本發(fā)明涉及體外診斷醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合及其制備方法和包括其的肌紅蛋白檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

肌紅蛋白(Myoglobin,MYO)是由一條肽鏈和一個(gè)血紅素輔基組成的結(jié)合蛋白，大量存在于橫紋肌(骨骼肌以及心肌)細(xì)胞中的血紅素蛋白。心肌或者骨骼肌受損時(shí)，肌紅蛋白會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜的破裂而被釋放到血管系統(tǒng)，可以在血液中檢測到。

在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)患者發(fā)病后1～3h血內(nèi)肌紅蛋白濃度迅速升高，12h時(shí)幾乎所有AMI患者的肌紅蛋白都升高。因此胸痛發(fā)作6～12h內(nèi)肌紅蛋白不升高是排除AMI良好的指標(biāo)(即陰性指標(biāo))，同時(shí)也是早期檢測AMI最快的指標(biāo)。由于在AMI后血中肌紅蛋白很快從腎臟清除，發(fā)病18～30h內(nèi)可完全恢復(fù)到正常水平，所以肌紅蛋白的測定有助于在AMI病程中觀察患者有無再梗死或梗死再擴(kuò)展病癥，同時(shí)也是溶栓治療中判斷有無再灌注的較敏感而準(zhǔn)確的指標(biāo)。

目前臨床上肌紅蛋白的檢測方法主要有膠體金法、免疫比濁法、免疫熒光法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。膠體金法的缺點(diǎn)在于無法準(zhǔn)確進(jìn)行定量，且批間差異較大，無法持續(xù)監(jiān)控患者肌紅蛋白的水平；免疫比濁法的缺點(diǎn)在于試劑靈敏度較差，對(duì)于心肌梗死的判斷不利；免疫熒光法但依然存在反應(yīng)時(shí)間較長，對(duì)環(huán)境要求較高，容易受空氣塵埃影響，且多為96人份/盒，使用稀土標(biāo)記物等缺點(diǎn)也使得此免疫方法無法大規(guī)模使用?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法法是一種較為先進(jìn)的免疫學(xué)方法，具有反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，標(biāo)記物穩(wěn)定性好，在保證檢測速度的前提下，也能達(dá)到檢測高通量。根據(jù)目前肌紅蛋白臨床的應(yīng)用情況，市場應(yīng)用前景最好且診斷最可靠的方法學(xué)為化學(xué)發(fā)光免疫分析法。

雖然目前中國市場上已有注冊(cè)批準(zhǔn)的肌紅蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定試劑盒，但多為進(jìn)口試劑，成本較高，且試劑盒的制備方法和相關(guān)材料均作為保密資料，未被公開，不利于肌紅蛋白檢測在社區(qū)基層醫(yī)院的推廣。國產(chǎn)肌紅蛋白試劑盒重復(fù)性較差，批間差異難控，且靈敏度較低，臨床應(yīng)用前景較差。

因此，本領(lǐng)域急需一種具有檢測靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)的肌紅蛋白檢測試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物及其制備方法，利用所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物檢測肌紅蛋白的靈敏度大幅提高。

本發(fā)明還有一目的是提供包括上述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的肌紅蛋白檢測試劑盒。

本發(fā)明再有一目的是提供利用本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物或肌紅蛋白檢測試劑盒檢測肌紅蛋白的方法。

本發(fā)明公開了一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物及其制備方法和包括所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的肌紅蛋白檢測試劑盒。本發(fā)明一種酶標(biāo)記檢測信號(hào)放大方法，即，堿性磷酸酶與肌紅蛋白單克隆抗體交聯(lián)后，標(biāo)記在膠體金上，作為酶標(biāo)記復(fù)合物。本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒采用膠體金上包被肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物，從而增加檢測的反應(yīng)信號(hào)，具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、藥物干擾小、結(jié)果穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；從而可以大規(guī)模適用于心血管疾病臨床輔助診斷。

在第一方面，本發(fā)明提供一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物由肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物和膠體金組成，其中肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物標(biāo)記在膠體金上。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶是堿性磷酸酶。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物通過以下方法制得：

1)將肌紅蛋白單克隆抗體與酶交聯(lián)，制得抗體酶標(biāo)記物；

2)將步驟1)獲得的抗體酶標(biāo)記物加入膠體金溶液中，從而獲得肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

