本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測方法，應用流式細胞術檢測B-NHL腫瘤細胞的CD20、CD22抗原表達量。

背景技術：

惡性淋巴瘤是發(fā)生于淋巴結和(或)結外淋巴組織的腫瘤，是一組可以高度治愈的腫瘤。對于淋巴瘤目前國際上統(tǒng)一分為兩大類，即霍奇金淋巴瘤(H odgkin Lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)。NHL根據(jù)淋巴細胞起源的不同，又可分為B細胞、T細胞和自然殺傷(Natur al Killer,NK)細胞淋巴瘤，其中約70％～85％的NHL來源于B淋巴細胞。2008年的WHO病理分類將NHL分為更多種不同的疾病體和亞型，其中彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是NHL中最常見的類型，占成人NHL的30％～40％；濾泡淋巴瘤(FL)是惰性NHL中最常見類型；套細胞淋巴瘤(MCL)約占NHL發(fā)病率的3％～10％；伯基特淋巴瘤(Burkitt’s Lymphoma)占全部NH L發(fā)病率的3％～5％，占兒童NHL的40％。

目前惡性淋巴瘤的主要治療手段包括化療、放療和生物免疫治療。造血干細胞移植可以作為某些年齡小于60歲、一般狀態(tài)良好的對化療敏感的高危初治和復發(fā)患者的選擇。以DLBCL為例，20年來CHOP方案一直是其標準的一線化療方案。最近10年來其治療取得了巨大進步，主要體現(xiàn)在劑量密度/劑量強度化療和利妥昔等單克隆抗體用于一線治療，使患者的生存率有了進一步提高。高劑量化療聯(lián)合自體造血干細胞移植是一種增加劑量強度的治療，一些研究應用高劑量化療作為鞏固治療，成功減低了年輕、高?；颊叩膹桶l(fā)。

單克隆抗體是B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交形成的雜交瘤細胞產(chǎn)生的，其重鏈和輕鏈所形成的結構域可以識別和結合特異抗原。近年來是單克隆抗體發(fā)展的黃金期，單克隆抗體藥物以其高特異性、有效性和安全性正在發(fā)展成為國際藥品市場上一大類新型診斷和治療藥物，日益成為癌癥及其他疾病治療市場的新寵。95％以上的B-NHL有CD20抗原的表達，CD20抗原可作為免疫治療B細胞淋巴瘤的理想作用位點。CD20抗原是一種非糖基化的細胞膜磷蛋白，其分子量為3500kd，目前研究發(fā)現(xiàn)，CD20抗原是信號傳遞通道復合物的一部分，其功能類似于鈣離子通道，參與調節(jié)B淋巴細胞的生長和分化。CD20抗原的表達嚴格限制在前B淋巴細胞的晚期和成熟B淋巴細胞，在造血干細胞、祖細胞和其它正常組織中沒有CD20抗原的表達。當B淋巴細胞分化為分泌抗體的漿細胞時，CD20抗原的表達也隨之消失。

利妥昔單克隆抗體(Manthera,美羅華)是由羅氏制藥公司生產(chǎn)的抗CD20嵌合型單克隆抗體。它能特異性地與B淋巴細胞表面CD20抗原結合，通過補體依賴的細胞毒作用、抗體依賴的細胞毒作用和誘導細胞凋亡清除體內(nèi)的B淋巴細胞。1997年11月，F(xiàn)DA批準將Manthera應用于復發(fā)或難治性的CD20陽性B細胞低度惡性或濾泡型淋巴瘤，目前Manthera也正式用于中、高度惡性淋巴瘤或與其它藥物聯(lián)用，而且具有很好的治療效果。

CD22分子是一個跨膜唾液酸糖蛋白，為免疫球蛋白超家族的成員之一，其分子量為130～140KD。CD22表達于成熟B淋巴細胞、晚期前B淋巴細胞及早期前B淋巴細胞的胞質中，分化為漿細胞后消失，CD22與B細胞的發(fā)育密切相關。CD22可以在85％以上的B-NHL中檢測到。依帕珠單克隆抗體(E pratuzumab)是繼Manthera之后，又一個針對B細胞抗原CD22的單克隆抗體。CD22與抗體結合后，迅速發(fā)生抗原抗體復合物的細胞內(nèi)化，繼而使得胞內(nèi)部分的CD22分子發(fā)生磷酸化而影響B(tài)CR的功能。Epratuzumab的抗腫瘤作用，可能是由于Epratuzumab與CD22分子結合后，干擾了細胞信號的正常傳導，從而使細胞更容易發(fā)生凋亡。Ⅰ期和Ⅱ期臨床研究顯示，Epratuzumab的毒副作用輕，耐受性良好，對于濾泡型和彌漫大B細胞型淋巴瘤有較好療效，且可能與Manthera具有協(xié)同作用，很有希望成為治療B細胞NHL的治療藥物。

