本發(fā)明涉及高效液相色譜檢測唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：唑來膦酸為靜脈用第三代雙磷酸鹽制劑，可用于Paget，s病、高血鈣癥和多發(fā)性骨髓瘤，以及前列腺癌患者因雄性激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失、多種腫瘤導(dǎo)致的溶骨性骨轉(zhuǎn)移等。2007年美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)唑來膦酸(密固達(dá))用于治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥及Page’s病，成為骨質(zhì)疏松患者的新選擇，目前已在中國境內(nèi)上市銷售。咪唑-1-乙酸(唑來膦酸有關(guān)物質(zhì)A)是唑來膦酸合成過程中的中間體，易引入到注射液產(chǎn)品中。然而，目前針對唑來膦酸注射液及其有關(guān)物質(zhì)的高效液相檢測方法中，并未對有關(guān)物質(zhì)A進(jìn)行測定，在控制產(chǎn)品質(zhì)量方面存在明顯缺陷。因此，在唑來膦酸注射液的檢測過程中，有必要增加對雜質(zhì)A的監(jiān)測。而且，現(xiàn)有的檢測方法大多流速過高，色譜柱壓力較大，導(dǎo)致色譜柱損耗快，重現(xiàn)性欠佳。因此，提供一種能夠更加全面檢測唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜條件，成為了一個亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)的高效液相檢測方法。本發(fā)明提供了高效液相色譜檢測唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法，它包括以下步驟：a、取唑來膦酸注射液為供試品；b、取有關(guān)物質(zhì)的對照品，用稀釋劑溶解，得到對照品溶液；c、采用如下色譜條件分別對供試品、對照品溶液進(jìn)行檢測：固定相：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈體積比為90～95：6～3：4～2；其中，磷酸氫二鈉混合溶液由下述質(zhì)量百分比的組分組成：磷酸氫二鈉13～14％、硫酸氫四己銨0.4～0.5％，余量為水，調(diào)節(jié)pH值至7.7～8.0；檢測波長：200～225nm。進(jìn)一步的，所述的流動相中，磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈體積比為90:6:4。進(jìn)一步的，所述的磷酸氫二鈉混合溶液由下述質(zhì)量百分比的組分組成：磷酸氫二鈉13％、硫酸氫四己銨0.4％，余量為水，調(diào)節(jié)pH值至7.7。進(jìn)一步的，所述的固定相為phenomenoxLunaC18(2)柱；色譜柱規(guī)格為：內(nèi)徑4.6mm，長度250mm，填料粒徑5μm，孔徑進(jìn)一步的，檢測波長為215nm。進(jìn)一步的，有關(guān)物質(zhì)為雜質(zhì)A。進(jìn)一步的，流速為0.4～0.5ml/min；柱溫為25～30℃。進(jìn)一步的，流速為0.5ml/min；柱溫為30℃。進(jìn)一步的，所述的稀釋劑為水，供試品濃度為30～50μg/ml，對照品濃度為0.02～0.075μg/ml，進(jìn)樣量為100～200μl。進(jìn)一步的，供試品濃度為45μg/ml，對照品濃度為0.075μg/ml，進(jìn)樣量為200μl。本發(fā)明提供了一種高效液相色譜檢測唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法。采用本發(fā)明色譜條件，能夠更加全面地檢測唑來膦酸注射液的有關(guān)物質(zhì)，尤其可使有關(guān)物質(zhì)A與注射液中的其它峰的分離度達(dá)到1.5以上，實(shí)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)A的準(zhǔn)確檢測，從而更好地控制唑來膦酸注射液的產(chǎn)品質(zhì)量。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為實(shí)施例1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)HPLC譜圖；圖2為實(shí)驗(yàn)例1流動相流速為0.4ml/min時HPLC譜圖；圖3為實(shí)驗(yàn)例2流動相中甲醇：乙腈體積比為2:8時HPLC譜圖；圖4為實(shí)驗(yàn)例2流動相中甲醇：乙腈體積比為4:6時HPLC譜圖；圖5為實(shí)驗(yàn)例2流動相中甲醇：乙腈體積比為6:4時HPLC譜圖；圖6為實(shí)驗(yàn)例2流動相中甲醇：乙腈體積比為8:2時HPLC譜圖；圖7為實(shí)驗(yàn)例3唑來膦酸注射液破壞試驗(yàn)HPLC譜圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。實(shí)施例1高效液相色譜檢測唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)A的方法固定相：phenomenoxLunaC18(2)100A(250mm×4.6mm，5μm)流動相：磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈體積比為90：6：4；其中，磷酸氫二鈉混合溶液由下述質(zhì)量百分比的組分組成：磷酸氫二鈉13％、硫酸氫四己銨0.4％，余量為水，調(diào)節(jié)pH值至7.7；流速：0.5ml/min，檢測波長：215nm，檢測器：DAD檢測器，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：200μl。1、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)取0.75μg/ml唑來膦酸有關(guān)物質(zhì)A1ml，至10ml容量瓶中，用唑來磷酸注射液(按表1所示唑來膦酸注射液處方配制)定容，即得系統(tǒng)適用性溶液。表1唑來膦酸注射液處方成分用量唑來膦酸5mg甘露醇4.95g枸櫞酸鈉30mg注射用水100ml取系統(tǒng)適用性溶液為供試品，采用上述方法檢測。HPLC譜圖見圖1，檢測結(jié)果見表2。表2唑來膦酸注射液高效液相檢測結(jié)果系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)表明，采用上述檢測條件，有關(guān)物質(zhì)A與唑來膦酸主峰可完全分離，與輔料峰分離度大于1.5，可準(zhǔn)確檢測有關(guān)物質(zhì)A。