具體地說，所述制備方法包括以下步驟：

a)肌紅蛋白單克隆抗體與酶通過戊二醛法交聯(lián)反應(yīng)，制得抗體酶標(biāo)記物；

b)在氯化金溶液中加入檸檬酸三鈉，制備膠體金溶液；

c)將步驟a)反應(yīng)后的抗體酶標(biāo)記物加入至膠體金溶液中，混勻，加入封閉液；

d)將步驟c)處理的抗體標(biāo)記物經(jīng)洗滌后，保存在磁微粒保存液中。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物是將肌紅蛋白單克隆抗體與堿性磷酸酶通過戊二醛法進(jìn)行交聯(lián)。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述戊二醛、堿性磷酸酶的濃度分別為2％～10％、2～20mg/mL，優(yōu)選5％、10mg/mL。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述堿性磷酸酶與抗體質(zhì)量比例為3:1～1:3，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:1。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，1％氯化金與1％檸檬酸三鈉體積比例為1:1～1:4，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:2。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，膠體金的pH值為8.0～11.0，優(yōu)選質(zhì)量比例為膠體金的pH值為8.5。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記物再包被在膠體金時(shí)，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物的預(yù)稀釋濃度為0.05～0.5mg/mL，優(yōu)選質(zhì)量比例為預(yù)稀釋濃度為0.2mg/mL。

在第二方面，本發(fā)明提供一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)將肌紅蛋白單克隆抗體與酶交聯(lián)，制得抗體酶標(biāo)記物；

2)將步驟1)獲得的抗體酶標(biāo)記物加入膠體金溶液中，從而獲得肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

在具體的實(shí)施方式中，所述方法包括：

a)肌紅蛋白單克隆抗體與酶通過戊二醛法交聯(lián)反應(yīng)，制得抗體酶標(biāo)記物；

b)在氯化金溶液中加入檸檬酸三鈉，制備膠體金溶液。

c)將步驟a)反應(yīng)后的抗體酶標(biāo)記物加入至膠體金溶液中，混勻，加入封閉液；

d)將步驟c)處理的抗體標(biāo)記物經(jīng)洗滌后，保存在磁微粒保存液中。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟a)中的所述酶是堿性磷酸酶。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物是將肌紅蛋白單克隆抗體與堿性磷酸酶通過戊二醛法進(jìn)行交聯(lián)；具體操作為：將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，室溫靜置過夜，生理鹽水透析后，加入肌紅蛋白單克隆抗體，50mM pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過夜，加入等體積甘油，置于-20℃保存。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述戊二醛、堿性磷酸酶的濃度分別為2％～10％、2～20mg/mL，優(yōu)選5％、10mg/mL。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述堿性磷酸酶與抗體質(zhì)量比例為3:1～1:3，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:1。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，1％氯化金與1％檸檬酸三鈉體積比例為1:1～1:4，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:2。膠體金的制備方法的具體操作為：將1％氯化金溶液加入純化水中，混勻，攪拌加熱至沸騰。按照1％氯化金與1％檸檬酸三鈉1:2的體積比例加入1％檸檬酸三鈉溶液，冷卻到室溫，制成膠體金溶液。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，所述膠體金的pH值為8.0～11.0，優(yōu)選質(zhì)量比例為膠體金的pH值為8.5。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，交聯(lián)物再包被在膠體金時(shí)，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物的預(yù)稀釋濃度為0.05～0.5mg/mL，優(yōu)選質(zhì)量比例為預(yù)稀釋濃度為0.2mg/mL。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物復(fù)合物的制備方法的具體操作為：用飽和K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物，攪拌后加入10％BSA溶液，混勻。經(jīng)洗滌，離心后，加入含有0.1％PEG20000稀釋緩沖液，2～8℃保存。

在第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物在檢測肌紅蛋白或制備肌紅蛋白檢測試劑盒中的用途。

在第三方面，本發(fā)明提供一種肌紅蛋白檢測試劑盒，所述試劑盒裝有：本發(fā)明第一方面所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白檢測試劑盒還裝有：肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒；肌紅蛋白定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和稀釋液及使用說明書。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分為1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物，為酶促化學(xué)發(fā)光底物。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物為AMPPD(3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷)、CDP-star。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑的主要成分是超順磁性微粒，其粒徑為800nm～3μm，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?/p>