傳統(tǒng)檢測B-NHL細胞表面抗原表達的方法為免疫組化法，是應用免疫學基本原理，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及相對定量的研究。因為免疫組化法的結果需要人工通過顯微鏡或熒光顯微鏡觀察，結果易受主觀影響，且不能用于抗原分子的表達定量檢測中。另外當患者經(jīng)過單抗藥物治療后，標本中的細胞數(shù)量會出現(xiàn)明顯減低，因免疫組化法的靈敏度有限，很容易造成假陰性的結果。免疫組化檢測的樣本多為淋巴結活檢標本，而一些不易取材或無明顯病灶的淋巴瘤則無法應用免疫組化方法進行檢測。

酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme Linked Immμnosorbent Assay,ELISA)是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，進行定量測定。目前已建立了ELISA檢測CD20、CD22單克隆抗體的方法。已開發(fā)出相應的商品化試劑盒，可以檢測血清、血漿、組織勻漿液、細胞上清培養(yǎng)液等樣本中的含量。但是ELISA方法僅可檢測液體中可溶性蛋白的含量，即檢測B細胞分泌到血液或骨髓中的CD20、CD22抗體的含量而無法直接檢測細胞表面的抗原表達量，且此方法容易受抗體、時間、溫度等干擾，出現(xiàn)假陽性。

隨著單克隆抗體藥物的快速發(fā)展與廣泛應用，尋找到一種快速、方便、靈敏及準確評價單抗藥物療效的方法也變得尤為重要。且單克隆抗體藥物價格昂貴，從衛(wèi)生經(jīng)濟學考慮也需要有一種檢測手段可以評價用藥效果。放射性核素標記方法可測定每個細胞表面某種分子的數(shù)目，具有特異性強且靈敏度高的特點。放射性核素標記方法是將非標記抗原與放射性標記抗原同時競爭結合物(如抗體)上有限的結合位點，然后將結合抗原和未結合的游離抗原分離，用儀器測定放射性分布，利用標準曲線確定樣本中待測物含量。但缺點是受核素半衰期的限制且需特別防止其放射性污染。而且目前國內(nèi)尚未開發(fā)出用于CD20、CD22檢測的放射免疫測定試劑盒。

綜上所述，如何對B淋巴細胞的CD20和CD22抗原表達實現(xiàn)快速、準確的定量檢測分析，成為當前亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中B淋巴細胞CD20和CD22抗原表達定量分析技術的不足，提供了B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測試劑盒及檢測方法，可快速、準確的實現(xiàn)對B淋巴細胞CD20和CD22抗原表達的定量檢測分析，有效的指導相應單抗藥物對B-NHL的靶向治療。

為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明實施例提供的一種技術方案為：

一種B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測試劑盒，其試劑包括不同的熒光標記的抗CD45抗體和抗CD19抗體，以及抗CD20或CD22抗體。

優(yōu)選的，所述抗CD45抗體的熒光標記為Percp。

優(yōu)選的，所述抗CD19抗體的熒光標記為APC。

優(yōu)選的，所述抗CD20或CD22抗體的熒光標記為PE。

作為前述技術方案的優(yōu)選，所述試劑還包括紅細胞裂解液和磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)。

本發(fā)明實施例提供的另一種技術方案為：

一種B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測方法，包括步驟如下：

S1.采集檢測標本：抽取B淋巴細胞非霍奇金淋巴瘤患者的外周血或骨髓作為檢測標本；

S2.加入抗體及熒光染色：將所述檢測標本中加入使用不同的熒光標記的抗CD45抗體和抗CD19抗體，以及抗CD20或CD22抗體，并混勻；

S3.流式細胞術檢測：對所述檢測標本進行孵育和紅細胞裂解后，使用流式細胞術進行檢測，設門分型得到CD19⁺CD20⁺或CD19⁺CD22⁺的靶標細胞熒光強度；

S4.測定標準曲線：使用流式細胞術在所述檢測標本同等條件下測定Qua ntiBRITE PE Beads熒光，獲得Beads(微球)平均熒光強度與抗原表達量的標準曲線；

