本發(fā)明屬于保健食品或食品領(lǐng)域，涉及一種多糖的檢測(cè)方法，具體涉及一種真菌多糖的檢測(cè)方法。

技術(shù)背景

糖類物質(zhì)的研究已經(jīng)有幾百年的歷史，不過(guò)長(zhǎng)久以來(lái)，人們對(duì)糖類物質(zhì)的認(rèn)識(shí)僅僅是一種能源物質(zhì)或結(jié)構(gòu)物質(zhì),對(duì)于其生理活性沒有深入的研究。隨著生命科學(xué)的發(fā)展,糖類物質(zhì)在高層次生命現(xiàn)象中的作用越來(lái)越受到重視，糖類物質(zhì)的研究已成為學(xué)者們的新焦點(diǎn)。近年來(lái)，多糖提取產(chǎn)業(yè)得到高速發(fā)展，特別是在中國(guó)，以天然植物多糖和真菌多糖提取為代表的多糖提取工業(yè)處于世界領(lǐng)先地位。多糖提取工藝在十多年的改進(jìn)中得到長(zhǎng)足的發(fā)展，但是多糖的檢測(cè)技術(shù)一直沒有太大進(jìn)展。至今都沒有一種統(tǒng)一的檢測(cè)方法能有效準(zhǔn)確的檢測(cè)出不同提取物中多糖的含量，或者有參假現(xiàn)象多糖的含量。究其原因，一方面是各種不同原料不同提取方法確實(shí)導(dǎo)致各種多糖性質(zhì)不同，難以簡(jiǎn)單的用同一種方法檢測(cè)；另一方面也是對(duì)多糖檢測(cè)方法的研究不夠。國(guó)內(nèi)常用的多糖檢測(cè)方法主要有有苯酚硫酸法、硫酸蒽酮法、直接滴定法、3,5-二硝基水楊酸法（DNS 法）、Orcinol 法、間接碘量法、高效液相色譜法等。硫酸苯酚法主要用于測(cè)定總糖（包括所有單糖和各類多糖）， 在進(jìn)行多糖測(cè)定時(shí)要先沉淀多糖，去除單糖的干擾。硫酸蒽酮法主要用于測(cè)定己糖和含己糖的多糖。Orcinol法則主要用于測(cè)定戊糖和含戊糖的多糖，國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。DNS法用于還原糖含量的測(cè)定。直接滴定法測(cè)定結(jié)果可能偏高，因淀粉等多糖對(duì)其有干擾作用。高效液相法測(cè)定多糖需要有多糖的標(biāo)樣，成本高，耗時(shí)太長(zhǎng)。

中國(guó)發(fā)明專201310547868.9公開了一種含有靈芝多糖制劑的檢測(cè)方法，其特征是通過(guò)對(duì)制劑的粗多糖進(jìn)行醇沉提取，再用堿性硫酸銅純化后以苯酚硫酸顯色，照紫外-可見分光光度法的比色法測(cè)定制劑的靈芝多糖。這種方法可以拍出糊精等低聚糖對(duì)檢測(cè)的影響，但是無(wú)法排除高分子量多糖的干擾。中國(guó)發(fā)明專利201210397189.3涉及一種摻有糖類干擾物的枸杞多糖提取物中多糖含量的檢測(cè)方法，將摻有糖類干擾物的枸杞多糖提取物溶解于水中，然后加入磷酸緩沖液、淀粉酶，再用醇沉，可以排出淀粉對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。這種方法可以排出淀粉的干擾，但是對(duì)于其他多糖沒有鑒別作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種真菌多糖的檢測(cè)方法，該方法可準(zhǔn)確檢測(cè)出真菌中真菌多糖的含量，操作程序簡(jiǎn)便、迅速。

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種真菌多糖的檢測(cè)方法,包括如下步驟：

A、制樣

(1) 稱取0.1-1g的真菌多糖樣品置于置100ml或250ml容量瓶中，加水加熱至80℃，超聲波30min使真菌多糖樣品溶解，再定容；

（2）取步驟（1）中溶液5-10ml，置離心管中，加入乙醇100ml，搖勻后靜置10-20min，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-20min，棄去上清液，重復(fù)3次，得到沉淀物；