在第四方面，本發(fā)明提供制備肌紅蛋白檢測試劑盒的方法，所述的方法包括：將本發(fā)明第一方面所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物制成肌紅蛋白檢測試劑盒。

在具體的實(shí)施方式中，所述方法包括：將本發(fā)明第一方面所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物；肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒；肌紅蛋白定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和稀釋液制成肌紅蛋白檢測試劑盒。所述試劑盒還可裝有使用說明書以及合適的移液器件。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒的制備，是將活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；拇盼⒘Ｍㄟ^共價(jià)交聯(lián)的方式與肌紅蛋白單克隆抗體交聯(lián)，經(jīng)洗滌封閉后，制得肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒，最終貯存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、2～15％甘油、0.05～0.1％NaN₃。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的稀釋液的配方為：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、3％～10％蔗糖、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.5％PEG20000、0.05～0.2％ProClin-300。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的肌紅蛋白定標(biāo)品的濃度分別為150～250ng/mL和1200～1800ng/mL。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的肌紅蛋白定標(biāo)品的稀釋液配方為：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的洗滌液配方為：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

在第五方面，本發(fā)明提供一種檢測肌紅蛋白的方法，所述方法包括利用本發(fā)明第一方面所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明第三方面所述的肌紅蛋白檢測試劑盒檢測樣品中的肌紅蛋白。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備工藝流程。

圖2顯示了肌紅蛋白檢測的反應(yīng)原理圖。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，膠體金方法無法準(zhǔn)確進(jìn)行定量，且批間差異較大，因此僅能用于定性，而堿性磷酸酶直接標(biāo)記肌紅蛋白單克隆抗體對(duì)于肌紅蛋白的檢測靈敏度也不能令人滿意。經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，采用堿性磷酸酶與肌紅蛋白單克隆抗體交聯(lián)后，將標(biāo)記物再包被在膠體金上得到的酶標(biāo)記復(fù)合物，可以顯著提高肌紅蛋白的檢測靈敏度，同時(shí)確保試劑的特異性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物及其制備方法

基于以上的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物由肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物和膠體金組成，其中肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物標(biāo)記在膠體金上。

鑒于本領(lǐng)域，例如化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域的公知常識(shí)法以及本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要選擇肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物中的酶。在具體的實(shí)施方式中，所述酶是堿性磷酸酶。

相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)將肌紅蛋白單克隆抗體與酶交聯(lián)，制得抗體酶標(biāo)記物；

2)將步驟1)獲得的抗體酶標(biāo)記物加入膠體金溶液中，從而獲得肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

在具體的實(shí)施方式中，所述方法包括：

a)肌紅蛋白單克隆抗體與酶通過戊二醛法交聯(lián)反應(yīng)，制得抗體酶標(biāo)記物；

b)在氯化金溶液中加入檸檬酸三鈉，制備膠體金溶液；

c)將步驟a)反應(yīng)后的抗體酶標(biāo)記物加入至膠體金溶液中，混勻，加入封閉液；

d)將步驟c)處理的抗體標(biāo)記物經(jīng)洗滌后，保存在磁微粒保存液中。

本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物可以用于檢測肌紅蛋白或制備肌紅蛋白檢測試劑盒，從而顯著提高檢測肌紅蛋白時(shí)的靈敏度。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶是堿性磷酸酶。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物是將肌紅蛋白單克隆抗體與堿性磷酸酶通過戊二醛法進(jìn)行交聯(lián)。

在具體的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物和肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備過程中采用以下工藝參數(shù)。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述戊二醛、堿性磷酸酶的濃度分別為2％～10％、2～20mg/mL，優(yōu)選5％、10mg/mL。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶交聯(lián)抗體時(shí)，所述堿性磷酸酶與抗體質(zhì)量比例為3:1～1:3，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:1。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，所述1％氯化金與1％檸檬酸三鈉體積比例為1:1～1:4，優(yōu)選質(zhì)量比例為1:2。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠體金的制備時(shí)，所述膠體金的pH值為8.0～11.0，優(yōu)選質(zhì)量比例為膠體金的pH值為8.5。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，交聯(lián)物再包被膠體金時(shí)，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物的預(yù)稀釋濃度為0.05～0.5mg/mL，優(yōu)選質(zhì)量比例為預(yù)稀釋濃度為0.2mg/mL。

