本發(fā)明涉及免疫學檢測領域，更具體地涉及一種C反應蛋白免疫熒光定量試紙條及其制備方法。

背景技術：

C反應蛋白(C-reaction,CRP)是由肝臟合成的一種急性時相蛋白，痕量存在于健康人血清中，當機體受到感染或組織損傷時含量迅速升高，隨著病情改善或組織結(jié)構功能的恢復其含量恢復到正常水平。根據(jù)血清、血漿或全血中CRP的濃度水平，可以有效的判斷有無感染、疾病的危險程度及疾病是否處于活動期。因此，CRP作為全身性炎癥反應早期檢測的靈敏指標，已在臨床許多疾病的診斷、治療和預后中廣泛應用。

目前CRP的檢測方法有免疫擴散法、乳膠凝集法、免疫標記法、速率散射比濁法及免疫透射比濁法。其中，免疫擴散法特異性高、重復性好、操作簡單、價格低廉、不需要特殊儀器，但是敏感性較差；乳膠凝集法操作簡單、快速、特異性較高，但易受補體、類風濕因子等干擾，產(chǎn)生假陽性結(jié)果；速率散射比濁法和免疫透射比濁法的檢測時間、操作方法、結(jié)果精確度、重復性、靈敏度方面均較優(yōu)，但需要配備大型的全自動蛋白分析儀。

免疫熒光標記是免疫層析技術和熒光標記技術的結(jié)合，被廣泛應用于多類抗原物質(zhì)的檢測，具有檢測儀器精巧輕便、操作簡單迅速、結(jié)果精準等優(yōu)點。因此，制備和生產(chǎn)C反應蛋白免疫熒光定量試紙條非常有市場價值。然而，要實現(xiàn)C反應蛋白免疫熒光定量試紙條的制備和長期保存，儲存液是關鍵之一。儲存液的好壞關乎試紙條的準確度和保存期，因此，通過改進儲存液，開發(fā)高準確度的C反應蛋白免疫熒光定量試紙條非常有現(xiàn)實意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種C反應蛋白免疫熒光定量試紙條及其制備方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種C反應蛋白免疫熒光定量試紙條，包括吸水墊、硝酸纖維素膜、質(zhì)控線、檢測線、結(jié)合墊、樣品墊、PVC底板；其中，結(jié)合墊上噴有C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物；檢測線為C反應蛋白一抗，質(zhì)控線為C反應蛋白二抗，且檢測線和質(zhì)控線依次固定于硝酸纖維素膜上；樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次搭接并承載于PVC底板；C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物使用儲存液進行浸漬處理、保存和稀釋；所述的儲存液配方為：PB的質(zhì)量濃度為15～25mM、BSA的百分濃度為1.6％～2％、Tween-80的百分濃度為0.4％～0.6％、葡萄糖的百分濃度為0.4％～0.6％、甘氨酸的百分濃度為1.5％～2.5％、PEG4000的百分濃度為0.8％～1.2％、PEG20000的百分濃度為1％～2％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.01％～0.1％。

作為優(yōu)選的儲存液配方，PB的質(zhì)量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％、葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.03％。

試紙條加樣層析后，檢測質(zhì)控線和檢測線的熒光信號強度，并以質(zhì)控線熒光信號強度校正檢測線的熒光信號強度，實現(xiàn)C反應蛋白的定量檢測。

一種C反應蛋白免疫熒光定量試紙條的制備方法，包括如下步驟：

(1)將熒光微球活化后與C反應蛋白一抗偶聯(lián)，偶聯(lián)完畢后加入封閉劑，保存于儲存液中；

(2)將C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物用儲存液稀釋后，噴于結(jié)合墊上，干燥保存；

(3)將C反應蛋白一抗固定于硝酸纖維素膜上作為檢測線，將C反應蛋白二抗固定于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線；

(4)在PVC底板上依次搭接地粘貼：樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，并剪切成適當寬度即成為C反應蛋白免疫熒光定量試紙條，其中，樣品墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜或濾血膜，結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜；

上述的儲存液配方為：PB的質(zhì)量濃度為15～25mM、BSA的百分濃度為1.6％～2％、Tween-80的百分濃度為0.4％～0.6％、葡萄糖的百分濃度為0.4％～0.6％、甘氨酸的百分濃度為1.5％～2.5％、PEG4000的百分濃度為0.8％～1.2％、PEG20000的百分濃度為1％～2％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.01％～0.1％。

作為優(yōu)選的儲存液配方，PB的質(zhì)量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％、葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300或疊氮鈉的百分濃度為0.03％。

