yáng)性，如果不等于60需再次檢測(cè)，或用其它方法檢測(cè)。

1.3.3 固相競(jìng)爭(zhēng)臨界值的確定

對(duì)22份陽(yáng)性血清樣品和20份陰性血清樣品分別進(jìn)行和倍稀釋，用已建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品不同稀釋度的PI值(抑制率)，確定血清也就是抗原的最佳稀釋倍數(shù)。根據(jù)結(jié)果中各個(gè)樣品的每個(gè)稀釋度的檢測(cè)結(jié)果，最終確定為最佳臨界值。

1.3.4 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的特異性

利用所建立的ELISA方法檢測(cè)口蹄疫A型、O型、豬瘟、豬藍(lán)耳及羊口瘡等傳染病陽(yáng)性血清樣品。同時(shí)，用該ELISA方法檢測(cè)已知Asia1型口蹄疫陽(yáng)性的血清(10份)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，分析試劑盒特異性。

1.3.5 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的符合率

應(yīng)用商品化檢測(cè)Asia1型口蹄疫病毒血清抗體試劑盒檢測(cè)Asia1型口蹄疫陰、陽(yáng)性血清，共計(jì)60份，商品化的試劑盒為荷蘭的PrioCHECK口蹄疫抗體檢測(cè)試劑盒。

1.3.6 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)：用同一批次制備的多抗、抗原、HRP標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對(duì)7份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)獨(dú)立檢測(cè)5次，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

批間重復(fù)：用三個(gè)批次制備的多抗、抗原、HRP標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對(duì)7份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)獨(dú)立檢測(cè)1次，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)

2.結(jié)果

2.1 檢測(cè)腹水特異性結(jié)果

經(jīng)間接ELISA的檢測(cè)，制備的Mab與Asia1型抗原反應(yīng)性很好，與A和Asia1型抗原及BHK-21細(xì)胞均不反應(yīng)，具有良好的特異性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2 純化后2D6單抗的SDS-PAGE分析

將經(jīng)飽和硫酸銨沉淀純化的2D6單抗進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，其中泳道M為蛋白質(zhì)分子Marker；泳道1為未純化的2D6腹水電泳結(jié)果，泳道2為純化的2D6腹水電泳結(jié)果，從圖中可以看出，純化后的2D6單抗有兩條帶，分別是IgG的重鏈和輕鏈，大小分別約為45kDa和25kDa，與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得抗體的濃度為5.927mg/mL。

2.3 標(biāo)記后Mab特異性及效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。從圖5中可以看出，Asia1型特異性單抗標(biāo)記HRP后，只與Asia1型口蹄疫病毒發(fā)生反應(yīng)，與A型、O型口蹄疫及BHK細(xì)胞培養(yǎng)上清均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明該標(biāo)記抗體特異性很高。從圖6中可以看出，標(biāo)記后的Asia1型單抗在稀釋到1:12800時(shí)，其OD450值仍接近1.5。

2.4 抗Asia1型口蹄疫的型特異性單抗2D6的反應(yīng)譜分析

從圖7中可以看出2D6可以與近年來(lái)流行的Asia1型口蹄疫病毒均能發(fā)生反應(yīng)，由此可以 看出2D6不但具有良好的型間特異性，而且在同一型內(nèi)具有很好的反應(yīng)廣譜性，是作為檢測(cè)用的最佳抗體。X軸代表O型不同抗原，Y軸代表492nm處的OD值。

2.5 各試劑最佳使用濃度及臨界值的確定

本研究應(yīng)用兔抗Asia1型口蹄疫多抗血清及HRP酶標(biāo)單抗建立的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。用方陣滴定法確定的兔抗多抗(效價(jià)1:1024)最佳使用濃度(1:1000)，抗原(TCID₅₀0.1mL＝7.2)的最佳稀釋度為1:15檢測(cè)單克隆抗體的最佳使用濃度稀釋(1:7000)，

用已建立的方法對(duì)22份陽(yáng)性血清樣品和20份陰性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)分別進(jìn)行，根據(jù)結(jié)果中各個(gè)切點(diǎn)的敏感性及特異性結(jié)果，所以最終確定為最佳臨界值為：當(dāng)抗體稀釋度≥1:64，且PI大于60％，判定抗體陽(yáng)性；小于60％，判定抗體陰性。

2.6 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的特異性

利用所建立的ELISA方法檢測(cè)口蹄疫O型、A型、Asia1型、豬瘟、豬藍(lán)耳及羊口瘡等傳染病陽(yáng)性血清樣品，根據(jù)判定方法均為陰性(表1)。這些數(shù)據(jù)表明，所建立的ELISA方法具有良好的特異性，血清抗體之間不存在交叉反應(yīng)。同時(shí)，用該ELISA方法檢測(cè)已知Asia1型口蹄疫陽(yáng)性的血清(10份)均為陽(yáng)性。由此可見(jiàn)所建立的Asia1型口蹄疫血清抗體檢測(cè)方法具有良好的特異性。

表1.特異性檢測(cè)結(jié)果

2.7 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的符合率

應(yīng)用商品化檢測(cè)Asia1型口蹄疫病毒血清抗體試劑盒檢測(cè)Asia1型口蹄疫陰、陽(yáng)性血清，共計(jì)60份，商品化的試劑盒為荷蘭的PrioCHECK的符合率為96.7％,符合率＝兩種相互比對(duì)的試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致的血清數(shù)/待檢血清數(shù)×100％,表明本發(fā)明所涉及的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果可靠。具體見(jiàn)表2。

表2.符合率實(shí)驗(yàn)表

2.8 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)：用同一批次制備的多抗、抗原、HRP標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對(duì)7份血清樣品(其中陽(yáng)性血清5份，陰性血清2份)進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。本發(fā)明的試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％，說(shuō)明其重復(fù)性好。

表3.批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

批間重復(fù)：用三個(gè)批次制備的多抗、抗原、HRP標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對(duì)7份血清樣品(其中陽(yáng)性血清5份，陰性血清2份)進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4，從表4中可以看出，批間變異系數(shù)均小于10％，說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒批間重復(fù)性好。

表4.批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。