同樣，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以合理確定所用的磁微粒。例如，在具體的實(shí)施方式中，磁微粒的主要成分是超順磁性微粒，粒徑為800nm～3μm，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?/p>

在具體的實(shí)施方式中，所述的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備，是堿性磷酸酶與肌紅蛋白單克隆抗體通過戊二醛法交聯(lián)后，標(biāo)記物再包被在膠體金上，經(jīng)洗滌，離心后，溶解在含有0.1％PEG20000稀釋液中，作為酶標(biāo)記復(fù)合物，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒

本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物可以用于檢測肌紅蛋白或制備肌紅蛋白檢測試劑盒，從而顯著提高檢測肌紅蛋白時(shí)的靈敏度。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種肌紅蛋白檢測試劑盒，所述試劑盒裝有本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定所述肌紅蛋白檢測試劑盒中的其它組分，例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒還可裝有：肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒；肌紅蛋白定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；稀釋液及使用說明書。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物中的酶是堿性磷酸酶。

相應(yīng)地，本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒中的所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分可以為1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物，為酶促化學(xué)發(fā)光底物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物為AMPPD(3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷)、CDP-star。而本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒中的磁微粒試劑的主要成分可以是超順磁性微粒，其粒徑為800nm～3μm，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?。

本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒可如下所示進(jìn)行制備，包括：將本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明的方法制備的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物制成肌紅蛋白檢測試劑盒。具體地說，本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒的制備方法包括：將本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒；肌紅蛋白定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；洗滌液和相應(yīng)的稀釋液制成肌紅蛋白檢測試劑盒。所述檢測試劑盒中還可裝有使用說明書以及用于移液的合適器件。

在具體的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、2～15％甘油、0.05～0.1％NaN3。

在具體的實(shí)施方式中，肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備方法，具體為：將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，室溫靜置過夜，生理鹽水透析后，加入肌紅蛋白單克隆抗體，50mM pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過夜，加入等體積甘油，置于-20℃保存。將1％氯化金溶液加入純化水中，混勻，攪拌加熱至沸騰。按照1％氯化金與1％檸檬酸三鈉1:2的體積比例加入1％檸檬酸三鈉溶液，冷卻到室溫，制成膠體金溶液。用飽和K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物，攪拌后加入10％BSA溶液，混勻。經(jīng)洗滌，離心后，加入含有0.1％PEG20000稀釋緩沖液，2～8℃保存。

在具體的實(shí)施方式中，肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的稀釋液的配方為：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、3％～10％蔗糖、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.5％PEG20000、0.05～0.2％ProClin-300；所述的肌紅蛋白定標(biāo)品的濃度分別為150～250ng/mL和1200～1800ng/mL；所述的肌紅蛋白定標(biāo)品的稀釋液配方為：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300；所述的洗滌液配方為：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

本發(fā)明的肌紅蛋白的檢測方法

在本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物以及包含其的肌紅蛋白檢測試劑盒的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種檢測肌紅蛋白的方法，所述方法利用本發(fā)明的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，或本發(fā)明的肌紅蛋白檢測試劑盒檢測樣品中的肌紅蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明的肌紅蛋白檢測方法可以用于診斷目的，但不限于診斷目的，例如，可用于科研目的等等。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

1)本發(fā)明包含的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物聯(lián)用了酶交聯(lián)工藝以及膠體金交聯(lián)工藝，從而顯著提高了反應(yīng)信號(hào)，從而提高了檢測靈敏度；

2)包含本發(fā)明肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的試劑盒的檢測靈敏度高，最低檢測限能達(dá)到0.5ng/mL；

3)本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)；膽紅素、血紅蛋白、乳糜顆粒、類風(fēng)濕因子(RF)、抗核抗體(ANA)、人抗鼠抗體(HAMA)對(duì)肌紅蛋白測定結(jié)果均無明顯干擾；

4)本發(fā)明的試劑盒藥物干擾??；對(duì)于目前市面上常見的且臨床使用普遍的心血管藥物，即，鹽酸多巴胺、阿司匹林、阿替洛爾、鹽酸氟桂利嗪、苯妥英鈉、雙氯芬酸鈉、土霉素、硝苯地平、對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸氨溴索、茶堿、甲基多巴和地高辛，本發(fā)明的試劑盒對(duì)其均幾乎無明顯干擾。

