本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及是一種基于金納米棒GNRs氧化過(guò)程光譜變化的抗氧化性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

人體內(nèi)有許多活性氧物種參與機(jī)體細(xì)胞的生理及病理過(guò)程，當(dāng)體內(nèi)的活性氧過(guò)量時(shí)，將壓制體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，從而產(chǎn)生一系列如細(xì)胞損傷、蛋白質(zhì)損傷、DNA變更、酶失活和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等負(fù)面作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明飲食中的抗氧化物質(zhì)可以保護(hù)重要的生物分子避免損傷，減緩氧化應(yīng)激帶來(lái)的危害，減少與衰老有關(guān)的慢性疾病的發(fā)生。臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明水果和蔬菜的攝入量與一些疾病(炎癥、心血管、癌癥、衰老有關(guān)的疾病)的發(fā)生呈反比，食物中的抗氧化劑(多酚類化合物、維生素E、C和胡蘿卜素)在預(yù)防與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病時(shí)很有效。因此，簡(jiǎn)單、可靠、快速檢測(cè)篩選飲食中潛在的抗氧化劑變的尤為重要。

目前食品檢測(cè)分析一般采用化學(xué)分析法(CA)、薄層層析法(TLC)、氣象色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，但需要繁瑣、耗時(shí)的前處理，樣品耗損較大。較之于靈敏度較低的CA和TLC方法，GC、HPLC的靈敏度相對(duì)較高，但操作技術(shù)要求高、儀器設(shè)備昂貴，并不適合現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定和普及，而以金納米材料為免疫標(biāo)記物的檢測(cè)技術(shù)正彌補(bǔ)了這些技術(shù)的缺點(diǎn)，迎合現(xiàn)代檢測(cè)的要求，在現(xiàn)代食品分析檢測(cè)中的運(yùn)用也越來(lái)越多。相對(duì)于傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法，這些基于納米材料的方法因具有檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)便、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)引起了廣泛關(guān)注。

目前為止，尚未有使用金納米棒評(píng)價(jià)抗氧化性的技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)靈敏度高的基于金納米棒氧化過(guò)程光譜變化的抗氧化性評(píng)價(jià)的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：基于金納米棒GNRs氧化過(guò)程光譜變化的抗氧化性評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：

(1)GNRs的制備：取CTAB溶液，在攪拌的同時(shí)往其中加入HAuCl₄溶液，混合均勻后，邊攪拌邊快速加入新配制的NaBH₄溶液，攪拌后靜置，得金種子備用；

取CTAB溶液，加入AgNO₃溶液，混合后，加入HAuCl₄溶液，攪拌使其混勻，再加入沒(méi) 食子酸溶液，待深棕黃色的溶液變?yōu)闇\黃色后，加入所述備用的金種子，靜置反應(yīng)，制得的GNRs經(jīng)離心后分散在超純水中，備用；

(2)GNRs的氧化過(guò)程：取所述步驟(1)中離心后的GNRs溶液，依次加入超純水、CTAB溶液、鹽酸混勻，最后加入H₂O₂溶液，靜置反應(yīng)，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分析GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化；

(3)抗壞血酸對(duì)GNRs氧化反應(yīng)的抑制作用：取所述步驟(1)中離心后的GNRs溶液，向GNRs溶液中加入AA溶液，使得反應(yīng)初始時(shí)溶液中AA的濃度分別為不同的若干組，再加入超純水使其總體積為相同，然后依次加入CTAB溶液、鹽酸混勻，最后加入H₂O₂溶液，靜置反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率；

(4)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力的測(cè)定：取所述步驟(1)中離心后的GNRs溶液，向其中加入抗氧化物質(zhì)的提取液，再加入超純水使其總體積與所述步驟(3)中各組的總體積相同，然后依次加入CTAB溶液、鹽酸混勻，最后加入H₂O₂溶液開(kāi)始反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率；

