本發(fā)明屬于電化學和生物傳感器領域，具體涉及一種硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器及其制備方法和應用。

背景技術：

目前，檢測硫酸根離子的方法主要有離子色譜法、重量法、滴定法、比濁法、分光光度法、電感耦合等離子發(fā)射光譜法等，但這些方法樣品存在前處理復雜、操作繁瑣、儀器昂貴、檢測靈敏度較低，或操作者技術要求高等缺點。

而酶抑制電化學生物傳感器由于儀器簡單、便宜、便攜、選擇性好、檢測限低、響應快、適于在復雜體系中應用等優(yōu)點，受到了越來越多的關注，研究(T.Cserfalvi,G.G.Guilbault.An enzyme electrode based on immobilized arylsulfatase for the selective assay of sulfate ion.Anal.Chim.Acta,34(1976)259–270)表明，硫酸根離子對芳基硫酸酯酶催化水解芳基硫酸酯鹽的反應具有抑制作用，抑制電化學活性產(chǎn)物的生成，使峰電流減小。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供了一種硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備方法。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了上述制備方法制備得到的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了上述硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的應用。

本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供了上述硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器在檢測領域方面的應用。

基于此，本發(fā)明將芳基硫酸酯酶固定在納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾的玻碳電極上構建硫酸根離子生物傳感器，結合納米材料的信號放大作用和理想的生物相容性，實現(xiàn)對硫酸根離子的快速靈敏檢測，這具有非常重要的意義。

技術方案：為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案為：一種硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)取石墨烯和多聚賴氨酸于超純水中超聲分散得到分散液；

2)取步驟1)得到的分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干；

3)將步驟2)得到的電極置于氯金酸和硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料；

4)將芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合得到混合溶液；

5)將步驟4)的混合溶液滴涂到步驟3)中的納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料表面得到修飾好的玻碳電極；

6)在步驟5)得到的修飾好的玻碳電極表面再修飾戊二醛，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

其中，上述步驟1)中石墨烯的用量為1mg，多聚賴氨酸(10％，w/V)的用量為30μL，超純水的用量為1mL，超聲分散半小時以上。

其中，上述步驟2)中的分散液的用量為4～14μL。

其中，上述步驟3)中的氯金酸濃度為0.1wt％，硝酸鉀濃度為0.1M，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間為30～100s。

其中，上述步驟4)芳基硫酸酯酶的濃度為2～30mg/mL，牛血清蛋白的濃度為0.1～2wt％。

其中，上述步驟5)中的混合溶液的用量為2～20μL。

其中，上述步驟6)中的戊二醛溶液的濃度為0.1～10wt％，用量為2～20μL。

本發(fā)明內容還包括上述的制備方法制備得到的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

本發(fā)明內容還包括上述的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器在檢測領域方面的應用。

本發(fā)明的內容還包括上述的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的分析方法，包括以下步驟：

1)在電解池中加入0.001～0.5M醋酸鹽緩沖溶液(pH 3.5～7.0)；

2)將權利要求1所述的芳基硫酸酯酶/納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾的玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系置于上述電解池中，利用差分脈沖伏安法進行掃描，產(chǎn)生的信號由電化學工作站檢測并由電腦顯示；

3)在電解池中加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，攪拌后利用差分脈沖伏安法進行掃描，產(chǎn)生的信號由電化學工作站檢測并由電腦顯示；

4)在電解池中加入硫酸根離子，攪拌后利用差分脈沖伏安法進行掃描，產(chǎn)生的信號由電化學工作站檢測并由電腦顯示。

其中，上述步驟4)的峰電流比步驟3)的峰電流小，且減小的峰電流與硫酸根離子的濃度成正比。

本發(fā)明的基本思路為：將石墨烯用多聚賴氨酸功能化后修飾到玻碳電極表面，再將該電極置于氯金酸和硝酸鉀的溶液中進行電沉積修飾納米金，然后修飾芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合物，最后修飾戊二醛，得到該傳感器。在0.001～0.5M醋酸鹽緩沖溶液(pH 3.5～7.0)中，加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，記錄峰電流，然后加入硫酸根離子，記錄峰電流。由于硫酸根離子能抑制芳基硫酸酯鹽的酶催化水解反應，抑制了電化學活性產(chǎn)物4-硝基鄰苯二酚的生成，從而使峰電流減小，并且抑制率隨著硫酸根離子濃度的增加逐漸增大。因此，利用抑制率和硫酸根離子的線性關系，可實現(xiàn)對硫酸根離子的檢測。抑制率的計算公式如下：

