本發(fā)明涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種螻蛄蟲草活性成分定量分析檢測方法。

背景技術(shù)：

螻蛄（Gryllotalpa），俗名耕狗、拉拉蛄、扒扒狗、土狗崽（西南地區(qū)）、蠹蚍（度比仔），可入藥，用于治療水腫、石淋、小便不利、瘰疬、臃腫惡瘡等。

蟲草屬（Cordyceps）是指真菌寄生于昆蟲，把蟲體變成充滿菌絲的僵蟲，從僵蟲前端生出有柄頭狀或棍棒狀的子座，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蟲草有400多種，多數(shù)都具有很高的藥用及食用價(jià)值，它的生理功效主要有防動脈硬化、降血脂、保護(hù)心腦組織和增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗菌、抗病等。

螻蛄蟲草（Gryllotalpa-Cordyceps）是在東北長白山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新物種，也稱為朝鮮蟲草，該蟲草的蟲體長約2厘米，草體5厘米左右，呈枯草黃。它是一種真菌與寄主昆蟲（螻蛄）的蟲菌復(fù)合體，菌體寄生于螻蛄體內(nèi)，吸取其營養(yǎng)，蟲身體內(nèi)存滿菌絲而死，菌絲從其頭、腹部等部位長出，形似草，故稱之為螻蛄蟲草。

蟲草中主要含有的活性成分包括肌苷、腺苷等核苷類物質(zhì)、蟲草酸（D-甘露醇）和氨基酸等。核苷類物質(zhì)能通過與嘌呤或嘧啶受體物質(zhì)的結(jié)合參與到人體眾多生理過程的調(diào)節(jié)中，而且，它作為形成核酸的前體物質(zhì)，還能夠幫助提高人體的免疫能力?，F(xiàn)代許多研究均表明蟲草素是蟲草所特有的有效成分，且具有許多生物活性，氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)并同生命活動有關(guān)的最基本的物質(zhì)，也是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一；基于這些特殊的生理活性，使得現(xiàn)有技術(shù)中對蟲草的核苷類物質(zhì)、蟲草酸和氨基酸的提取、純化、檢測方法成為研究重點(diǎn)。

目前對兩種蟲草的研究較多，一種是冬蟲夏草，另一種是蛹蟲草。衡量蟲草質(zhì)量的重要指標(biāo)是有效成分蟲草酸和蟲草核苷，目前這兩種主要有效成分的測定方法很多，且都已比較成熟；但不同的蟲草的成分及不同成分之間的含量也有較大的區(qū)別，所用到的檢測方法也都有所不同?，F(xiàn)有技術(shù)中并沒有螻蛄蟲草活性成分定量分析檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種螻蛄蟲草活性成分定量分析檢測方法。

本發(fā)明還提供一種螻蛄蟲草中核苷類物質(zhì)的定量分析檢測方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種螻蛄蟲草活性成分定量分析檢測方法，包括以下步驟：

（1）原料處理：將干凈的螻蛄蟲草的蟲體和草體分離，分別研磨成蟲粉和草粉；

（2）樣品儲備液的制備：將蟲粉和草粉溶解后，在30～70℃下超聲提取1～4h，超聲的頻率為20～40Hz，離心取上清液獲得樣品儲備液；

（3）蟲草酸的含量測定：

（4）核苷的含量測定：利用HPLC進(jìn)行測定，所述HPLC的條件為：0min，甲醇-水體積比為5：95；3min，甲醇-水體積比為10：90；8min，乙腈-水體積比為10：90；10min，甲醇-水體積比為5：95；

色譜柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）；

檢測波長：260nm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

進(jìn)樣量：10uL；

（5）氨基酸的含量測定。

優(yōu)選地，步驟（2）還可具體分為蟲粉和草粉的樣品儲備液的制備，若是蟲粉，即將蟲粉在50℃下，0～30Hz超聲提取2h；若是草粉，即將草粉在60℃下30～40Hz超聲提取3h。

本發(fā)明還提供一種螻蛄蟲草中核苷類物質(zhì)的定量分析檢測方法，是利用HPLC進(jìn)行測定，所述HPLC的條件為：

流動相：0min，甲醇-水體積比為5：95；3min，甲醇-水體積比為10：90；8min，乙腈-水體積比為10：90；10min，甲醇-水體積比為5：95；

色譜柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）；

檢測波長：260nm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

進(jìn)樣量：10uL。

本發(fā)明針對螻蛄蟲草，將蟲體與草體分別檢測，利于了解蟲體及草體各自的活性含量，并設(shè)置適宜的提取條件，減少長時(shí)間高頻率超聲對有效成分的損失，以提高螻蛄蟲草的應(yīng)用價(jià)值最大化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種螻蛄蟲草活性成分定量分析檢測方法，根據(jù)螻蛄蟲草的特性，從樣品提取開始，分別優(yōu)化出測定蟲草酸、核苷和氨基酸的方法，最終獲得了既快速準(zhǔn)確，又節(jié)約成本測定條件，該方法的檢測準(zhǔn)確度高，樣品添加回收率高，從而為螻蛄蟲草的檢測建立了體系，填補(bǔ)了螻蛄蟲草活性成分檢測的空白，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2到圖5分別是腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖6為螻蛄蟲草-蟲粉的腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷HPLC圖。

圖7為螻蛄蟲草-草粉的腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷HPLC圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1

