本發(fā)明涉及人血漿中細胞分子的定性和定量分析，具體的說是一種用于評價腫瘤免疫細胞療法的檢測標記物及其檢測方法和應用。

背景技術：

隨著腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴重，應對腫瘤的治療模式也發(fā)生著日新月異的變化，各種新藥物、新技術、新方法層出不窮。近年來，隨著對機體免疫系統(tǒng)認識的不斷深入及生物技術的迅速發(fā)展，免疫治療已成為腫瘤治療的重要手段，且在腫瘤綜合治療體系中占據(jù)著越來越重要的位置，是繼手術、放療和化療后發(fā)展的第四類腫瘤治療方法。癌癥是腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視系統(tǒng)的細胞疾病，機體免疫功能的缺陷是癌癥發(fā)生和發(fā)展的關鍵。機體的抗腫瘤免疫主要為T淋巴細胞所介導。細胞生物治療技術將自體免疫細胞經(jīng)體外誘導、分化、擴增再回輸至體內，繞過體內腫瘤免疫障礙機制，通過激發(fā)機體的免疫反應來對抗、抑制和殺滅癌細胞。

隨著腫瘤免疫治療基礎研究日益增多，越來越多的臨床試驗也相繼出現(xiàn)。但當腫瘤免疫治療進入臨床試驗階段后，以傳統(tǒng)的評價體系，如WHO或實體瘤療效評價標準(RECIST)去評價其療效，卻終未得到預期結果，部分進入Ⅲ期試驗的項目，也在隨機對照研究中宣告失敗。腫瘤免疫治療在臨床試驗中遭遇困境，使得國內外學者開始反思，套用傳統(tǒng)治療的療效評價體系去評價免疫治療，是否具有合理性和可行性。

對于傳統(tǒng)治療而言，常在治療結束后即對臨床療效進行評價。而與細胞毒藥物不同，免疫細胞治療常通過激活機體的免疫反應而產生抗腫瘤效應，這一過程(如活化T細胞、浸潤到腫瘤局部、產生臨床可測量的抗腫瘤效應)往往需數(shù)月甚至更長的時間。與化療追求近期出現(xiàn)完全緩解(CR)或部分緩解(PR)等反應不同，患者受益于免疫治療的表現(xiàn)常為生存期或SD時間延長、生活質量改善等，這也符合現(xiàn)代腫瘤治療理念，即從“除惡務盡”轉變?yōu)椤皫Я錾妗?。在免疫治療臨床試驗中，有些患者最初表現(xiàn)為疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進展(PD)或混合反應(MR)，一段時間后才出現(xiàn)腫瘤縮小等反應。因此，免疫治療療效評價完全不同于細胞毒類藥物，不僅需要更多的評價指標，還須觀察更長的時間，這就需要對傳統(tǒng)的療效評價體系進行修改或建立新的評價體系。目前在免疫治療反應監(jiān)測方面的突出問題是，不同實驗室間檢測結果有較大差異，尤其在多中心研究中，影響了數(shù)據(jù)的可重復性和可比性。缺少可作為金標準的質量控制方法，這也制約了免疫治療的研究與臨床應用。與傳統(tǒng)治療(如化療等)直接作用于腫瘤本身不同，免疫細胞治療可直接殺傷腫瘤，更重要的是，其通過作用于機體免疫系統(tǒng)，改善機體免疫應答，最終影響患者生存期。其發(fā)揮作用主要通過3步：①治療后即出現(xiàn)免疫細胞活化和T細胞增殖；②活化的免疫細胞介導臨床可測量的抗腫瘤效應(常在治療后數(shù)周或數(shù)月產生)；③一般在首次治療后數(shù)月才對患者生存期產生影響。正是基于這些特點，傳統(tǒng)WHO或RECIST標準并不完全適于免疫治療療效評價，除傳統(tǒng)指標外，免疫反應也應被納入免疫治療的療效評價體系。評價免疫治療后機體的免疫反應對科學評價其療效具有重要意義。

綜上，對腫瘤免疫細胞治療進行臨床療效的評價，是該領域研究者必須面對的一個新課題，而建立科學的評價體系，對腫瘤免疫治療的發(fā)展和臨床應用具有重要意義?，F(xiàn)急需尋找可用于建立腫瘤免疫生物治療臨床評價標準的檢測標志物。

技術實現(xiàn)要素：

為填補免疫治療臨床評價無統(tǒng)一標準的空白，建立直觀有效的評價標準，提供一種用于腫瘤免疫細胞治療療效評價的檢測標記物及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明發(fā)明采用技術方案為：