2、唑來膦酸注射液中有關(guān)物質(zhì)A的檢測a、取唑來膦酸注射液為供試品，唑來膦酸濃度為45μg/ml；b、取有關(guān)物質(zhì)A的對照品，用水溶解，得到濃度為0.075μg/ml對照品溶液；c、采用上述色譜條件分別對供試品、對照品溶液進(jìn)行檢測。以下通過實(shí)驗(yàn)例證明本發(fā)明的有益效果。實(shí)驗(yàn)例1流動相流速對雜質(zhì)A與相鄰峰分離度的影響分別考察流動相流速為1.2ml/min、0.4ml/min和0.5ml/min，檢測條件如下：固定相：phenomenoxLunaC18(2)100A(250mm×4.6mm，5μm)流動相：磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈體積比為90：6：4；其中，磷酸氫二鈉混合溶液由下述重量配比的組分組成：磷酸氫二鈉13％、硫酸氫四己銨0.4％、以水做溶劑，調(diào)節(jié)pH值至7.7；檢測波長：215nm，檢測器：DAD檢測器，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：200μl。操作步驟同實(shí)施例1，檢測結(jié)果見表3，流動相流速為0.4ml/min時HPLC譜圖見圖2。表3流動相流速對雜質(zhì)A與相鄰峰分離度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：流動相流速為1.2ml/min時，雜質(zhì)A與輔料峰分離度僅能達(dá)到0.56，分離效果較差。降低流速至0.4ml/min、0.5ml/min，分離度顯著提升，表明采用本發(fā)明流動相流速有利于提高雜質(zhì)A與輔料峰分離度。實(shí)驗(yàn)例2流動相中有機(jī)相比例對雜質(zhì)A與相鄰峰分離度的影響固定相：phenomenoxLunaC18(2)100A(250mm×4.6mm，5μm)流動相：固定磷酸氫二鈉混合溶液為90體積份，以如表4所示不同體積比的磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈為流動相；其中，磷酸氫二鈉混合溶液由下述重量配比的組分組成：磷酸氫二鈉13％、硫酸氫四己銨0.4％、以水做溶劑，調(diào)節(jié)pH值至7.7；流速：0.5ml/min，檢測波長：215nm，檢測器：DAD檢測器，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：200μl。操作步驟同實(shí)施例1，檢測結(jié)果見表4，HPLC譜圖見圖3～6。表4流動相中有機(jī)相比例對雜質(zhì)A與相鄰峰分離度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明流動相中甲醇：乙腈體積比為6:4，在此條件下雜質(zhì)A與輔料峰分離度可達(dá)到1.94，能夠?qū)⑦騺盱⑺嶙⑸湟褐械碾s質(zhì)A與輔料完全分離，檢測雜質(zhì)A更加準(zhǔn)確，可較好地控制唑來膦酸注射液的質(zhì)量。以上結(jié)果表明，流動相組成為體積比為90:6:4的磷酸氫二鈉混合溶液-甲醇-乙腈時，雜質(zhì)A與輔料峰的分離效果最佳。實(shí)驗(yàn)例3唑來膦酸注射液破壞試驗(yàn)有關(guān)物質(zhì)測定儀器：Agilent1260液相色譜儀固定相：phenomenoxLunaC18(2)100A(250mm×4.6mm，5μm)流動相：磷酸氫二鈉混合溶液：甲醇：乙腈體積比為90：6：4；其中，磷酸氫二鈉混合溶液由下述重量配比的組分組成：磷酸氫二鈉13％、硫酸氫四己銨0.4％、以水做溶劑，調(diào)節(jié)pH值至7.7；流速：0.5ml/min，檢測波長：215nm，檢測器：DAD檢測器，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：200μl。雜質(zhì)A對照品溶液：精密稱取雜質(zhì)A對照品適量，用水溶解稀釋制成每1ml約含雜質(zhì)A0.075μg的溶液，作為雜質(zhì)A對照品溶液。輔料空白儲備液：按照處方比例稱取甘露醇、枸櫞酸鈉適量，加水溶解制成每1ml中約含甘露醇0.198g、枸櫞酸鈉1.20mg的溶液作為陰性溶液儲備液。供試品儲備溶液：按處方比例分別稱取甘露醇、枸櫞酸鈉和唑來膦酸原料適量，加水溶解制成每1ml中約含甘露醇0.198g、枸櫞酸鈉1.20mg、唑來膦酸0.20mg的溶液作為供試品儲備溶液。1、唑來膦酸注射液未破壞的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取雜質(zhì)A對照品溶液、輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至20ml量瓶中，加水溶解并定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。2、唑來膦酸注射液酸破壞后的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至20ml量瓶中，加0.5mol/L鹽酸2.5ml，50℃加熱5h，冷卻后加0.5mol/L氫氧化鈉2.5ml中和，加水定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。3、唑來膦酸注射液堿破壞后的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至20ml量瓶，加0.5mol/L氫氧化鈉2.5ml，50℃加熱5h，冷卻后加0.5mol/L鹽酸2.5ml中和，加水定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。4、唑來膦酸注射液氧化破壞后的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至20ml量瓶，加3％過氧化氫2ml，室溫放置15h后加水定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。5、唑來膦酸注射液高溫破壞后的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至頂空瓶內(nèi)，121℃恒溫加熱20h后，取出晾冷，加水溶解并轉(zhuǎn)移至20ml容量瓶內(nèi)，加水定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。6、唑來膦酸注射液光照降解后的有關(guān)物質(zhì)檢測分別取輔料空白儲備液和供試品儲備溶液5ml至25ml量瓶，密封，5000lx照射1天，取出后加水定容。依法測定，HPLC圖譜見圖7。當(dāng)前第1頁1 2 3