（3）取沉淀物，加入85℃熱水溶解，置于燒杯內(nèi)，沉淀物：熱水為1：1.35，按重量比計(jì)，并加入苔蘚酶或纖維素酶0.1ml，采用水浴法在40℃的溫度下水浴1h得到混合液，將混合液取出并加熱至沸騰，保持沸騰10min，調(diào)節(jié)溫度至40℃加入0.1mlβ-葡聚糖酶，再將加入β-葡聚糖酶的混合液水浴1h后加熱至沸騰，并保持沸騰10min，再水浴蒸干得到樣品半成品，樣品半成品的含水量為10%；

（4）加5-10ml水溶解燒杯內(nèi)樣品半成品，再再以流速10ml/分加入乙醇70-75ml加入乙醇70-75ml，搖勻后靜置10-20min，以4000r/minr的轉(zhuǎn)速離心10-20min，棄去沉淀，上清液用乙醇定容至25ml，得到樣品；

B、以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)；

C、取1-2ml樣品蒸干，加水2ml，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對(duì)應(yīng)的樣品中無(wú)水葡萄糖的濃度；

D、根據(jù)以下方程計(jì)算得到樣品中多糖含量；

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上述的真菌多糖的檢測(cè)方法，其中，所述步驟（1）中所述超聲波的功率為380KW。

上述的真菌多糖的檢測(cè)方法，其中，所述步驟（1）及步驟（4）中乙醇的濃度質(zhì)量百分比濃度為95%。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明在制樣時(shí)通過(guò)第一次水提純排除了各種單糖、低聚糖等分子量小的糖類物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，對(duì)于添加的葡萄糖、果糖、糊精等都有很好的效果，然后用具有β-糖苷鍵專一性的酶對(duì)提取到的多糖進(jìn)行分解，把具有β-糖苷鍵的真菌多糖分解成單糖，而具有α-糖苷鍵的淀粉等參假成分無(wú)法被分解，最后醇沉去除雜多糖，得到的單糖用顯色法測(cè)定其含量，再用0.9的系數(shù)換算成葡聚糖，即得到樣品中真菌多糖的含量。

本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、節(jié)約時(shí)間，檢測(cè)儀器要求低，可為各類檢測(cè)機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)商、客戶解決質(zhì)量控制上遇到的檢測(cè)問(wèn)題，防止參假產(chǎn)品對(duì)市場(chǎng)的危害。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

摻有糊精的灰樹花多糖提取物中灰樹花多糖含量的檢測(cè)：

A、制樣

（1）稱取摻有糊精的灰樹花多糖提取物0.2g,置100ml容量瓶中，加水加熱到80℃，用超聲波30min使摻有糊精的灰樹花多糖提取物溶解，再定容定容；

（2）取步驟（1）中溶液5ml，置離心管中，加入95%乙醇100ml，搖勻后靜置10min，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，重復(fù)3次，得到沉淀物；

（3）取沉淀物，加入85℃熱水溶解，置于燒杯內(nèi)，沉淀物：熱水為1：1.35，按重量比計(jì)，加入苔蘚酶0.1ml，采用水浴法在40℃的溫度下水浴1h得到混合液，將混合液取出并加熱至沸騰，保持沸騰10min，調(diào)節(jié)溫度至40℃加入0.1mlβ-葡聚糖酶，再將加入β-葡聚糖酶的混合液水浴1h后加熱至沸騰，并保持沸騰10min，再水浴蒸干得到樣品半成品，樣品半成品的含水量為10%；

（3）加5ml水溶解燒杯內(nèi)半成品，再以流速10ml/分95%乙醇75ml，搖勻后靜置10min，以4000r/minr的轉(zhuǎn)速離心10-20min，棄去沉淀，上清液用乙醇定容至25ml，得到樣品；

B、以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)；取無(wú)水葡萄糖加水制成每lml含0.12mg的葡萄糖溶液，以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。取葡萄糖溶液 0. 2、0. 4、0. 6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中，各加水至2.0ml,加入硫酸蔥酮溶液（稱取蔥酮或苯酚0.lg,加硫酸100ml使溶解，搖勻)6ml，搖勻，放置15分鐘后，置冰浴中冷卻5分鐘，取出，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法顯色，在 623nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5.27206x-0.00566，R2=0.99895。冰浴即具塞試管外再放置一大些的容器裝入裝入冰，起冷卻作用。