一種用于評價腫瘤免疫細胞療法的檢測標記物，用于評價腫瘤免疫療法的檢測標記物為細胞因子中的一種或幾種的組合。

所述細胞因子為二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)、生長分化因子-15(GDF-15)、生長激素(GH)、巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細胞細胞蛋白3β(MIP-3β)、生長刺激表達基因2蛋白(ST2)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的受體蛋白(Upar)、糖基化終末產物受體(RAGE)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介-4(IL-4)、骨橋蛋白(OPN)、髓過氧化物酶(MPO)中的一種或幾種的組合。

CD26是一種高度保守、分布于多種細胞的Ⅱ型跨膜糖蛋白。目前其三級結構已清楚。最初因發(fā)現(xiàn)它具有蛋白水解作用，故又稱二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)。DPPIV的天然底物多種多樣，在體內執(zhí)行多種重要功能。它還是細胞膜受體和共刺激分子，從而參與機體的免疫調節(jié)、細胞移行、細胞黏附和細胞調亡過程，故與多種疾病的發(fā)病有關。各種CD26抑制劑對自身免疫性疾病及細胞增殖性疾病的治療具有重要意義。生長分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員的一個遠支，是一個重要的心血管保護因子，作為新的標記物，GDF-15水平與多種心血管疾病的診斷、危險分層和預后判斷有密切關系。

生長激素(Growth Hormone,GH)是一種肽類激素,其結構為一百九十一單鏈肽，含有191個氨基酸分子，由垂體中的生長激素細胞合成、存儲和分泌。生長激素主要生理作用是對人體各種組織尤其是蛋白質有促進合成作用，能刺激骨關節(jié)軟骨和骨骺軟骨生長，因而能增高。人體一旦缺乏生長激素就導致生長停滯。

巨噬細胞炎癥蛋白3α(Macrophage inflammatory protein 3-α,MIP-3α),是趨化因子(Chemokine)超家族成員。主要由表皮細胞或粘膜上皮細胞分泌的一類CC族趨化因子,特異性趨化郎格罕細胞(Langerhans Cells,LC)向表皮或粘膜上皮遷移。已知LC是皮膚中最重要的抗原遞呈細胞,決定了皮膚組織的免疫反應特征,是異體皮膚移植后發(fā)生免疫排斥的主要原因；同時MIP-3α也具有趨化未成熟樹突狀細胞(DC)和淋巴細胞的功能，在炎癥和腫瘤發(fā)生中起重要作用。

巨噬細胞炎性蛋白3β(macrophage inflammatory protein,MIP-3α)，屬趨化因子CC亞家族，其受體為多種CC趨化因子受體(CCR)。能激活粒細胞，調節(jié)CD8⁺T細胞與血管內皮細胞黏附，參與造血調控，誘導NK細胞增殖與活化。

生長刺激表達基因2蛋白(ST2)，是白介素I受體家族的成員，在免疫和炎癥反應中起到關鍵的作用。ST2有兩種形式：可溶性ST2和跨膜形式的ST2，2002年發(fā)現(xiàn)ST2在心臟上的功能，ST2檢測結果不受腎功能影響，ST2蛋白與受到損傷后的纖維化反應有直接關聯(lián)性。

uPAR是尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA)的受體，該體系在介導基質蛋白降解過程中起重要作用。uPAR是一個富含半胱氨酸的單鏈多糖基化蛋白。uPAR在許多正常組織和腫瘤組織均有表達。uPAR可使uPA激活并定位于細胞表面,提供在細胞與細胞之間及細胞與基質連接處的uPAR結合的位點,為表達uPAR的腫瘤細胞提供uPA介導的蛋白質水解的有利環(huán)境。uPA只有與細胞膜表面的uPAR特異性的結合才能發(fā)揮其激活纖溶酶的作用。故uPAR是uPA介導的激活反應的關鍵。uPAR存在于體內多種正常細胞膜上,如成熟中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、血管內皮細胞及活化的T細胞等。uPAR在胃腸道癌、膀胱癌等上皮性惡性腫瘤中高表達。uPAR通過與uPA結合提供細胞局部纖溶功能,介導細胞內信號轉導,進而影響細胞的增殖、趨化、粘附、遷移等。uPA、uPAR在人類各種惡性腫瘤組織中的表達水平遠遠高于其相應的正常組織。研究發(fā)現(xiàn)，uPA在腫瘤浸潤中發(fā)揮重要作用。用原位雜交及免疫組化等方法研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤組織uPA及uPAR高表達,且uPA及uPAR表達愈高,患者預后愈差,生存期愈短。

糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)為免疫球蛋白超家族的新成員。RAGE在體內分布非常廣泛，可在多種細胞表面上表達。RAGE的配體有晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)、β淀粉樣蛋白(amyloid-βprotein，Aβ)、神經(jīng)軸突生長因子、S100/鈣粒蛋白及甲狀腺運載蛋白等。越來越多的生物學證據(jù)表明，RAGE可以通過獨特機制啟動或加速動脈粥樣硬化損傷。

α腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，并參與正常炎癥反應和免疫反應。α腫瘤壞死因子在許多病理狀態(tài)下產生增多，包括敗血癥、惡性腫瘤、心臟衰竭和慢性炎性疾病。

白介-4(IL-4)是一種主要由T細胞分泌的具有多種生物學活性的細胞因子。它能促進B細胞的生長、分化和增殖,誘導B細胞產生IgE、IgM及IgG等,并能加強MHCI類抗原和IL一受體在靜息B細胞上的表達；它也能促進T細胞的增殖并輔助誘導CTL毒性的產生；對單核巨噬細胞抗腫瘤及產生細胞因子的活性有重要影響。

骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種帶負電的非膠原性骨基質糖蛋白,OPN由多種組織細胞合成與分泌,廣泛的分布于多種組織和細胞中。①細胞粘附OPN通過依賴RGD序列(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ1、α8β1)和非依賴RGD序列(α4β1、α9β1)結合存在于細胞表面上的多種整合素受體,起細胞粘附作用。OPN能粘附轉化的JB6細胞和HL60細胞(αvβ5和α4β1受體)，且OPN以非RGD形式結合轉化的成纖維細胞,凝血酶斷裂的OPN能增強OPN與APP活化和佛波酯活化的血小板和B淋巴細胞的粘附以及T細胞的粘附。②細胞募集在體外OPN是一種化學趨化劑,外源性OPN以劑量依賴性方式(5.0～40mg/L)指導成纖維細胞的遷移；它能刺激大鼠和牛平滑肌細胞的遷移,能支持粘附到人和小鼠T細胞,在體內皮下注射OPN后,在注射部位附近,OPN可以直接地誘導趨化作用并間接協(xié)助M向其它趨化劑移動。此外OPN還能促進破骨細胞和B細胞的趨化作用。③細胞因子表達OPN加強Th1并抑制Th2細胞因子的表達,它通過LPS刺激直接誘導產生IL-12,抑制IL-10的表達。對IL-12的作用是依賴OPN磷酸化。OPN可以使早期Th1細胞因子應答極化。OPN還協(xié)同刺激人T細胞增殖并促進人單個核細胞表達Th1細胞因子。關節(jié)內OPN作為產生IL-1、NO和PGE2的一種固有的抑制劑。④信號轉導骨橋蛋白作為一種基質功能性非膠原蛋白,主要通過兩種機制發(fā)揮細胞信號分子的作用。一是以分子內RGD基元與整合蛋白(integrin)家族分子結合；二是與細胞表面粘附性糖蛋白CD44以非RGD依賴方式結合。兩種作用方式均通過激活細胞內特異性信號傳導系統(tǒng)而介導細胞粘附、遷移和增殖。OPN與整合素受體結合后啟動信號轉導級聯(lián)反應，促進基因表達的改變，并誘導NF-КB活性，OPN能誘導骨骼蛋白的粘附斑激酶(FAK)和樁蛋白(Paxillin)的磷酸化改變,還能影響胞內Ca2⁺濃度。⑤腫瘤發(fā)生和轉移基質來源的腫瘤,通常與OPN表達增強有關，OPN的過分表達與人胃癌進展有關。OPN通過刺激細胞信號轉導促進腫瘤惡性發(fā)展并能加強轉移性細胞的生存。OPN作為前列腺癌的生長和發(fā)展的旁分泌和自分泌的調節(jié)劑,重組OPN通過結合H因子,能使這些腫瘤細胞生存下來。⑥礦化作用OPN含有與細胞外基質的礦物質表面相互作用的酸性結構域。OPN能抑制培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的鈣化作用。⑦細胞免疫OPN敲除后小鼠存在Th1介導的免疫缺陷,角膜感染HSV-1后，OPN敲除的小鼠不能對HSV表現(xiàn)遲發(fā)超敏反應，也沒有發(fā)生HSV伴隨的角膜炎，編碼OPN基因與小鼠抗立克次氏體基因(RicR)鄰近，引起OPN早期缺陷的RicR等位基因與立克次氏體感染有關，而高水平表達的OPN的小鼠對立克次氏體病有抵抗力,OPN在Th1細胞介導的肉芽腫的形成中起重要作用。⑧其他它能引起單核細胞分化；加速血管生成；參與組織重建，如骨吸收、血管生成和創(chuàng)口愈合等；誘導尿激酶型纖溶酶原激活劑(UPA)的表達；抑制內皮細胞的凋亡；通過LPS和IFN-γ抑制腎小管上皮細胞的誘導型NO合酶(iNOS)的活性；OPN是小鼠M的INOS的一種負反饋調節(jié)劑。它還與動脈粥樣硬化，自身免疫性疾病和其它炎癥性疾病(肺纖維化)有關。

髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一。MPO可作為冠心病的預測因子和急性冠脈綜合征預后判斷指標：MPO升高提示患者存在冠狀動脈炎癥，斑塊不穩(wěn)定，但血管未完全堵塞，并未引起心肌壞死，所以MPO可早期識別不穩(wěn)定斑塊，是ACS早期診斷的炎癥標記物之一。

一種用于評價腫瘤免疫細胞療法的檢測標記物的檢測方法：

(1)通過用于檢測血漿細胞分子的蛋白芯片測定待檢測樣品中細胞分子檢測標記物的變化；

(2)通過上述獲得待檢測樣品中細胞分子檢測標記物的變化，進而確定待檢測樣品的免疫狀態(tài)。

所述蛋白芯片檢測方法包括以下步驟：

⑴樣品準備；

⑵蛋白芯片的準備；

⑶蛋白芯片封閉、孵育、清洗；

⑷與生物素化混合抗體孵育、清洗；

⑸與鏈霉親和素-HRP孵育、清洗；

⑹芯片檢測和數(shù)據(jù)分析。

所述標記物為二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)、生長分化因子-15(GDF-15)、生長激素(GH)、巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細胞炎性蛋白3β(MIP-3β)、生長刺激表達基因2蛋白(ST2)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的受體蛋白(Upar)、糖基化終末產物受體(RAGE)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介-4(IL-4)、骨橋蛋白(OPN)、髓過氧化物酶(MPO)中的一種或幾種的組合。

具體檢測方法：

第一步、取接受腫瘤免疫治療后有效與惡化的樣本

在大量接受腫瘤免疫治療的樣本中取連續(xù)治療六個療程以上的樣本，在其中取出臨床反饋有效的樣本與接受腫瘤免疫治療后死亡的樣本，分別為有效組與惡化組。挑選這些樣本每次腫瘤免疫治療前的血漿。同時以正常人外周血分離血漿作為對照。

第二步、蛋白芯片的準備

提前20-30分鐘從試劑盒子里取出芯片平衡至室溫。從密封的塑料袋中取出芯片，剝下蓋膜，并讓它空氣干燥1-2小時。第三步、蛋白芯片封閉、孵育、清洗

每孔添加100μL樣品稀釋液于室溫孵育30分鐘，以封閉芯片。完全移除樣品稀釋液，每孔添加100μL樣品，室溫孵育1-2小時。將樣品從每孔中移除，150μL/孔用1×洗滌緩沖液洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動。在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。第四步、與生物素化混合抗體孵育、清洗

加入1.4mL樣品稀釋液復溶生物素化混合抗體，充分混合溶解。每孔添加80μl混合抗體溶液，于室溫孵育1-2小時。將樣品從每孔中移除，150μL/孔用1×洗滌緩沖液洗5次(每次5分鐘)。每次清洗需在室溫下輕輕晃動，在每個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

第五步、與鏈霉親和素-HRP孵育、清洗

加入1.4mL樣品稀釋液復溶鏈霉親和素-HRP，充分混合溶解。每孔添加80μl鏈霉親和素-HRP，在室溫下避光孵育1小時。將樣品從每孔中移除，150μL/孔用1×洗滌緩沖液洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動，在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

第六步、芯片檢測、數(shù)據(jù)分析

小心地從墊片中拆下芯片。將芯片放入清洗器/干燥器中，加入足夠的洗滌緩沖液以覆蓋整個芯片，然后在室溫下輕輕晃動15分鐘。把洗滌緩沖液完全移除。干燥芯片。使用激光掃描儀掃描芯片，提取數(shù)據(jù)進行分析。

