本發(fā)明涉及一種利用半自動(dòng)樣本處理液相色譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中多種水溶性維生素的方法，屬于維生素檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：維生素是機(jī)體維持正常代謝和機(jī)能所必須的一類低分子化合物，是人體七大營養(yǎng)要素之一，分為脂溶性和水溶性維生素兩類，人體內(nèi)維生素必須保持在一個(gè)合適的范圍才對(duì)人體有益，無論缺乏還是升高都會(huì)給人體帶來危害。維生素B1、B2、B6、B9、B12、維生素C、煙酸、煙酰胺均屬于水溶性維生素，人體缺乏該這些維生素時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的癥狀：B1缺乏易致腳氣病等，B2缺乏致脂溢性皮炎和口腔炎癥，B6缺乏易導(dǎo)致貧血，B9葉酸缺乏致胎兒神經(jīng)管畸形；B12缺乏致巨幼紅細(xì)胞性貧血；煙酰胺缺乏會(huì)導(dǎo)致食欲不振、記憶力減退、癡呆等。近年來，國內(nèi)外對(duì)維生素認(rèn)識(shí)的重要性在不斷提高，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，維生素在美國保健品市場(chǎng)占有主要份額。隨著國際維生素市場(chǎng)對(duì)中國乃至亞洲市場(chǎng)的不斷沖擊，以及國內(nèi)科研單位和企業(yè)在維生素行業(yè)取得的科研成果和技術(shù)突破，我國公民自身的保健意識(shí)不斷增強(qiáng)，隨著居民收入水平提高，人們開始補(bǔ)充各類維生素。但是，由于缺乏科學(xué)的指導(dǎo)，維生素產(chǎn)品的使用現(xiàn)狀很混亂，一些人群為了提高身體各項(xiàng)機(jī)能，不惜花重金在保健品上，盲目補(bǔ)充維生素，據(jù)2014年中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)調(diào)查顯示，中國居民由于營養(yǎng)過?；驙I養(yǎng)不均衡導(dǎo)致的疾病在逐年增多。如何了解人體是否需要補(bǔ)充所必需的水溶性維生素，只有通過檢測(cè)體內(nèi)各種維生素的真實(shí)狀態(tài)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果有針對(duì)性的調(diào)整需要的維生素，檢測(cè)是科學(xué)評(píng)估和個(gè)性化使用維生素唯一的依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種利用半自動(dòng)樣本處理液相色譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中多種水溶性維生素的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種利用半自動(dòng)樣本處理液相色譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中多種水溶性維生素的方法，采用HPLC方法，色譜條件為：流動(dòng)相A：0.5mol/L的磷酸二氫鉀溶液(在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀有利于提高分離度，使各種維生素能夠較好的分離)，流動(dòng)相B：甲醇，梯度洗脫；所述水溶性維生素選自維生素B1、B2、B6、B9、B12、維生素C、煙酸、煙酰胺中任意三種以上。所述血清，進(jìn)行以下前處理：先用甲醇或乙腈沉淀蛋白(優(yōu)選乙腈)，離心后取上清液，用半自動(dòng)固相萃取儀萃取(現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)設(shè)備)，洗脫液為：甲醇水溶液，對(duì)收集的柱后溶液進(jìn)行氮?dú)獯蹈芍梁线m體積，然后進(jìn)樣分析。進(jìn)一步地，色譜條件為：柱溫：30℃；色譜柱:WatersXBridgeC183.5um4.6*250mm；進(jìn)樣體積：20uL；梯度洗脫條件為：0-5minA:B＝90:10，5-7min過渡B為50％，7-12minA：B＝50:50,12-14min過渡B為30％，14-18minA：B＝70:30，18-22min過渡B為10％，如表1所示，流速：0.9mL/min；波長為260nm。表1梯度洗脫條件時(shí)間(分鐘)A％(體積百分?jǐn)?shù))B％(體積百分?jǐn)?shù))090105505075050125050147030187030229010優(yōu)選的，利用半自動(dòng)樣本處理液相色譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中多種水溶性維生素的方法，步驟如下：(1)樣品前處理：向血清樣本中加入等體積的乙腈，渦旋震蕩后離心，取上清液至半自動(dòng)固相萃取儀，用甲醇水溶液(甲醇水溶液的體積濃度為70％)洗脫；收集的柱后溶液進(jìn)行氮?dú)獯蹈?若洗脫液體積為2ml，則吹干至100ul)；進(jìn)行樣品前處理的有益效果是：通過該處理，有效的分離沉淀蛋白，去除雜質(zhì)，減少干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)可以最大程度的保留維生素，避免其分解或氧化，從而檢測(cè)出最真實(shí)的維生素含量，同時(shí)盡量避免了樣品處理過程中有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的危害；(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：以水配制100μg/mL各維生素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，然后用濃度為5％(單位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制備5個(gè)梯度(維生素B1：10、25、50、100、250ng/mL；維生素B2：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B6：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B9：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B12：50、100、250、500、1000pg/mL；煙酸：0.5、1、5、10、20μg/mL；煙酰胺：10、50、100、250、500ng/mL；維生素C：1、5、10、25、50μg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分裝于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫?3)HPLC檢測(cè)：將待測(cè)樣本通過梯度洗脫模式進(jìn)入色譜柱分離后，在260nm檢測(cè)波長下，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性(以各種維生素的相對(duì)保留時(shí)間作為定性依據(jù))與定量檢測(cè)(以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量)。進(jìn)一步地，進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程；將相應(yīng)維生素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計(jì)算血清樣品中多種水溶性維生素的濃度。