其中I％為抑制率，I₀為初始峰電流，I₁為加入硫酸根離子后的峰電流。

有益效果：與現(xiàn)有的常規(guī)金納米簇相比，本發(fā)明具有如下的特色和優(yōu)點：本發(fā)明成功制備了基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器，該發(fā)明首先用多聚賴氨酸功能化的石墨烯修飾玻碳電極，然后將修飾電極置于氯金酸和硝酸鉀溶液中恒電位沉積納米金，再將芳基硫酸酯酶和牛血清蛋白混合后修飾上述電極，最后在外面覆蓋戊二醛即得到該傳感器。此外，確立了一種基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的分析方法，本發(fā)明的優(yōu)點在于，一方面使用了芳基硫酸酯酶，利用其高效催化4-硝基鄰苯二酚硫酸酯鹽水解生成電化學活性產(chǎn)物4-硝基鄰苯二酚的性質，另一方面利用納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料具有高的比表面積、優(yōu)異的電性能和良好的生物相容性，作為固定載體能固定更多的芳基硫酸酯酶，從而構建更高效的傳感界面，加上差分脈沖伏安法的運用，使得傳感器更加靈敏準確。

附圖說明

圖1為本發(fā)明硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制作示意圖及檢測原理；

圖2為本發(fā)明實施例1硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器制作條件多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量優(yōu)化曲線圖；

圖3為本發(fā)明實施例2硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器制作條件納米金電沉積時間優(yōu)化曲線圖；

圖4為本發(fā)明實施例3硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器制作條件芳基硫酸酯酶濃度優(yōu)化曲線圖；

圖5為本發(fā)明實施例4硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器制作條件牛血清蛋白濃度優(yōu)化曲線圖；

圖6為本發(fā)明實施例5硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器制作條件戊二醛濃度優(yōu)化曲線圖；

圖7為本發(fā)明實施例6硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器分析條件緩沖液pH優(yōu)化曲線圖；

圖8為本發(fā)明實施例7硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器分析條件緩沖液濃度優(yōu)化曲線圖；

圖9為本發(fā)明實施例8硫酸根離子標準樣品檢測的線性曲線。

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明進一步說明。

本發(fā)明實施例中的石墨烯、氯金酸、玻碳電極、硝酸鉀、芳基硫酸酯酶、牛血清蛋白、4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽、多聚賴氨酸、戊二醛等等產(chǎn)品均為市面上購買得到，其中，芳基硫酸酯酶：Sulfatase from Helix pomatia(Type H-1)，購于Sigma-Aldrich；4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽，購于Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(東京化工有限公司)；多聚賴氨酸，Mw＝30000-70000，10％w/V)，購于Chengdu Xiya Chemical Co.,Ltd.(成都西亞化學有限公司)。

實施例1硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備

硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器即為基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器，該傳感器包括以下步驟：

1)取1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)超聲分散于1mL超純水中得到分散液；

2)取4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間為70s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

4)將5mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合；

5)取6μL上述混合溶液滴涂到3)所述電極表面；

6)在上述電極表面再修飾3μL戊二醛(1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

圖2為實施例1中多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量分別為4、6、8、10、12、14μL時所對應的電流信號圖。從圖中可以看出，當多聚賴氨酸-石墨烯分散液用量為10μL時得到的電流信號最大。

實施例2硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)超聲分散于1mL超純水中得到分散液；

2)取10μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極；

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間分別為30、40、60、70、80、90、100s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將5mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取2μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾2μL戊二醛(1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

圖3為實施例2中納米金電沉積時間分別為30、40、60、70、80、90、100s時所對應的電流信號圖。從圖中可以看出，當納米金電沉積時間為70s時得到的電流信號最大。

實施例3硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液；

2)取4μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間為70s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將濃度分別為2、5、10、15、20、30mg/mL芳基硫酸酯酶和0.1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合；