一種細胞因子的應用，所述細胞因子在用于評價腫瘤免疫療法的檢測標記物中的應用。

所述細胞因子為二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)、生長分化因子-15(GDF-15)、生長激素(GH)、巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細胞炎性蛋白3β(MIP-3β)、生長刺激表達基因2蛋白(ST2)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的受體蛋白(Upar)、糖基化終末產物受體(RAGE)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介-4(IL-4)、骨橋蛋白(OPN)、髓過氧化物酶(MPO)中的一種或幾種的組合。

本發(fā)明具有的優(yōu)點及積極效果是：本發(fā)明利用人細胞因子蛋白芯片篩選出12種特殊的在人體血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的人細胞因子組合作為評價腫瘤免疫細胞治療療效的檢測標記物，這12種因子可以較敏感的反映出對腫瘤免疫細胞治療受益度的程度，具有靈敏度高、檢測速度快、取材方便、樣本易存放(血漿-20℃存放即可)等優(yōu)點，該檢測標記物及其組合檢測的是一組多個相關細胞因子，將克服單一標記物因個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高臨床免疫細胞治療評價的準確性。該檢測標記物及其檢測方法可用于在體外判斷腫瘤免疫細胞治療的效果，預測及評價腫瘤免疫細胞治療的療效，分析腫瘤免疫細胞療法的受益程度，可作為建立腫瘤免疫細胞療法臨床評價標準的檢測標志物，建立免疫細胞治療臨床評價的新標準。

附圖說明

圖1為健康組血漿1中細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖2為健康組血漿2中細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖3為健康組血漿3中細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖

圖4為有效組樣本A血漿腫瘤免疫治療前細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖5為有效組樣本A血漿腫瘤免疫治療四個療程時細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖6為有效組樣本A血漿腫瘤免疫治療八個療程時細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖7為惡化組樣本a血漿腫瘤免疫治療前細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖8為惡化組樣本a血漿腫瘤免疫治療四個療程時細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖；

圖9為惡化組樣本a血漿腫瘤免疫治療八個療程時細胞因子蛋白芯片檢測掃描圖。

具體實施方式

目前對疾病進行臨床診斷的傳統(tǒng)生物化學及分子生物學技術還比較繁瑣和粗糙。近年來發(fā)展起來的新型技術有基因芯片和蛋白質(抗體)芯片技術等。人體內特別是血漿中含有數(shù)以萬計的蛋白和多肽片斷，它們濃度分布廣，明確報道的蛋白很少，定量化的就更少了。細胞分子是目前研究比較多的一類分子，在這些明確與免疫相關的細胞分子中找尋與腫瘤免疫治療有密切關聯(lián)的特定的細胞分子，并了解其在腫瘤免疫治療過程中的變化是十分有意義的工作，細胞因子蛋白檢測技術可以快速地高通量地分析血漿樣品中細胞分子的組成及含量，臨床適用性極強。由于器官組織的生理狀態(tài)變化會引起血漿中細胞分子含量的改變，蛋白質芯片能夠檢測生物樣品中與腫瘤免疫細胞治療療效相關的全部蛋白質的含量情況，即表型指紋(phenomic fingerprint)。表型指紋對監(jiān)測腫瘤免疫治療的過程，或預測判斷治療的效果具有重要意義。

本發(fā)明可以通過常規(guī)體檢中收集血液，由于血液會循環(huán)至全身所有組織，并向細胞輸送營養(yǎng)并清除廢物，因此血液能夠反映出整個機體的生理病理狀況，其檢測結果對人體健康具有指導意義。已知血漿中存在著多種蛋白，包括幾百種細胞分子，其在一定程度上反應機體的免疫變化。檢測上百種細胞分子，對照比較篩選能反應腫瘤免疫細胞治療療效的特定細胞分子，進而作為檢測標記物。

以下結合附圖對本發(fā)明作進一步描述，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，其并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離于本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方式。

實施例1：

血漿中細胞因子的蛋白芯片檢測實驗，本實施例使用R&D Systems公司Proteome Profiler^TM Human XL Cytokine Array Kit，具體操作步驟如下：