S5.計算抗原表達量：將所述靶標細胞熒光強度值代入標準曲線換算得到所述檢測標本中B淋巴細胞CD20或CD22平均抗原表達量。

優(yōu)選的，執(zhí)行步驟S2前，對所述檢測標本進行白細胞計數(shù)，將所述檢測標本的細胞濃度調至3×10⁷/mL。

優(yōu)選的，步驟S4測定所述標準曲線時，使用流式細胞儀檢測QuantiBRIT E PE Beads熒光強度，以前向角/側向角設門得到Beads；根據(jù)PE熒光強度在將Beads分群，并得到每群Beads的熒光強度均值；根據(jù)Beads提供的分子量和得到的所述每群Beads的熒光強度均值擬合得到所述標準曲線。

優(yōu)選的，步驟S2中，加入所述檢測標本的所述不同的熒光標記的抗體為：CD45Percp和CD19APC，以及CD20PE或CD22PE。

優(yōu)選的，對所述檢測標本進行設門分型時，在CD45Percp-SSC圖中設門得到CD45陽性的淋巴細胞，進一步在CD45Percp-CD19APC圖中設門得到CD45⁺CD19⁺的B淋巴細胞；進一步在CD19APC-CD20PE圖中設門得到所述CD19⁺CD20⁺的靶標細胞，或在CD19APC-CD22PE圖中設門得到所述CD19⁺CD22⁺的靶標細胞。

流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其它生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好、靈敏度高、環(huán)境友好、操作簡便等優(yōu)點。流式細胞術可以同時檢測樣本細胞的前向角散射(Forward Scatter,FSC)、側向角散射(Side Scatter,SSC)及多個熒光通道強度，通過選擇合適的熒光抗體及正確的設門可以準確知道各群細胞的抗體表達情況，傳統(tǒng)的流式細胞術主要是測定表達目標抗原細胞所占的比例，以及對目標抗原的表達做定性分析，即判斷抗體表達是否為陰性、弱陽性或強陽性，而很少對抗體表達做定量分析。

本發(fā)明以流式細胞術為基礎，通過引入PE微球的方法檢測患者外周血及骨髓中正?；虍惓淋巴細胞CD20、CD22的抗原表達量，與現(xiàn)有的其它檢測方法比較，具有可以定量檢測，可直接檢測細胞表面的抗原表達量，可直觀的反映B-NHL的特點；其所用標本量少，操作簡單、快捷，無環(huán)境污染。定量檢測結果可用于指導臨床CD20、CD22單抗藥物對B-NHL的靶向治療，以及對治療預后進行判斷。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明實施例B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測方法的基本流程圖；

圖2所示為本發(fā)明實施例中QuantiBRITE PE Beads的微球PE熒光強度的Count-PE直方圖；

圖3所示為本發(fā)明實施例中測定獲得微球平均熒光強度和抗原表達量對數(shù)值的標準曲線；

圖4所示為本發(fā)明實施例一使用BD FACSDIVA軟件分析數(shù)據(jù)樣本管獲得的B淋巴細胞分型結果，得到的是CD20⁺的靶標細胞；

圖5所示為本發(fā)明實施例二使用BD FACSDIVA軟件分析數(shù)據(jù)樣本管獲得的B淋巴細胞分型結果，得到的是CD22⁺的靶標細胞。

具體實施方式

以下結合附圖通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便更好地理解本發(fā)明。

本發(fā)明的技術方案將所述試劑盒應用于所述檢測方法，使用流式細胞術檢測B-NHL患者外周血及骨髓中的B淋巴細胞的CD20和CD22抗原表達量。

本發(fā)明一種B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測試劑盒的實施例，其試劑包括不同的熒光標記的抗CD45抗體和抗CD19抗體，以及抗CD20或抗C D22抗體。

作為一種優(yōu)選的實施方式，前述試劑盒中，抗CD45抗體的熒光標記為P ercp，抗CD19抗體的熒光標記為APC，抗CD20或CD22抗體的熒光標記為PE；試劑還可包括紅細胞裂解液和PBS。

實施例一：

本發(fā)明一種B細胞惡性腫瘤相關抗原表達量檢測方法的實施例，如圖1所示，包括步驟如下：

S1.采集檢測標本：抽取B-NHL患者的外周血或骨髓作為檢測標本；

S2.加入抗體及熒光染色：將檢測標本中加入使用不同的熒光標記的抗C D45抗體、抗CD19抗體和抗CD20抗體并混勻；

S3.流式細胞術檢測：對檢測標本進行孵育和紅細胞裂解后，使用流式細胞術進行檢測，設門分型得到CD19⁺CD20⁺的靶標細胞熒光強度；

S4.測定標準曲線：使用流式細胞術在檢測標本同等條件下測定QuantiB RITE PE Beads熒光，獲得Beads平均熒光強度與抗原表達量的標準曲線；

S5.計算抗原表達量：將靶標細胞熒光強度值代入標準曲線換算得到檢測標本中標靶細胞表面CD20抗原表達量。

具體的檢測技術方案如下：熒光標記的抗體使用CD45Percp/CD19APC/CD20PE；

試劑用量及添加標準，標本與抗體的添加比例為：細胞濃度調至3×10⁷個/mL，向流式管中加70μL標本；單次檢測(test)中，試劑按照試劑說明添加CD45Percp 10μL/test、CD19APC 5μL/test、CD20PE 20μL/test，確保抗體充足；