其中，在所述步驟(3)中，AA對(duì)GNRs氧化過(guò)程的抑制程度用氧化抑制率來(lái)考察，其中氧化抑制率的計(jì)算公式如下公式：

其中△λ₀是無(wú)抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)一段時(shí)間后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值，△λ是有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)一段時(shí)間后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值；

通過(guò)氧化抑制率與抗氧化物濃度之間的關(guān)系，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗氧化物質(zhì)的濃度，即IC₅₀，用來(lái)衡量抗氧化能力；

在所述步驟(4)中，通過(guò)抗氧化物質(zhì)的氧化抑制率與濃度之間的關(guān)系，得出抗氧化物質(zhì)的IC₅₀值，其氧化抑制率的計(jì)算采用所述公式(1)。

金納米棒GNRs是一種棒狀的金納米顆粒，擁有平行于長(zhǎng)軸方向(縱向)和垂直于長(zhǎng)軸方向(徑向)兩個(gè)表面等離激元共振吸收峰；其中，徑向表面等離子體共振模處于500nm至530nm，調(diào)諧范圍小，強(qiáng)度弱，而縱向表面等離激元共振吸收峰隨長(zhǎng)徑比變化可在520～1600nm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，強(qiáng)度遠(yuǎn)高于徑向模式。當(dāng)GNRs在氧化劑H₂O₂的作用下發(fā)生氧化時(shí)，棒逐漸變短，其縱向吸收峰逐漸藍(lán)移(向短波移動(dòng))，而加入抗氧化劑可以抑制該氧化反應(yīng)，抗氧化能力越強(qiáng)，GNRs被氧化的速率越小，其縱向吸收峰的變化越小，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可對(duì)GNRs縱向吸收峰藍(lán)移的過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗氧化能力的評(píng)價(jià)。

本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)氧化抑制率與抗氧化物AA濃度之間的關(guān)系，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗氧化物質(zhì)AA的濃度，即IC₅₀，用來(lái)衡量其他抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力，操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)靈敏度高，本發(fā)明在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的操作下即可完成，操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。

進(jìn)一步的改進(jìn)在于，在所述步驟(1)中，取5.0mL 0.2mol/LCTAB溶液于燒杯中，攪拌的同時(shí)加入5.0mL 5×10^-4mol/L HAuCl₄溶液，混合均勻后，邊攪拌邊快速加入新配制的0℃的0.01mol/L NaBH₄溶液0.6mL，攪拌2min后置于25℃環(huán)境下2h后，得金種子備用；

取2.5mL 0.2mol/L CTAB溶液于燒杯中，加入125μL 4×10^-3mol/L AgNO₃溶液，混合后，加入2.5mL l×10^-3mol/L HAuCl₄溶液，攪拌使其混勻，再加入120μL 0.10mol/L沒(méi)食子酸溶液，待深棕黃色的溶液變?yōu)闇\黃色后，加入25μL金種子，27℃靜置反應(yīng)，制得的GNRs經(jīng)離心后分散在超純水中，備用；

在所述步驟(2)中，取離心后的GNRs溶液300μL，依次加入600μL超純水、900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃靜置反應(yīng)，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分析GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化；

在所述步驟(3)中，向300μLGNRs溶液中加入0.2mg/mL AA溶液，使得反應(yīng)初始時(shí)溶液中AA的濃度分別為0.0015mg/mL、0.0062mg/mL、0.0108mg/mL、0.0154mg/mL，再加入超純水使其總體積為900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃靜置反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率；

在所述步驟(4)中，取GNRs溶液300μL，向其中加入抗氧化物質(zhì)的提取液100μL，再加入超純水使其總體積為900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液開(kāi)始反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率；

其中，在所述步驟(3)中，其中△λ₀是無(wú)抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)45min后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值，△λ是有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)45min后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