步驟一.樣本及芯片預處理

1.從經(jīng)腫瘤免疫細胞治療后的血漿樣本中取連續(xù)治療六個療程以上的樣品，在其中取出臨床反饋有效或病灶減小的樣本20個作為有效組，同時取出接受腫瘤免疫細胞治療后死亡的樣本20個作為惡化組。并準備上述兩組不同的樣本接受腫瘤免疫細胞治療前的凍存血漿樣品、接受腫瘤免疫細胞治療四個療程時的凍存血漿樣品與接受腫瘤免疫細胞治療八個療程時的凍存血漿樣品。同時以20個健康血漿樣本的凍存血漿作為對照。將各自凍存血漿于37℃快速融化，2100×g離心10min去除懸浮物，各血漿即為待測樣品。

2.提前20-30分鐘從試劑盒里取出(芯片)Human XL Cytokine Array nitrocellulose membranes平衡至室溫。從密封的塑料袋中取出Human XL Cytokine Array nitrocellulose membranes，剝下蓋膜，并讓它空氣干燥1-2小時。步驟二.蛋白芯片的封閉、孵育、清洗

1.每孔添加100μL Array Buffer于室溫孵育30分鐘，以封閉芯片。

2.移除Array Buffer，每孔添加100μL步驟一第1步中準備的待檢測樣品，室溫孵育1-2小時。

3.用無菌水將25×Wash Buffer Concentrate稀釋25倍，即為1×洗滌緩沖液，備用。4.將上步中所加的檢測樣品從每孔中移除，以150μL/孔的量用1×洗滌緩沖液洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動。在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟三.與生物素化混合抗體孵育、清洗

1.用1.4mL Array Buffer復溶Human XL Cytokine Array Detection Antibody Cocktail，充分混合溶解。

2.每孔添加80μl步驟三第1步制備的混合溶液，于室溫孵育1-2小時。

3.將樣品從每孔中移除，用1×洗滌緩沖液150μL/孔洗5次(每次5分鐘)。每次清洗需在室溫下輕輕晃動，在每個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟四.與鏈霉親和素-HRP孵育、清洗

1.用1.4mL Array Buffer復溶Streptavidin-HRP，充分混合溶解。

2.每孔添加80μl步驟四第1步制備的混合溶液，在室溫下避光孵育1小時。

3.將樣品從每孔中移除，用1×洗滌緩沖液150μL/孔洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動，在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟五.芯片檢測

1.小心地從墊片中拆下芯片。

2.將芯片放入洗器/干燥器中，加入足夠的洗滌緩沖液以覆蓋整個芯片(約30mL)，然后在室溫下輕輕晃動15分鐘。把洗滌緩沖液完全移除。完全去除液體，干燥芯片。使用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀掃描檢測有效患者腫瘤治療前血漿樣品的芯片，得到該芯片掃描圖(見圖4)。

步驟六.數(shù)據(jù)獲取

1.采用采用LuxScan3.0圖像分析軟件對圖4的芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號(檢測的因子含量)，即通過掃描芯片上的各點分析軟件可以直接顯示各因子含量(見表1)。其他各個檢測的樣本操作同此。

表1 (單位：灰度)

2.最后用統(tǒng)計分析挑選差異表達的細胞因子

2.1.健康組組蛋白分析

對健康組的數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析，結果顯示Sig小于0.05，說明健康組之間存在差異性明顯的蛋白，需要進行進一步的統(tǒng)計分析。對健康組的每個樣本進行兩次實驗，將兩次實驗進行配對T檢驗，得出有差異性的蛋白14個，在正常組中將這14個有差異性的蛋白剔除后，對健康組數(shù)據(jù)再次進行單因素方差分析，結果發(fā)現(xiàn)Sig為0.052大于0.05，說明其余的數(shù)據(jù)沒有明顯差異即沒有區(qū)別。

2.2.惡化組蛋白分析

對于惡化組，分別檢測每個樣本接受腫瘤免疫細胞治療前、治療四個療程時與八個療程時的凍存血漿樣本3個治療時間點的樣本，考慮它們之間的差異性利用有重復測量的方差分析，結果顯示每個樣本時間對應的Sig都小于0.05，說明每個樣本3個治療時間點的樣本是有區(qū)別的。

2.2.1惡化組3個治療時間點分別做差異性蛋白分析

對惡化組的數(shù)據(jù)，按照治療時間點的不同分別做配對T檢驗，找出差異蛋白，刪除惡化組數(shù)據(jù)中3個治療時間點檢測對應的差異蛋白數(shù)據(jù)，一共刪除的差異蛋白30個。

