本發(fā)明涉及疾病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG免疫層析試紙條的制備方法。

背景技術(shù)：

在腫瘤檢驗(yàn)診斷學(xué)方法中，血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)已經(jīng)越來(lái)越引起人們的關(guān)注，這是因?yàn)檫@種方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，如簡(jiǎn)便無(wú)創(chuàng)，可以重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果直觀且可以定量，費(fèi)用相對(duì)較低等等，最重要的一點(diǎn)是對(duì)于血清腫瘤標(biāo)志物可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從而可以對(duì)惡性腫瘤的診斷、病情發(fā)展與療效等進(jìn)行判斷，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。腫瘤標(biāo)志物可以是在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的，存在于細(xì)胞、組織或體液中，能夠用一定方法來(lái)定量且能證實(shí)腫瘤存在的物質(zhì)；也可以是由于機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)異常產(chǎn)生或升高的，可以反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的、能夠監(jiān)測(cè)腫瘤治療和預(yù)后的一類物質(zhì)，它包括蛋白質(zhì)、激素、多胺及癌基因產(chǎn)物等，這些物質(zhì)在正常人的體內(nèi)不存在，或者在正常人體內(nèi)出現(xiàn)的水平顯著低于腫瘤患者體內(nèi)的水平。

絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。人絨毛膜促性腺激素(HCG)αβ，由合體滋養(yǎng)細(xì)胞合成。分子量為36700的糖蛋白激素，α亞基與垂體分泌的FSH(卵泡刺激素)、LH(黃體生成素)和TSH(促甲狀腺激素)等基本相似，故相互間能發(fā)生交叉反應(yīng)，而β亞基的結(jié)構(gòu)各不相似。β-HCG于β-LH結(jié)構(gòu)相近，但最后24個(gè)氨基酸延長(zhǎng)部分在β-LH中不存在。腫瘤標(biāo)志物可以對(duì)高危人群進(jìn)行篩查，通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者治療前后腫瘤標(biāo)志物的濃度變化可以判斷對(duì)腫瘤的治療是否有效。對(duì)生物體內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的一項(xiàng)重要課題，發(fā)展一種新的靈敏度高的檢測(cè)方法也成為研究者們努力的目標(biāo)。

量子點(diǎn)是在把導(dǎo)帶電子、價(jià)帶空穴及激子在三個(gè)空間方向上束縛住的半導(dǎo)體納米結(jié)構(gòu)。又可稱為納米晶，是一種由II－VI族或III－V族元素組成的納米顆粒。量子點(diǎn)的粒徑一般介于1～10nm之間，由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光?；诹孔有?yīng)，量子點(diǎn)在太陽(yáng)能電池，發(fā)光器件，光學(xué)生物標(biāo)記等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前量子點(diǎn)因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面，而免疫層析試紙條檢測(cè)則因?yàn)樗暮?jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫熒光試紙條，對(duì)絨毛膜促性腺激素HCG進(jìn)行檢測(cè)，建立絨毛膜促性腺激素HCG檢測(cè)的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于腫瘤標(biāo)志物在腫瘤檢測(cè)中的重要地位、量子點(diǎn)這種納米粒子獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及層析技術(shù)簡(jiǎn)便和價(jià)格方面的優(yōu)勢(shì)。我們將結(jié)合量子點(diǎn)和免疫層析試紙條兩種技術(shù)，利用量子點(diǎn)羧基和腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體的氨基反應(yīng)，制得量子點(diǎn)熒光探針。探針、腫瘤標(biāo)志物和包埋在試紙條的另一種腫瘤標(biāo)志物抗體通過(guò)抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)。對(duì)絨毛膜促性腺激素HCG，這種由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌糖蛋白進(jìn)行定性定量的檢測(cè)，建立腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法，致力于簡(jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、定性定量、操作簡(jiǎn)便的腫瘤早期診斷方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG免疫層析試紙條的制備方法；其步驟如下：

1)將量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和PBS緩沖液加入反應(yīng)器，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2～3h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

所述量子點(diǎn)QDs：絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)比＝1:10～50。

所述量子點(diǎn)QDs：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1:4000～10000。