C、取1ml樣品蒸干，加水2ml，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，測(cè)定吸光度為0.2568，根據(jù)測(cè)定的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對(duì)應(yīng)的樣品中無(wú)水葡萄糖的濃度；從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中無(wú)水葡萄糖的含量為0.0498mg/mL。

D、根據(jù)以下方程計(jì)算得到樣品中多糖含量；根據(jù)以下方程計(jì)算得到摻有糊精的灰樹花多糖提取物中灰樹花多糖含量為13.13%。

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實(shí)施例2 摻有淀粉的靈芝多糖提取物中靈芝多糖含量的檢測(cè)

A、制樣

（1）稱取摻有淀粉的靈芝多糖提取物0.2g,置250ml容量瓶中，加水加熱至80℃，超聲波30min使摻有淀粉的靈芝多糖提取物溶解，再定容；

（2）取步驟（1）中溶液5ml，置離心管中，加入95%乙醇100ml，搖勻后靜置10min，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-20min，棄去上清液，重復(fù)3次，得到沉淀物；

（3）取沉淀物，加入85℃熱水溶解，置于燒杯內(nèi)，沉淀物：熱水為1：1.35，按重量比計(jì)，并加入苔蘚酶或纖維素酶0.1ml，采用水浴法在40℃的溫度下水浴1h得到混合液，將混合液取出并加熱至沸騰，保持沸騰10min，調(diào)節(jié)溫度至40℃加入0.1mlβ-葡聚糖酶，再將加入β-葡聚糖酶的混合液水浴1h后加熱至沸騰，并保持沸騰10min，再水浴蒸干得到樣品半成品，樣品半成品的含水量為10%；

（4）加5ml水溶解燒杯內(nèi)樣品半成品，加入95%乙醇75ml，搖勻后靜置10min，以4000r/minr的轉(zhuǎn)速離心10-20min，棄去沉淀，上清液用乙醇定容至25ml，得到樣品；

B、以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)；取無(wú)水葡萄糖加水制成每lml含0.12mg的葡萄糖溶液，以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。取葡萄糖溶液 0. 2、0. 4、0. 6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中，各加水至2.0ml,加入硫酸蔥酮溶液（稱取蔥酮或苯酚0.lg,加硫酸100ml使溶解，搖勻)6ml，搖勻，放置15分鐘后，置冰浴中冷卻5分鐘，取出，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法顯色，在 623nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5.27206x-0.00566，R2=0.99895。冰浴即具塞試管外再放置一大些的容器裝入裝入冰，起冷卻作用。

C、取1ml樣品蒸干，加水2ml，用硫酸-蒽酮或硫酸-苯酚法顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，測(cè)定吸光度為0.2849，根據(jù)測(cè)定的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對(duì)應(yīng)的樣品中無(wú)水葡萄糖的濃度；從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中無(wú)水葡萄糖的含量為0.0551mg/mL。

取上述供試品1ml，蒸干，加水至2ml，自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液 6ml”起，同法操作，測(cè)定吸光度為0.2849，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的含量為0.0551mg/mL。

D、根據(jù)以下方程計(jì)算得到樣品中多糖含量；根據(jù)以下方程計(jì)算得到摻有糊精的灰樹花多糖提取物中灰樹花多糖含量為34.22%。

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本檢測(cè)方法可以鑒別市面上常規(guī)的摻假及劣質(zhì)真菌多糖產(chǎn)品。

研究表明，許多真菌多糖主要為(1→3)糖苷鍵連接構(gòu)型，并伴有少量的1→6位支鏈鍵連接的結(jié)構(gòu)，真菌多糖是由D-葡萄糖單元通過(guò)β-( 1→3)糖苷鍵連接葡聚多糖，其主要構(gòu)型特征為(1→3)β-D-線性連接的骨架結(jié)構(gòu)。

纖維素酶（cellulase），EC 3.2.1.4，廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來(lái)自于真菌，比較典型的有木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬(Penicillium）。纖維素酶在食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對(duì)酒質(zhì)有所提升。

苔蘚酶（laminarinase），EC 3.2.1.6，EC 3.2.1.39。能特異性的作用于β型糖苷鍵，使真菌多糖分解為單糖。兩種酶的使用能很好的對(duì)真菌細(xì)胞壁產(chǎn)生作用，分解細(xì)胞壁。

上述實(shí)例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。在不脫離本發(fā)明上述思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和常規(guī)手段作出的各種 替換方式或變更，均包含在本發(fā)明之內(nèi)。