5)本發(fā)明的試劑盒測定結(jié)果穩(wěn)定性好；堿性磷酸酶更穩(wěn)定、測定結(jié)果的重復(fù)性更好，1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物具有較長的發(fā)光時(shí)間，發(fā)光信號(hào)可穩(wěn)定超過20分鐘以上；信號(hào)強(qiáng)度高，便于光電倍增管檢測；抗干擾能力強(qiáng)，不易污染。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例

材料與方法

材料

以下實(shí)施例中所用的各種試劑均是市售可得的試劑，例如化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)；堿性磷酸酶可以購自BBI公司，但不限于此。

方法

1.肌紅蛋白磁微粒試劑的制備

肌紅蛋白磁微粒試劑稀釋液配方：

將肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒用磁微粒稀釋液稀釋至0.2～0.8mg/mL，室溫充分混勻至少30分鐘，制得肌紅蛋白磁微粒試劑。

2.肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒的制備

1)取10mg活性功能基團(tuán)為羧基的1.0μm磁微粒，用50mM pH6.0的MES緩沖液洗滌2次；

2)磁吸后去上清液，加入0.5mL的50mM pH 6.0的MES緩沖液混勻，再加入0.5mL 25mg/mL碳二亞胺(EDC)溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

3)加入40μg肌紅蛋白單克隆抗體，再用50mM pH 6.0的MES緩沖液定容至1mL，充分混勻，37℃反應(yīng)過夜；

4)用含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液洗滌2次；

5)加入2mL含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液，充分混勻，37℃封閉過夜；

6)用含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液洗滌2次；

7)加入2mL含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％BSA溶液，充分混勻；

8)2～8℃保存，制得肌紅蛋白單克隆抗體磁微粒。

3.肌紅蛋白酶試劑的制備

肌紅蛋白酶試劑稀釋液配方：

將肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物用酶稀釋液稀釋至1:1000～1:5000，室溫充分混勻至少30分鐘，制得肌紅蛋白酶試劑。

4.肌紅蛋白定標(biāo)品的制備

肌紅蛋白定標(biāo)品稀釋液配方：

將重組肌紅蛋白抗原用定標(biāo)品稀釋液分別稀釋至200ng/mL和1500ng/mL，室溫充分混勻至少30分鐘，制得肌紅蛋白定標(biāo)品。通過多次對(duì)校準(zhǔn)品和定標(biāo)品同時(shí)測定，建立肌紅蛋白試劑盒主曲線，并對(duì)肌紅蛋白定標(biāo)品進(jìn)行賦值，即為肌紅蛋白定標(biāo)品的制備。

5.洗滌液的制備

洗滌液配方：

按配方配制洗滌液，室溫充分混勻至少30分鐘，制得洗滌液。

6.肌紅蛋白的檢測方法

1)加入10μl血清或血漿樣本、100μl磁微粒試劑、100μl酶試劑；

2)37℃反應(yīng)15分鐘；

3)磁吸后去上清液，加入300μl洗滌液；

4)重復(fù)步驟3)2次；

5)磁吸后去上清液，加入300μl化學(xué)發(fā)光底物；

6)37℃下反應(yīng)10分鐘；

7)光電倍增管(PMT)讀取相對(duì)發(fā)光單位(RLU)，自動(dòng)計(jì)算濃度值。

實(shí)施例1.肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的制備

1)將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，使得堿性磷酸酶的濃度為10mg/mL；

2)室溫靜置過夜；

3)用生理鹽水(體積比大于1:200)透析至少4小時(shí)；

4)取出透析后的堿性磷酸酶，按照質(zhì)量1:1的比例加入肌紅蛋白單克隆抗體，充分混勻；

5)50mM pH 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜；

6)取出透析液，按照體積比1:1000加入1M甘氨酸溶液，混勻，終止反應(yīng)2小時(shí)；

7)等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃保存2小時(shí)；

8)4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mM pH 7.40磷酸緩沖液中；

9)50mM pH 7.40磷酸緩沖液中透析過夜；

10)取出透析液加入等體積的甘油，制得堿性磷酸酶標(biāo)記肌紅蛋白單克隆抗體，置于-20℃保存。

11)將1％氯化金溶液加入純化水中，混勻，攪拌加熱至沸騰。

12)按照1％氯化金與1％檸檬酸三鈉1:2的體積比例加入1％檸檬酸三鈉溶液，冷卻到室溫，制成膠體金溶液。

13)用飽和K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌紅蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物，攪拌后加入10％BSA溶液，混勻。經(jīng)洗滌，離心后，加入含有0.1％PEG20000稀釋緩沖液，2～8℃保存。