本發(fā)明通過對(duì)樣本前處理方法和高效液相色譜條件的優(yōu)化(通過具體實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出通用的流動(dòng)相和流速梯度以及檢測(cè)波長，優(yōu)化血清的前處理方法，從而可以同時(shí)檢測(cè)出多種維生素)，建立了一種同時(shí)檢測(cè)血清中多種水溶性維生素的方法。采用本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)人血清中多種水溶性維生素B1、B2、B6、B9、B12、維生素C、煙酸、煙酰胺的含量，并進(jìn)行精確的定性和定量分析，是一種樣本處理簡(jiǎn)單、快速、通量高、結(jié)果可靠、低成本的檢測(cè)方法。本發(fā)明在樣品前處理過程引入自動(dòng)固相萃取技術(shù)，可以較多的去除雜質(zhì)，降低檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，且操作簡(jiǎn)單快捷。使用自動(dòng)化固相萃取設(shè)備，準(zhǔn)確地控制液體通過色譜柱的流速，這樣就能夠保證最后結(jié)果的重現(xiàn)性和實(shí)驗(yàn)效率，提高樣品處理的準(zhǔn)確性和效率。自動(dòng)化固相萃取系統(tǒng)將操作人員與有機(jī)溶劑的接觸幾率降到最低，使操作人員不再受有機(jī)溶劑的危害。本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測(cè)血清中多種水溶性維生素，特異性強(qiáng)，靈敏性高，通量高，操作簡(jiǎn)單，成本低(可以達(dá)到和質(zhì)譜檢測(cè)器相當(dāng)?shù)臋z測(cè)水平，但本發(fā)明的檢測(cè)成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于質(zhì)譜)，結(jié)果客觀易于分析，尤其適合臨床普及應(yīng)用?；谠摲椒ú粌H可以對(duì)營養(yǎng)性疾病患者進(jìn)行病因診斷，還可以對(duì)潛在的維生素缺乏者進(jìn)行用藥指導(dǎo)，減少盲目補(bǔ)充維生素的現(xiàn)象發(fā)生。附圖說明圖1：樣品1的色譜圖。圖2：樣品2的色譜圖。圖3：維生素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖4：維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖5：維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖6：維生素B9的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖7：維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖8：煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖9：煙酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。圖10：維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。實(shí)施例1利用半自動(dòng)樣本處理液相色譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中多種水溶性維生素步驟如下：(1)制備待測(cè)樣本：向血清樣本中加入等體積乙腈，渦旋震蕩后離心，取上清液至半自動(dòng)固相萃取儀中，進(jìn)行固相萃取操作，用2ml甲醇水溶液(體積濃度70％)洗脫，將得到的萃取液氮?dú)獯蹈芍?00ul，獲得待測(cè)樣本。本實(shí)施例制備了樣品1、樣品2兩份樣品。(2)高效液相色譜檢測(cè)：待測(cè)樣本通過梯度洗脫模式進(jìn)入色譜柱分離，在260nm檢測(cè)波長下，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性(以各種維生素的相對(duì)保留時(shí)間作為定性依據(jù))與定量檢測(cè)(以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量)，液相色譜條件如下：色譜柱:WatersXBridgeC183.5um4.6*250mm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20uL；流速：0.9mL/min；流動(dòng)相A：0.5mol/L的磷酸二氫鉀溶液；流動(dòng)相B：甲醇；檢測(cè)波長：260nm；梯度洗脫條件，如表1所示。(3)計(jì)算結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：以水配制100μg/mL各維生素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，然后用濃度為5％(單位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制備5個(gè)梯度(維生素B1：10、25、50、100、250ng/mL；維生素B2：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B6：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B9：1、5、10、25、50ng/mL；維生素B12：50、100、250、500、1000pg/mL；煙酸：0.5、1、5、10、20μg/mL；煙酰胺：10、50、100、250、500ng/mL；維生素C：1、5、10、25、50μg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分裝于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存?zhèn)溆?；?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為Y軸；進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程(如圖3～10所示)；將相應(yīng)維生素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計(jì)算血清樣品中多種水溶性維生素的濃度，結(jié)果如表2所示。定性結(jié)果如表3所示。表2多種水溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及濃度名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍樣品1濃度樣品2濃度維生素B110～250ng/mL38.6ng/mL85.3ng/mL維生素B21～50ng/mL16.9ng/mL8.6ng/mL維生素B61～50ng/mL7.5ng/mL14.9ng/mL維生素B91～50ng/mL11.3ng/mL8.7ng/mL維生素B1250～1000pg/mL356.9pg/mL788.2pg/mL煙酸0.5～20μg/mL8.5μg/mL13.3μg/mL煙酰胺10～500ng/mL126.2ng/mL187.9ng/mL維生素C1～50μg/mL9.8μg/mL16.5μg/mL表3多種水溶性維生素保留時(shí)間名稱保留時(shí)間(min)B14.2維生素C7.9B213.6B615.7B916.4B1218.6煙酸5.3煙酰胺6.6通過表2、表3可以看到，本發(fā)明的方法，可以同時(shí)檢測(cè)血清中多種水溶性維生素，特異性強(qiáng)，靈敏性高。當(dāng)前第1頁1 2 3