5)然后取20μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾20μL戊二醛(0.1wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

圖4為實施例3中芳基硫酸酯酶濃度分別為2、5、10、15、20、30mg/mL時所對應的電流信號圖。從圖中可以看出，當芳基硫酸酯酶濃度為5mg/mL時得到的電流信號最大。

實施例4硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液。

2)取14μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)再將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間為100s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將2mg/mL芳基硫酸酯酶和濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取10μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾10μL戊二醛(10wt％)，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

圖5為實施例4中牛血清蛋白濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2wt％時所對應的電流信號圖。從圖中可以看出，當牛血清蛋白濃度為1wt％時得到的電流信號最大。

實施例5硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的制備

1)將1mg石墨烯和30μL多聚賴氨酸(10％，w/V)于1mL超純水中超聲分散得到分散液。

2)取9μL上述分散液滴涂到磨好的玻碳電極表面并于紅外燈下烘干，得到多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

3)再將上述電極置于0.1wt％氯金酸和0.1M硝酸鉀溶液中電沉積修飾納米金，電沉積電位為–0.2V，電沉積時間為90s，得到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極。

4)將16mg/mL芳基硫酸酯酶和1wt％牛血清蛋白水溶液按體積比1:1混合，

5)然后取2～20μL上述混合溶液滴涂到納米金/多聚賴氨酸/石墨烯修飾玻碳電極表面。

6)最后在電極表面再修飾濃度分別為0.1、0.5、1、2.5、5、10wt％戊二醛10μL，制得硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器。

圖6為實施例5中戊二醛濃度分別為0.1、0.5、1、2.5、5、10wt％時所對應的電流信號圖。從圖中可以看出，當戊二醛濃度為1wt％時得到的電流信號最大。

實施例6硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的分析方法

將實施例1～5分別獲得的最佳的基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器進行檢測應用，分析方法包括：

將基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系,在電解池中分別加入不同pH(緩沖液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的0.1M醋酸鹽緩沖液，然后利用差分脈沖伏安法首先記錄加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽產(chǎn)生的電流信號，再記錄加入硫酸根離子的電流信號。根據(jù)抑制率的大小進行優(yōu)化。

圖7為實施例6中緩沖液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時對應的抑制率圖。從圖中可以看出當pH為5.0時對應的抑制率最大。

實施例7硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器的分析條件優(yōu)化

將實施例1～5分別獲得的最佳的基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器進行檢測應用，分析方法包括：

將基于芳基硫酸酯酶固定于納米金/多聚賴氨酸/石墨烯納米復合材料修飾玻碳電極構建的硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器、飽和甘汞電極和鉑電極組成三電極體系,在電解池中分別加入不同濃度pH 5.0醋酸鹽緩沖液(緩沖液濃度(M)分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5)的0.1M醋酸鹽緩沖液，然后利用差分脈沖伏安法首先記錄加入4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽產(chǎn)生的電流信號，再記錄加入硫酸根離子的電流信號。根據(jù)抑制率的大小進行優(yōu)化。

圖8為實施例7中緩沖液濃度(M)分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5時對應的抑制率圖。從圖中可以看出當緩沖液濃度為0.1M時對應的抑制率最大。

實施例8硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器檢測應用

如圖9所示，測定不同的硫酸根離子標準樣品，制得硫酸根離子標準曲線，為了考察該方法的實際應用可靠性，檢測了揚州市環(huán)保局提供的PM_2.5樣品中硫酸根離子的含量，結果如表1所示：

表1本方法和離子色譜法檢測PM_2.5樣品中硫酸根離子含量比較

添加量、檢測量和回收率是對本方法而言，回收率的測定結果表明本發(fā)明方法可行；離子色譜法作為公認較準確的檢測方法，本方法檢測結果與其檢測結果比較一致，說明本方法的準確性。

對比例1

將本發(fā)明硫酸根離子抑制型電化學生物傳感器與文獻已報道的硫酸根離子電化學傳感器進行了比較，結果如表2所示。

表2不同硫酸根離子電化學傳感器對比

上述僅為本發(fā)明優(yōu)選的實施例，這里無需也無法對所有的實施例來舉例說明。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出其它不同形式的變化或變動，這些也應屬于本發(fā)明的保護范圍。