背景技術(shù)：
中藥特征圖譜是指某種或某幾種中藥材中所共有的，具有特征性的某類成分的色譜或光譜的圖譜。目前，特征圖譜已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效手段，是當(dāng)前中藥界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，近年來(lái)，人們已經(jīng)逐步認(rèn)識(shí)到，只針對(duì)某一化學(xué)成分而形成的質(zhì)量控制方法，已經(jīng)不能恰當(dāng)?shù)姆从持兴幍膬?nèi)在質(zhì)量，為了能夠更好的控制產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量，加強(qiáng)產(chǎn)品的真實(shí)性與有效性。目前，對(duì)益腎安神口服液的質(zhì)量控制，主要是通過(guò)枸杞子、石菖蒲、五味子、遠(yuǎn)志藥材的薄層鑒別以及對(duì)五味子中五味子醇甲的含量的控制，上述方法雖能在一定程度上檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量，但無(wú)法全面的反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，為彌補(bǔ)其不足，使其質(zhì)量控制技術(shù)更加完善、科學(xué)，對(duì)其今后的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供一種可利用的質(zhì)量控制模式。構(gòu)建益腎安神口服液HPLC特征圖譜，從整體上更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，為藥品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了有效保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種益腎安神藥物的特征圖譜構(gòu)建方法以及標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，該方法采用高效液相色譜法對(duì)益腎安神口服液的多種指標(biāo)性成分進(jìn)行測(cè)定，獲得特征圖譜；并應(yīng)用益腎安神口服液特征圖譜的構(gòu)建方法建立益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜。本發(fā)明中所述的益腎安神口服液由熟地黃、巴戟天、枸杞子、遠(yuǎn)志、山藥、山茱萸、石菖蒲、肉蓯蓉、牛膝、五味子、杜仲、小茴香、楮實(shí)子、續(xù)斷、大棗15味藥材經(jīng)過(guò)特有方法加工，加入輔料制備而成。

本發(fā)明的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟：

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液。

（2）供試品溶液的制備：取供試品溶液1ml置10ml容量瓶中，加3～5ml的濃度為10～100％甲醇，超聲3～10分鐘，取出，放冷，用同種溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取連續(xù)濾液，即得。

（3）色譜條件為：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）或Wonda Cract ODS-2（5μm，4.6×250mm）柱或Thermo Syncronis C18（5μm，4.6×250mm）柱，流動(dòng)相由A相和B相組成，A相為乙腈，B相為0.05～0.15%的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5～1. 5ml/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為200～260nm，柱溫為30～40℃，理論塔板數(shù)按照五味子醇甲峰計(jì)算不低于6000。

（4）測(cè)定：分別精密吸取上述兩種溶液5～20μl注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘的圖譜，用指紋圖譜軟件進(jìn)行處理，即得益腎安神口服液特征圖譜。

優(yōu)選的，本發(fā)明的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟：

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含49.5μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：取供試品溶液1ml置10ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5分鐘，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）柱為色譜柱，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0ml/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μl，理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

（4）測(cè)定：精密吸取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，得到益腎安神口服液的特征圖譜。

優(yōu)先的，梯度洗脫的時(shí)間及流動(dòng)相比例為：0～10分鐘，A相：5～40%、B相：95～60%；10～35分鐘，A相：40～70%、B相：60～30%；35～60分鐘，A相：70～100%、B相：30～0%；

上述所得益腎安神口服液特征圖譜中，確定有10個(gè)共有峰。

本發(fā)明是通過(guò)多批次樣品進(jìn)行試驗(yàn)研究，建立了益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜，能較好地保證益腎安神口服液的質(zhì)量。目前為止，上述的控制方法尚無(wú)公開報(bào)道。

用前述益腎安神口服液特征圖譜的構(gòu)建方法建立10批次益腎安神口服液HPLC特征圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版）”生成有10個(gè)共有峰構(gòu)成的益腎安神口服液HPLC標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜。其中第1號(hào)峰為五味子醇甲。如圖3所示。

在標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中，以五味子醇甲為參照峰S峰，計(jì)算各共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，所述相對(duì)保留時(shí)間在第一規(guī)定值的±10%之內(nèi)，所述第一規(guī)定值為：1.00-峰S、1.07-峰2、1.11-峰3、1.17-峰4、1.23-峰5、1.35-峰6、1.38-峰7、1.63-峰8、1.71-峰9、1.73-峰10；所述共有峰的峰面積在第二規(guī)定值的±10%之內(nèi)，所述第二規(guī)定值為：1.00-峰S、0.36-峰2、0.28-峰3、0.12-峰4、0.27-峰5、0.15-峰6、0.23-峰7、0.33-峰8、0.15-峰9、0.57-峰10。

取益腎安神口服液樣品，按上述同法操作，得到益腎安神口服液樣品特征圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版）”軟件對(duì)益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜和樣品特征圖譜進(jìn)行分析，相似度大于0.95。

益腎安神口服液相關(guān)性研究：共有峰的歸屬

陰性供試品溶液的制備

分別取益腎安神口服液缺五味子陰性樣品、缺續(xù)斷陰性樣品、缺遠(yuǎn)志陰性樣品，缺小茴香陰性樣品，缺山茱萸陰性樣品，按前述益腎安神口服液特征圖譜的構(gòu)建方法的供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