使用美國BD公司(Becton,Dickinson and Company)的QuantiBRITE P E Beads，同時根據(jù)QuantiBRITE PE Beads中不同Beads群的平均熒光強度及Beads上的分子量繪制標準曲線。將檢測標本中粒細胞的CD20的平均熒光強度帶入標準曲線，計算出中性粒細胞上CD20的平均抗原表達量。

作為一種優(yōu)選的實施方式，具體操作流程為：

步驟S1中，抽取B-NHL患者的外周血作為檢測標本，對檢測標本進行白細胞計數(shù)，將細胞濃度調至3×10⁷/mL；

步驟S2中，取一支專用的流式管，向流式管中加入CD45-Percp 10μL、CD19APC 5μL、CD20PE 10μL；向流式管內(nèi)加入檢測標本70μL，低速渦旋混勻；

步驟S3中，將混勻檢測標本室溫避光孵育20min；向流式管內(nèi)加入紅細胞裂解液1mL，低速渦旋混勻，室溫避光裂解紅細胞10min；裂解結束后立即以1500r/min離心5min，離心結束后棄上清，然后向管內(nèi)加入1mL PBS，低速渦旋混勻，以1500r/min離心5min；離心結束后棄上清；向管內(nèi)加入0.5mL的PBS重懸細胞，低速渦旋混勻，24h內(nèi)使用流式細胞儀上機檢測；在檢測時，調節(jié)好個通道電壓，收集P1門內(nèi)細胞100萬；

步驟S4中，取一支PE Beads，加入500μL緩沖液(0.3％甲醛溶液)，與前述檢測標本同樣條件使用流式細胞儀上機檢測；應用BD FACSDIVA軟件分析數(shù)據(jù)，在SSC-FSC散點圖中設門得到Beads，繪制如圖2所示的Count-P E的直方圖中，根據(jù)PE熒光強度的不同將Beads分為Low、MedLow、MedH igh和High四個群，得到每群Beads的熒光強度的均值；以Beads提供的分子量的對數(shù)值為橫坐標與測定獲得的Beads熒光強度均值的對數(shù)值為縱坐標，擬合得到如圖3的Beads熒光強度和抗原表達量的標準曲線；

步驟S5中，應用BD FACSDIVA軟件分析檢測標本的流式管，如圖4所示：

在CD45 Percp-SSC圖中設門得到CD45陽性且SSC較小的淋巴細胞，CD45 Percp-CD19 APC圖中設門的到CD45⁺CD19⁺的B淋巴細胞，在CD19 APC-CD20PE圖中得到CD19⁺CD20⁺的靶標細胞，讀取靶標細胞的熒光強度的均值，取對數(shù)代入Beads熒光強度和抗原表達量的標準曲線，得到CD20抗原表達量的對數(shù)值，從而得到B淋巴細胞的CD20平均抗原表達量。

實施例二：

本實施例與實施例一所用的試劑盒及檢測流程基本相同，區(qū)別在于將加入流式管試劑中的抗CD20抗體替換為抗CD22抗體，即熒光標記的抗體使用CD45 Percp/CD19 APC/CD22 PE；設門時也將針對CD20的設定改為針對CD22進行。

步驟S5中，應用BD FACSDIVA軟件分析檢測標本的流式管，如圖5所示：

在CD45Percp-SSC圖中設門得到CD45陽性且SSC較小的淋巴細胞，CD45 Percp-CD19 APC圖中設門的到CD45⁺CD19⁺的B淋巴細胞，在CD19 APC-CD22 PE圖中得到CD19⁺CD22⁺的靶標細胞，讀取靶標細胞的熒光強度的均值，取對數(shù)代入Beads熒光強度和抗原表達量的標準曲線，得到CD22抗原表達量的對數(shù)值，從而得到B淋巴細胞的CD22平均抗原表達量。

在本發(fā)明中，上標“+”代表陽性，即表示該抗原在細胞表面有表達。

若未特別指明，以上各實施例中所用技術手段為本技術領域技術人員的常規(guī)手段，所用原料均為可取得的市售產(chǎn)品。

應理解，上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于供本領域技術人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并非具體實施方式的窮舉，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍當中。