實(shí)施例2.肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物的靈敏度檢測

利用實(shí)施例1所得的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，如材料與方法所述進(jìn)行靈敏度檢測，結(jié)果如下表所示：

注：

(1)傳統(tǒng)肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物；

(2)利用膠體金包被的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物。

從上表可以看出，使用本發(fā)明的膠體金包被的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物，其靈敏度(S/N值)比傳統(tǒng)肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物提高了1.92倍。此外，其檢測的功能靈敏度為0.5ng/mL，顯著低于傳統(tǒng)肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記物。綜上所述，使用本發(fā)明的膠體金包被的肌紅蛋白單克隆抗體酶標(biāo)記復(fù)合物可以明顯提高肌紅蛋白的靈敏度。

實(shí)施例3.本發(fā)明所述的試劑盒分析性能

1)最低檢測限：本試劑盒的最低檢測限不高于0.5ng/mL。

測定空白樣本20次，計(jì)算20次測定結(jié)果均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，M+2SD對(duì)應(yīng)的濃度即為試劑盒的最低檢測限。

2)準(zhǔn)確度：本試劑盒的回收率在85％～115％之間。

3)重復(fù)性：本試劑盒的相對(duì)變異系數(shù)(CV)≤8％。

4)線性范圍：本試劑盒的線性范圍為0.5～2500ng/mL。

將接近線性范圍上限的高值樣本進(jìn)行系列稀釋，計(jì)算實(shí)測值與理論稀釋度之間的線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果應(yīng)大于或等于0.99。

5)批間差：本試劑盒批間的相對(duì)變異系數(shù)(CV)≤15％。

6)藥物干擾：

測定臨床中常用的若干種心血管藥物，不同濃度下的藥物干擾結(jié)果見下表。

7)穩(wěn)定性：本試劑盒2～8℃保存12個(gè)月，試劑盒分析性能仍穩(wěn)定。

實(shí)施例4.本發(fā)明所述的試劑盒與現(xiàn)有進(jìn)口試劑盒的臨床比對(duì)結(jié)果

共檢測323例臨床樣本，同時(shí)對(duì)本發(fā)明所述的試劑盒與現(xiàn)有的進(jìn)口肌紅蛋白檢測試劑盒(Beckman公司)進(jìn)行檢測，通過Medcalc統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性及一致性分析。

1)相關(guān)性分析

以現(xiàn)有進(jìn)口試劑A的臨床測定結(jié)果為X軸，本發(fā)明所述的試劑盒的臨床測定結(jié)果為Y軸，繪制散點(diǎn)圖，進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)性方程為：y＝0.9879x-8.7484(P<0.001)；相關(guān)性系數(shù)：r＝0.9940，兩者的測定結(jié)果相關(guān)性良好。

2)一致性分析

采用Bland-Altman統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)兩組測定結(jié)果進(jìn)行分析，以每個(gè)樣本的測定結(jié)果的比值作為縱坐標(biāo)，兩者的測定結(jié)果的均值作為橫坐標(biāo)作圖。計(jì)算所有比值的平均值(A)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并根據(jù)公式A±1.96SD得到95％的一致性界限范圍。本次臨床試驗(yàn)中A＝0.95，SD＝0.24，因此95％的一致性界限范圍為：0.47-1.42。上述結(jié)果顯示，95.05％(307/323)的測定結(jié)果在上述范圍內(nèi)，兩者測定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有著一致性。

3)總結(jié)：

現(xiàn)有的Beckman公司的肌紅蛋白檢測試劑盒是目前臨床上用于肌紅蛋白測定市場份額最高的產(chǎn)品之一，其試劑盒的臨床性能已被臨床廣泛接受。本發(fā)明所述的試劑盒在臨床試驗(yàn)比對(duì)中，與進(jìn)口試劑的結(jié)果相關(guān)性及一致性高度吻合，能滿足目前市場上對(duì)肌紅蛋白測定的需求，且生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于該試劑盒。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。