用前述益腎安神口服液特征圖譜的構(gòu)建方法的色譜條件，取上述陰性樣品，照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，得益腎安神口服液相關(guān)性圖譜。如圖3所示。

結(jié)果：益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜中的10個(gè)共有峰，通過(guò)陰性樣品及對(duì)照品做對(duì)照，對(duì)其進(jìn)行歸屬，結(jié)果表明：1號(hào)峰與8號(hào)峰歸屬為五味子藥材；2號(hào)峰、3號(hào)峰為續(xù)斷藥材；4號(hào)峰、6號(hào)峰為遠(yuǎn)志藥材；5號(hào)峰為小茴香藥材；9號(hào)峰、10號(hào)峰歸屬為山茱萸藥材。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

（1）本發(fā)明所公開的供試品處理方法及樣品檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易操作，特征性成分保留完整，且供試品溶液穩(wěn)定性良好；

（2）該高效液相方法的精密度高、重現(xiàn)性良好，分析時(shí)間短，具有一定的專屬性，所得特征圖譜中各峰之間分離效果較好。用本發(fā)明所提供的方法構(gòu)建的益腎安神口服液HPLC特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度大于0.95，能有效的表征其質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。

（3）本發(fā)明指認(rèn)了10個(gè)特征峰，較完整的保留了供試液中的有效化學(xué)成分。通過(guò)藥材專屬性研究，應(yīng)用本發(fā)明可以同時(shí)鑒別產(chǎn)品中五味子、續(xù)斷、遠(yuǎn)志、小茴香、山茱萸等藥材真?zhèn)危哂蟹奖?、省時(shí)、高效等優(yōu)點(diǎn)。

（4）本發(fā)明為益腎安神口服液提供了完整、準(zhǔn)確的新的評(píng)價(jià)手段，可有效的控制益腎安神口服液的質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，特別是可作為益腎安神口服液真?zhèn)舞b別指標(biāo)之一。

附圖說(shuō)明

圖1 益腎安神口服液特征圖譜；

圖2 10批次益腎安神口服液的特征圖譜及共有模式；

圖3 益腎安神口服液的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜；

圖4 益腎安神口服液相關(guān)性圖譜（自下而上圖譜依次為：標(biāo)準(zhǔn)HPLC特征圖譜

遠(yuǎn)志陰性HPLC色譜圖

續(xù)斷陰性HPLC色譜圖

小茴香陰性HPLC色譜圖

山茱萸陰性HPLC色譜圖

五味子陰性HPLC色譜圖）。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：益腎安神口服液特征圖譜方法確立及方法學(xué)考察

儀器：Ultimate 3000型高效液相色譜儀（廠家：美國(guó)戴安公司），MS205DU型分析天平（廠家：梅特勒托利多上海儀器有限公司），TP-150超聲波清洗儀（北京天鵬儀器有限公司）。

試藥：五味子醇甲對(duì)照品（來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110857-201211）、甲醇為色譜純（廠家：美國(guó)（TEDIA）天地試劑公司）、其余試劑為分析純（均購(gòu)自北京化工廠）、水為純化水（自制）、益腎安神口服液（修正藥業(yè)集團(tuán)子公司通藥制藥有限公司提供，批號(hào)：140701）。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含49.5μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取供試品溶液1ml置10ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5分鐘，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）柱為色譜柱，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0ml/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μl，理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

前述中，梯度洗脫的時(shí)間及流動(dòng)相比例為：0～10分鐘，A相：5～40%、B相：95～60%；10～35分鐘，A相：40～70%、B相：60～30%；35～60分鐘，A相：70～100%、B相：30～0%；

測(cè)定：精密吸取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，得到益腎安神口服液的特征圖譜。如圖1所示。

方法學(xué)研究

（1）精密度考察

取批號(hào)為140701的供試品，依法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，考察相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度好。

各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

各共有峰相對(duì)峰面積

（2）重現(xiàn)性考察

取批號(hào)為140701的供試品，依法制成5份供試品溶液，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值一致性，結(jié)果表明，5份供試品中，共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明方法重現(xiàn)性良好。

各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

各共有峰相對(duì)峰面積

（3）穩(wěn)定性考察

取批號(hào)為140701的供試品，依法制成供試品溶液，分別在0，3，6，9，12，24小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)共有峰時(shí)間以及峰面積比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果：共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

各共有峰相對(duì)峰面積

益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

采用實(shí)施例1所述的方法測(cè)定10個(gè)批次益腎安神口服液（批號(hào)分別為：140701，140702，140703、140801、140802、140803、140901、140902、140903、150101，由修正藥業(yè)集團(tuán)子公司通藥制藥股份有限公司提供）。

10個(gè)批次益腎安神口服液的特征圖譜及共有模式如圖2所示。

試驗(yàn)了10批樣品，以參照峰五味子醇甲的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1，計(jì)算10批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積，其RSD均小于3%。

益腎安神口服液樣品10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

益腎安神口服液樣品10個(gè)共有峰的相對(duì)保留峰面積

通過(guò)10個(gè)批次益腎安神口服液HPLC特征圖譜的比較，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)：采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版）”對(duì)10批次益腎安神口服液特征圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，10批次益腎安神口服液特征圖譜與對(duì)照特征圖譜（10批次益腎安神口服液生成的共有模式R）相似度均大于0.95。

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益腎安神口服液10批樣品相似度評(píng)價(jià)

通過(guò)上述方法所建立的益腎安神口服液標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜如圖3所示。