圖1是GNRs中加入H₂O₂后每隔3分鐘測(cè)得的紫外吸收光譜圖；

圖2是GNRs被H₂O₂氧化前(左)和氧化后(右)的透射電鏡圖；

圖3是AA的濃度對(duì)氧化抑制率的影響示意圖；

圖4是GNRs氧化過(guò)程的光譜隨竹葉青提取液濃度的變化圖；

圖5是竹葉青提取液的濃度對(duì)氧化抑制率的影響示意圖；

圖6是不同濃度的玫瑰存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖；

圖7是不同濃度的玫瑰和氧化抑制率之間的關(guān)系圖；

圖8是不同濃度的薰衣草存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖；

圖9是不同濃度的薰衣草和氧化抑制率之間的關(guān)系圖；

圖10是不同濃度的山楂存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖；

圖11是不同濃度的山楂和氧化抑制率之間的關(guān)系圖；

圖12是不同濃度的荷葉存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖；

圖13是不同濃度的荷葉和氧化抑制率之間的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

(1)GNRs的制備

取5.0mL 0.2mol/LCTAB溶液于燒杯中，攪拌的同時(shí)加入5.0mL 5×10^-4mol/L HAuCl₄溶液，混合均勻后，邊攪拌邊快速加入新配制的0℃的0.01mol/L NaBH₄溶液0.6mL，攪拌2min后置于25℃環(huán)境下2h后備用；

取2.5mL 0.2mol/L CTAB溶液于燒杯中，加入125μL 4×10^-3mol/L AgNO₃溶液，混合后，加入2.5mL l×10^-3mol/L HAuCl₄溶液，攪拌使其混勻，再加入120μL 0.10mol/L沒(méi)食子酸溶液，待深棕黃色的溶液變?yōu)闇\黃色后，加入25μL金種子，27℃靜置反應(yīng)，制得的GNRs經(jīng)離心后分散在超純水中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

(2)GNRs的氧化過(guò)程

取離心后的GNRs溶液300μL，依次加入600μL超純水、900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃靜置反應(yīng)，采用分光光度計(jì)檢測(cè)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，如圖1、2所示；

(3)抗壞血酸對(duì)GNRs氧化反應(yīng)的抑制作用

取離心后的GNRs溶液300μL，向GNRs溶液中加入0.2mg/mL AA溶液，分成4組，使得反應(yīng)初始時(shí)溶液中AA的濃度分別為0.0015mg/mL、0.0062mg/mL、0.0108mg/mL、0.0154mg/mL，每組均再加入超純水使其總體積為900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃靜置反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率；

其中，在所述步驟(3)中，AA對(duì)GNRs氧化過(guò)程的抑制程度用氧化抑制率來(lái)考察，其中氧化抑制率的計(jì)算公式如下公式：

其中△λ₀是無(wú)抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)45min后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值，△λ是有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)H₂O₂溶液與GNRs反應(yīng)45min后GNRs的縱向吸收峰位置的變化值；

通過(guò)氧化抑制率與抗氧化物濃度之間的關(guān)系，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的AA的濃度，0.0088mg/mL，即IC₅₀，用來(lái)衡量抗氧化能力；

(4)竹葉青抗氧化能力的測(cè)定

以竹葉青提取液替代上述步驟(3)試驗(yàn)中的AA來(lái)研究竹葉青抗氧化能力，取離心后的GNRs溶液300μL，向其中加入竹葉青提取液100μL，再加入超純水使其總體積為900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的鹽酸混勻，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液開(kāi)始反應(yīng)，根據(jù)GNRs的吸收光譜隨時(shí)間的變化，計(jì)算氧化抑制率，如圖4、5所示，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的竹葉青的濃度，0.0338mg/mL，即IC₅₀；其中，圖4是GNRs氧化過(guò)程的光譜隨竹葉青提取液濃度的變化，圖中的0表示制備出的用于檢測(cè)的GNRs(氧化反應(yīng)前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反應(yīng)中添加的竹葉青提取液，濃度依次是：0mg/mL，0.0202mg/mL，0.0263mg/mL，0.0324mg/mL，0.0404mg/mL。