C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物在儲存液中的保存濃度為0.1～10mg/mL。

本發(fā)明的有益效果是：

相對于普通儲存液制備的試紙條，本發(fā)明所制備的C反應蛋白免疫熒光定量試紙條存儲穩(wěn)定性更佳，精密度更好，檢測樣品的出峰具有更高的信號和較平整的基線，準確度較高。

附圖說明

圖1：優(yōu)選的儲存液制備的C反應蛋白免疫熒光定量試紙條檢測芬蘭ORION DIAGNOSTICA的C反應蛋白標準曲線；

圖2：優(yōu)選的儲存液制備的C反應蛋白免疫熒光定量試紙條檢測C反應蛋白重組抗原的檢測值與理論值散點圖；

圖3：不同儲存液制備的試紙條檢測含不同濃度C反應蛋白的病人血清樣本的熒光檢測折線圖；

圖4：不同儲存液制備的試紙條檢測含C反應蛋白的病人血清樣本檢測值與芬蘭ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP檢測值的相關圖。

具體實施方式

實施例1

C反應蛋白免疫熒光定量試紙條的制備過程如下：

(1)優(yōu)選儲存液的制備：PB的質(zhì)量濃度為20mM、BSA的百分濃度為1.8％、Tween-80的百分濃度為0.5％，葡萄糖的百分濃度為0.5％、甘氨酸的百分濃度為2％、PEG4000的百分濃度為1％、PEG20000的百分濃度為1.5％、Proclin300百分濃度為0.03％，按上述配方配制混勻后過濾除菌，制得儲存液；

(2)樣品墊的制備：用樣品墊處理液浸泡玻璃纖維膜10min，置于干燥間37℃濕度30％，烘干3h，制得樣品墊，備用；

(3)結(jié)合墊的制備：用結(jié)合墊處理液浸泡玻璃纖維素膜10min，浸泡處理后，置于干燥間37℃濕度30％，烘干3h，制得結(jié)合墊，備用；

(4)將1mg的200nm聚苯乙烯熒光微球先后加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS，在活化緩沖液37℃活化1h；

(5)加入0.1mgC反應蛋白一抗(鼠源C反應蛋白單克隆抗體)，在200μL偶聯(lián)緩沖液中與熒光微球偶聯(lián)，完畢后加入封閉液20μL，制得C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物，18000rpm離心15min后，加入200μL儲存液，制得C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物濃度為5mg/mL，2～8℃保存；

(6)用儲存液將C反應蛋白一抗-熒光微球偶聯(lián)物稀釋到0.5mg/mL，用噴金劃膜儀噴于經(jīng)結(jié)合墊處理液處理后的結(jié)合墊上，用鼓風干燥箱干燥7h。鋁箔袋密封置于20-25℃、濕度約30％的條件下存放備用；

(7)將1mg/mLC反應蛋白二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗體)和1mg/mLC反應蛋白一抗分別用包被液包被，以條帶狀1.0mm用噴金劃膜儀分別固定于硝酸纖維素膜上分別作為質(zhì)控線和檢測線；

(8)在PVC底板上依次搭接地粘貼：樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙，并剪切成寬度4.1mm即成為C反應蛋白免疫熒光定量試紙條；

(9)將切好的試紙條裝卡，過壓殼機，準備檢測；

(10)樣品墊處理液：100mMPBS、1％Triton、0.75％BSA、0.5％PVA、0.9％NaCl、0.3％葡聚糖、0.05％Proclin300，pH7.8；

(11)結(jié)合墊處理液：2％Tween-80、1.5％PVA、0.5％BSA、1％海藻糖，PH7.05-7.10；

(12)活化緩沖液為75mM MES，pH5.5；

(13)偶聯(lián)緩沖液：20mM PB，pH7.5；

(14)封閉液：20％BSA；

(15)包被液：20mMPBS，1.2％異丙醇、0.4％葡聚糖20000、1.5％BSA、0.5％Tween-80、0.03％Proclin300，pH7.0。

實施例2

將實施例1制備的C反應蛋白免疫熒光定量試紙條建立標準曲線并進行檢測，實施方法如下：

(1)建立標準曲線：用國際臨床化學聯(lián)合會(IFCC)C反應蛋白標準品濃度為41.2mg/L稀釋至5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL八個濃度。用制備好的試紙條加樣80μL上免疫熒光分析以檢測，每個濃度重復3次取平均值。以檢測線所出的T峰面積和質(zhì)控線所出的C峰面積的比值為縱坐標，標準品理論值為橫坐標。