所述PBS緩沖液為0.01M pH 7.4的PBS緩沖液，用以保持絨毛膜促性腺激素抗體的免疫活性。

所述結(jié)合墊處理液是含有質(zhì)量體積比5％的蔗糖、質(zhì)量體積比5％的牛血清白蛋白BSA、質(zhì)量體積比3％的聚乙二醇PEG、體積比2％的聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯Tween-20的PBS溶液；樣品墊處理液是體積比0.5％的Tween-20的PBS溶液。

通過(guò)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)的活化作用，量子點(diǎn)的羧基和絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂(分子量150000～200000)的氨基生成牢固的化學(xué)鍵，離心純化后分散在含牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，得到QDs-Ab₂的熒光探針。將絨毛膜促性腺激素β抗體Ab₁均勻噴在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線T，而將羊抗鼠抗體Ab₃硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線C。將試紙條的四個(gè)部分樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊以及硝酸纖維素膜組裝的一起，最后得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。滴加檢測(cè)樣品到樣品墊上，檢測(cè)樣品會(huì)在吸水墊的層析作用下向前移動(dòng)：如果檢測(cè)樣品有絨毛膜促性腺激素HCG存在，探針QDs-Ab₂、絨毛膜促性腺激素HCG和包埋在硝酸纖維素膜上的絨毛膜促性腺激素β抗體Ab₁通過(guò)抗體抗原之間的作用，在T線上形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)QDs-Ab₂-HCG-Ab₁，而在C線上形成QDs-Ab₂-Ab₃的結(jié)構(gòu)，此時(shí)T線和C線同時(shí)亮；如果檢測(cè)樣品沒(méi)有絨毛膜促性腺激素HCG存在，則探針QDs-Ab₂僅僅和包埋在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠抗體，形成QDs-Ab₂-Ab₃的結(jié)構(gòu)，此時(shí)C線亮而T線不亮。

本發(fā)明制備的新型基于量子點(diǎn)的免疫層析試紙條優(yōu)勢(shì)在于：

1.采用量子點(diǎn)這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面的納米材料作為探針熒光來(lái)源，將納米技術(shù)應(yīng)用到腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域。

2.采用免疫層析技術(shù)作為檢測(cè)用的基材，免疫層析技術(shù)因?yàn)樗暮?jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。

3.采用量子點(diǎn)的羧基和抗體的氨基之間的反應(yīng)形成的牢固的化學(xué)鍵，而非傳統(tǒng)的靜電吸附作用，提高了試紙條抵抗非特異性吸附的能力，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和絨毛膜促性腺激素HCG濃度之間的關(guān)系可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)。

如圖1所示，本發(fā)明制備的量子點(diǎn)絨毛膜促性腺激素HCG試紙條所用量子點(diǎn)粒徑相對(duì)較大，但顆粒分散均勻，符合試紙條制備的條件；如圖2、3所示，本發(fā)明制備的量子點(diǎn)絨毛膜促性腺激素HCG試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-4E-07x²+0.0014x+0.2783R²＝0.9966；如圖4、5所示，本發(fā)明制備的量子點(diǎn)絨毛膜促性腺激素HCG試紙條非特異性吸附較低。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG試紙條的量子點(diǎn)電鏡照片。

圖2本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)紫外照片。

圖4本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG試紙條的特異性實(shí)驗(yàn)。

圖5本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的絨毛膜促性腺激素HCG試紙條的特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)紫外照片。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施案例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施案例1：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例2：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：30)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例3：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：50)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例4：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：6000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例5：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2.5h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例6：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體3h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例7：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)immune QDs；

2)將絨毛膜促性腺激素α抗體Ab₂和上述immune QDs混合(QDs和Ab₂質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到量子點(diǎn)-絨毛膜促性腺激素α抗體熒光探針QDs-Ab₂，然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封閉QDs-Ab₂熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用樣品墊處理液處理樣品墊、結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針溶液處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，每層疊加2～3mm，得到絨毛膜促性腺激素HCG量子點(diǎn)免疫層析試紙條。在樣品墊滴加濃度為1000、500、250、100、50、10mIU/mL的標(biāo)準(zhǔn)絨毛膜促性腺激素HCG，擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線；在樣品墊分別滴加PSA抗原、AFP抗原、CEA抗原、CA125抗原、CA153抗原、CA199抗原、FCS以及HCG，得出非特異性曲線。