2.2.2惡化組剔除差異性蛋白后的分析

將剩下80個蛋白數(shù)據(jù)的惡化組進行單因素方差分析，結果顯示P值都大于0.05，說明惡化組進行數(shù)據(jù)的刪除后，剩下的數(shù)據(jù)，每個樣本同次檢測間沒有差異性即沒有區(qū)別。進一步討論每個樣本3個治療時間點檢測的差異性，做有重復的單因素方差分析，結果顯示每個樣本每次測量間的Sig都小于0.05，說明每個樣本3個治療時間點檢測的差異性顯著即每個樣本3個治療時間點檢測的數(shù)據(jù)是有區(qū)別的。

2.3有效組蛋白分析

對于有效組組，分別檢測每個樣本接受腫瘤免疫細胞治療前、治療四個療程時與八個療程時的凍存血漿樣本3個治療時間點的樣本，考慮它們之間的差異性利用有重復測量的方差分析，結果顯示每個樣本時間對應的Sig小于0.05，說明每個樣本3個治療時間點的樣本是有區(qū)別的。

2.3.1有效組3個治療時間點分別差異性蛋白分析

對有效組的數(shù)據(jù)，按照治療時間點的不同分別做配對T檢驗，找出差異蛋白，刪除有效組組數(shù)據(jù)中3個治療時間點檢測對應的差異蛋白數(shù)據(jù)，一共刪除的差異蛋白13個。

2.3.2有效組剔除差異性蛋白后分析

將剔除后的有效組數(shù)據(jù)在不同治療點時間點做有重復測量單因素方差分析，結果顯示時間的Sig小于0.05，說明有效組在治療時間點與治療時間點之間有顯著差異即有效組的樣本不同治療時間點測得的數(shù)據(jù)是有區(qū)別的。

2.4.惡化組和有效組比較

對惡化組刪除差異蛋白后的數(shù)據(jù)與有效組刪除差異蛋白后的數(shù)據(jù)進行比較有重復的雙因素方差分析，惡化組和有效組的Sig小于0.05，說明有效組和惡化組之間是有差別的即有效組和惡化組的數(shù)據(jù)之間是有區(qū)別的。

2.5.進一步對比分析

2.5.1正常組和惡化組蛋白分析

進一步對健康組、惡化組和有效組中的共同標志性蛋白進行分析，將正常組共同標志性蛋白檢測的平均值與惡化組第三個治療時間點檢測的每個蛋白數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，發(fā)現(xiàn)存在差異性的蛋白15個，說明這些蛋白是正常組和惡化組共同的有區(qū)別的標志性蛋白。

2.5.2惡化組和有效組蛋白分析

將惡化組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)分別與有效組第一個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)、有效組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，分析發(fā)現(xiàn)惡化組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)與有效組第一個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)進行比較發(fā)現(xiàn)差異性蛋白48個；惡化組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)與有效組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)進行比較發(fā)現(xiàn)差異性蛋白32個。綜合比較發(fā)現(xiàn)惡化組第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)與有效組第一個、第三個治療時間點檢測的蛋白數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)共同的差異性蛋白28個，這些蛋白是惡化組和有效組共同的有區(qū)別的標志性蛋白，在惡化組和有效組存在明顯差異性。

綜合比較15個惡化時差異表達蛋白和28個治療有效時表達蛋白發(fā)現(xiàn)，二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)、生長分化因子-15(GDF-15)、生長激素(GH)、巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細胞炎性蛋白3β(MIP-3β)、生長刺激表達基因2蛋白(ST2)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的受體蛋白(Upar)、糖基化終末產物受體(RAGE)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介-4(IL-4)、骨橋蛋白(OPN)、髓過氧化物酶(MPO)共12個細胞因子蛋白是二者共有的，說明這12種細胞因子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極其密切的關系。通過腫瘤免疫細胞治療后除二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)與治療無效呈負相關外，其他11種細胞因子與腫瘤免疫細胞治療的惡化呈正相關，而對腫瘤免疫細胞治療反應良好的樣本則無此規(guī)律。有效組樣本檢測數(shù)據(jù)中這12種細胞因子的含量會隨著療程數(shù)增加而接近健康血漿中的平均數(shù)?？梢哉f通過這12種細胞因子在血漿中含量變化能反映與腫瘤免疫細胞治療的臨床效果。

實施例2：

為進一步驗證篩選出12種細胞因子表達量變化能反應腫瘤免疫細胞治療療效，使用h公司Proteome Profiler^TM Human XL Cytokine Array Kit，做驗證。具體操作步驟如下：