標準曲線如圖1所示；y＝0.0174x+0.0785，R²＝0.9933，用該方程可計算樣品中的C反應蛋白含量，實現(xiàn)定量，且相關性好。

(2)樣品檢測：用抗原稀釋液對C反應蛋白重組抗原倍比稀釋至5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL八個濃度。抗原稀釋液：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，PH7.2；將求得T/C峰面代入y＝0.0174x+0.0785中Y，求得X為所測抗原值，

如圖2所示，可以看出實施例2制備的試紙條檢測值與理論值偏差小(R²＝0.996)，檢測的準確率高。

實施例3

配制對照儲存液，具體配方為：PB的質(zhì)量濃度為50mM、BSA的百分濃度為1％、Tween-80的百分濃度為1％，葡萄糖的百分濃度為1％、甘氨酸的百分濃度為0.5％、PEG4000的百分濃度為2％、Proclin300百分濃度為0.3％。

采用實施例1制備的優(yōu)選儲存液(以下簡稱儲存液2)與對照儲存液(以下簡稱儲存液1)進行助穩(wěn)性能和精密度對比，實施方法和結(jié)果如下：

用儲存液1和儲存液2，對相同工藝標記的C反應蛋白(CRP)一抗-熒光微球進行噴膜干燥，分別組裝成40個試紙條，放鋁箔袋、干燥劑封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(對照組)，另外一袋放置溫箱37℃加速7天。完整7天后，取出卡條，分別加入濃度為5ng/mL和50ng/mL的CRP重組抗原檢測。根據(jù)理論37℃加速7天相當于4℃保存1年，模擬1年后的抗原檢測情況，結(jié)果如下表1、表2所示。

表1、2種儲存液制得的試紙條測試5ng/mL CRP重組抗原的效果對比

表2、2種儲存液制得的試紙條測試50ng/mL CRP重組抗原的效果對比

從表1、2得出，優(yōu)選的儲存液2制備的試紙條在37℃加速七天后，檢測值下降比例小于8％，且精密度較好；而對照儲存液1制備的試紙條在37℃加速七天后，檢測值下降30％以上，精密度相對較差。

實施例4

用儲存液1和儲存液2(同實施例3)，對相同工藝標記的C反應蛋白一抗-熒光微球進行噴膜干燥，組裝好試紙條，分別用濃度為2mg/mL、5mg/mL、16mg/mL、34mg/mL、184mg/mL的含C反應蛋白的芬蘭ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP賦值的病人全血樣本對兩種試紙條加樣檢測，隨后用配套檢測儀器對試紙條窗口信息進行讀取。通過儀器激光對窗口的熒光微球進行激發(fā)，再采集窗口300個位置(作橫坐標)的發(fā)射熒光強度(作縱坐標)，利用熒光分析軟件將300個點按順序連在一起形成折線圖。

如圖3所示，折線圖可反映熒光微球在NC膜上的跑膜情況，圖中有兩個峰，左邊為T峰(對應肉眼視卡條為檢測線)，右邊為C峰(對應肉眼視卡條為質(zhì)控線)，使用儲存液2的整體出峰效果較好，說明儲存液2對抗體-熒光微球偶聯(lián)物從結(jié)合墊釋放到NC膜效果較好。使用儲存液1的則出峰信號不高，基線不平整，前段抬起較明顯，影響軟件對峰面積的計算，進而影響讀值的準確度。

實施例6

用儲存液1和儲存液2(同實施例3)，對相同工藝標記的C反應蛋白一抗-熒光微球進行噴膜干燥，分別組裝15個試紙條，用15個不同濃度的含C反應蛋白抗原的病人全血樣本同時對兩種試紙條加樣檢測。由于C反應蛋白在病人樣本濃度較大，本實施例稀釋200倍檢測。用配套檢測儀器對試紙條窗口信息進行讀取，用熒光分析軟件計算T峰面積與C峰面積，同時用該項目準確度較高的芬蘭ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP(POCT免疫比濁儀)檢測的結(jié)果值。

以QuikRead CRP評價2種儲存液制備的試紙條檢測結(jié)果的臨床診斷準確性。如圖4所示，縱坐標為T峰面積/C峰面積，橫坐標QuikRead CRP結(jié)果值，儲存液2制備的試紙條檢測結(jié)果與芬蘭ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP儀器檢測結(jié)果較吻合(R²＝0.981)，而儲存液1的全血線性相關較差(R²＝0.873)，重復性也不好。這與前述儲存液2讓抗體-熒光微球釋放效果更好，軟件計算面積更加準確有關。