實(shí)施例2：與實(shí)施例1不同的是，在步驟(4)中，測(cè)定的是玫瑰的抗氧化能力，計(jì)算出氧化抑制率，如圖6、7所示，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的玫瑰的濃度，0.0540mg/mL，即IC₅₀；其中，圖6是不同濃度的玫瑰存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖，圖中的0表示制備出的用于檢測(cè)的GNRs(氧化反應(yīng)前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反應(yīng)中添加的玫瑰提取液濃度依次是：0mg/mL，0.0149mg/mL，0.0297mg/mL，0.0520mg/mL，0.0743mg/mL。

實(shí)施例3：與實(shí)施例1不同的是，在步驟(4)中，測(cè)定的是薰衣草的抗氧化能力，計(jì)算出氧化抑制率，如圖8、9所示，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的薰衣草的濃度，0.0907mg/mL，即IC₅₀；其中，圖8是不同濃度的薰衣草存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖，圖中的0表示制備出的用于檢測(cè)的GNRs(氧化反應(yīng)前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反應(yīng)中添加的的薰衣草提取液濃度依次是：0mg/mL，0.0154mg/mL，0.0384mg/mL，0.0691mg/mL，0.0998mg/mL。

實(shí)施例4：與實(shí)施例1不同的是，在步驟(4)中，測(cè)定的是山楂的抗氧化能力，計(jì)算出 氧化抑制率，如圖10、11所示，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的山楂的濃度，0.2383mg/mL，即IC₅₀；其中，圖10是不同濃度的山楂存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖，圖中的0表示制備出的用于檢測(cè)的GNRs(氧化反應(yīng)前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反應(yīng)中添加的山楂提取液濃度依次是：0mg/mL，0.1183mg/mL，0.1736mg/mL，0.2367mg/mL，0.2628mg/mL。

實(shí)施例5：與實(shí)施例1不同的是，在步驟(4)中，測(cè)定的是荷葉的抗氧化能力，計(jì)算出氧化抑制率，如圖12、13所示，找出氧化抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的荷葉的濃度，0.2533mg/mL，即IC₅₀；其中，圖12是不同濃度的荷葉存在時(shí)，H₂O₂與金納米棒反應(yīng)45min后測(cè)得的紫外-可見(jiàn)光譜圖，圖中的0表示制備出的用于檢測(cè)的GNRs(氧化反應(yīng)前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反應(yīng)中添加的荷葉提取液濃度依次是：0mg/mL，0.1282mg/mL，0.2015mg/mL，0.2748mg/mL，0.3664mg/mL。

通過(guò)氧化抑制率與濃度之間的關(guān)系，得出竹葉青、玫瑰、薰衣草、山楂和荷葉的IC₅₀值，為驗(yàn)證該方法的可靠性，采用了傳統(tǒng)的DPPH法對(duì)上述實(shí)施例1-5中的5種花茶的抗氧化性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，如下表1。

表1花茶的抗氧化能力比較

從表1中對(duì)照結(jié)果看，兩種方法得到的上述5種抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力的順序與GNRs法是一致的，只是AA當(dāng)量的數(shù)值不同，這種差異可能是由于其中所含抗氧化物質(zhì)的種類、溶解性差異以及花茶中所含其他物質(zhì)的協(xié)同作用等共同影響所造成的，但這也反應(yīng)出GNRs法在評(píng)價(jià)花茶抗氧化能力方面的是可行的。

上面結(jié)合測(cè)試數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)的說(shuō)明，但是本發(fā)明不限于上述實(shí)施方 式，在所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化；如針對(duì)竹葉青、玫瑰、薰衣草、山楂和荷葉之外的其他抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，知曉其抗氧化能力的強(qiáng)弱。