步驟一.樣本及芯片預處理

1.準備腫瘤免疫細胞治療后死亡的樣本以及該樣本每次腫瘤免疫細胞治療前的凍存血漿樣品。將凍存血漿37℃快速融化，2100×g離心10min去除懸浮物，各血漿樣品即為待測樣品。

2.提前20-30分鐘從盒子里取出Human XL Cytokine Array nitrocellulose membranes平衡至室溫。從密封的塑料袋中取出Human XL Cytokine Array nitrocellulose membranes，剝下蓋膜，并讓它空氣干燥1-2小時。

步驟二.蛋白芯片的封閉、孵育、清洗

1.每孔添加100μL Array Buffer于室溫孵育30分鐘，以封閉芯片。

2.移除Array Buffer，每孔添加100μL步驟一第1步中準備的待檢測樣品，室溫孵育1-2小時。

3.用無菌水將25×Wash Buffer稀釋25倍，即為1×洗滌緩沖液，備用。

4.將上步中所加的檢測樣品從每孔中移除，以用150μL/孔的量用1×洗滌緩沖液洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動。在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟三.與生物素化混合抗體孵育、清洗

1.用1.4mL Array Buffer復溶Human XL Cytokine Array Detection Antibody Cocktail，充分混合溶解。

2.每孔添加80μl步驟三第1步中制備的混合溶液，于室溫孵育1-2小時。

3.將樣品從每孔中移除，用1×洗滌緩沖液150μL/孔洗5次(每次5分鐘)，每次清洗需在室溫下輕輕晃動，在每個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟四.與鏈霉親和素-HRP孵育、清洗

1.用1.4mL Array Buffer復溶Streptavidin-HRP，充分混合溶解。

2.每孔添加80μl步驟四第1步中制備的混合溶液，在室溫下避光孵育1小時。

3.將樣品從每孔中移除，用1×洗滌緩沖液150μL/孔洗5次(每次5分鐘)，在室溫下輕輕晃動，在每一個洗滌步驟中完全去除洗滌緩沖液。

步驟五.芯片檢測與數(shù)據(jù)獲取

1.小心地從墊片中拆下芯片。

2.將芯片放入洗器/干燥器中，加入足夠的洗滌緩沖液以覆蓋整個芯片(約30mL)，然后在室溫下輕輕晃動15分鐘。把洗滌緩沖液Ι完全移除。完全去除液體，干燥芯片。使用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀掃描檢測該惡化組樣本接受腫瘤免疫治療第八個療程時血漿樣品的檢測芯片，得到該芯片掃描圖(見圖9)。

3.采用采用LuxScan3.0圖像分析軟件對圖9的芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號，即通過掃描芯片上的各點分析軟件可以直接顯示各因子含量(見表2)。

表2 (單位：灰度)

其他各個療程時血漿樣品檢測芯片操作同此。

步驟六.數(shù)據(jù)分析

比較該樣本接受腫瘤免疫細胞治療不同療程時血漿樣品檢測芯片得到的數(shù)據(jù)，挑選出各個芯片中12種已篩選出的細胞分子，對這些數(shù)據(jù)橫向比較分析，結果證明其變化趨勢符合本發(fā)明內容，即除二肽肽酶Ⅳ(DPPIV)與治療無效呈負相關外，其他11種細胞因子與腫瘤免疫治療的惡化呈正相關。進一步證明這12種細胞因子中的一種或幾種的組合可以作為用于腫瘤免疫細胞治療療效評價的檢測標記物。

圖1-3是健康組血漿中細胞因子的檢測結果，圖4-6是有效組血漿中細胞因子的檢測結果，圖7-9是惡化組血漿中細胞因子的檢測結果，圖中每一點代表一種細胞分子，其顏色的深淺代表該因子含量的多少。從掃描圖可以看出并非全部細胞因子在樣品中都有高豐度表達，有些細胞因子在樣品中是很微量的，甚至不能正常檢測到。圖1-3的結果顯示健康血漿中某些細胞因子是穩(wěn)定存在且含量相近的。圖4-6與圖7-9結果顯示在好轉與惡化過程中某些因子的含量的確發(fā)生較明顯的改變。根據(jù)統(tǒng)計學分析篩選出這些較明顯的反映出腫瘤免疫細胞療法治療效果的12個細胞因子。由此可以看出，本發(fā)明提供的檢測標記物及其組合具有較高的含量及較敏感的反應腫瘤免疫細胞療法治療效果能力，提供的檢測該標記物的方法具有高通量、高靈敏度的特點。