一、原料處理

將螻蛄蟲草用潔凈軟毛刷輕刷，除去表面泥沙，用剪刀將蟲體和草體分離，分別稱取蟲體和草體0.6～0.7g，置于平面皿中，烘箱40℃，24h烘干稱量干重。蟲體和草體分開進(jìn)行液氮研磨，將研磨好的粉末保存于封口帶中，置于4℃冰箱保存，計(jì)算含水率，結(jié)果顯示蟲體和草體的含水量都不多，且二者差別不大（表1）。

表1 螻蛄蟲草含水率

二、樣品儲備液的制備

分別取螻蛄蟲草-蟲粉，螻蛄蟲草-草粉供試品0.5g，置于50mL離心管中，用超純水水溶，螻蛄蟲草-蟲粉在50℃下0～30 Hz超聲提取2h，草粉在60℃下30～40Hz超聲提取3h。用超純水補(bǔ)足失重，離心（4000r，5min)，取上清液于50mL離心管，再離心（4000r，5min)，取上清液于100mL容量瓶中定容，置于100mL棕色儲液瓶，4℃冰箱保存，即為樣品儲備液。

實(shí)施例2 蟲草酸含量測定

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取 0.15 g D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中，以超純水溶解并定容，搖勻。制成蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液（濃度為3000.0 μg/mL）。用超純水將標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液梯度稀釋成濃度為 15、30、45 、60、75和 90 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL加入試管中，空白對照管加蒸餾水1 mL，然后每管加入0.015 mol/L高碘酸鉀液1 mL，混勻，室溫放置10min，每個試管加0.1%鼠李糖2 mL，充分混勻后，加入Nash試劑4 mL，53℃水浴保溫15 min，即刻冷卻，分光光度計(jì)413 nm處測光吸收，根據(jù)甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收計(jì)算樣品中的甘露醇含量。

得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²等于0.9976，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合函數(shù)之間的吻合程度較高。結(jié)果準(zhǔn)確度高（圖1，表2）。

2、方法驗(yàn)證

以已知含量北蟲草為添加基質(zhì)，按樣品中D-甘露醇含量的80%、100%和 120%（以實(shí)際操作為準(zhǔn)）三個水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。每個添加水平重復(fù)三次試驗(yàn)。

準(zhǔn)確度系指測定的結(jié)果與真實(shí)值相符合的程度，可用來反映系統(tǒng)誤差的大小，一般通過加樣回收率實(shí)驗(yàn)來考察。通過回收率實(shí)驗(yàn)，可以檢查分析過程中測試成分的損失情況，從而評價(jià)此分析方法的可靠性和準(zhǔn)確度。在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意對照品的加入量，被測成分含有量與對照的加入量比值應(yīng)該適當(dāng)：過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分。同時(shí)應(yīng)該保證次定量分析過程中，測試結(jié)果與試樣中被測物質(zhì)濃度直接呈正比關(guān)系，即控制對照的加入量與供試品中被測成分的量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)。

由表3可知，D-甘露醇的添加回收率介于91.43～103.05%，該方法下的添加回收效果均較好，能夠滿足分析要求。

3、樣品測定

取步驟二制備的儲備液過0.45μm微孔濾膜，取0.03 mL，補(bǔ)水至1 mL，計(jì)算D-甘露醇含量，結(jié)果如表4，表4的結(jié)果是樣品濕重情況下的D-甘露醇含量，其含量草粉中高于蟲粉，但都處于高含量水平。

實(shí)施例3 核苷類化合物含量測定

1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品（腺苷、肌苷、尿苷、鳥苷四種核苷）于棕色進(jìn)樣瓶中，加入1 mL甲醇，渦旋混勻，制成單標(biāo)儲備液。各取0.2 mL單標(biāo)儲液于1 mL棕色進(jìn)樣瓶，渦旋混勻，制成混標(biāo)儲備液，置于4℃冰箱保存。

2、HPLC條件的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道腺苷、肌苷、尿苷、鳥苷四種核苷在250～260 nm的波長范圍內(nèi)吸收峰最顯著。于是將標(biāo)準(zhǔn)混合液分別在200～400 nm的范圍內(nèi)以二極管陣列檢測器進(jìn)行掃描。最終吸收峰最顯著波長為260 nm。

本文采用純水提取方法，通過改變流動相中水和乙腈的比例隨時(shí)間的變化規(guī)律，使 4 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合溶液達(dá)到分離。最終確定梯度洗脫程序。

通過反復(fù)試驗(yàn)，調(diào)整流動相梯度，優(yōu)化色譜條件，最終得到了既快速準(zhǔn)確，又節(jié)約成本的色譜條件（表5）。

HPLC條件：色譜柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）、檢測波長：260nm、柱溫：35℃、流速：1mL/min、進(jìn)樣量：10uL。

3、標(biāo)準(zhǔn)品線性方程

用單標(biāo)確定保留時(shí)間；用超純水將混標(biāo)儲備液梯度稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（5、10、20、50、100μg/mL），待上樣。每個濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液連續(xù)進(jìn)樣 3 次，取平均值計(jì)算。

在上述HPLC條件下4種核苷類標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的色譜圖如圖2到圖5。

4、回收率實(shí)驗(yàn)

以螻蛄蟲草-蟲粉和螻蛄蟲草-草粉樣品為添加基質(zhì)，按各樣品中各核苷類物質(zhì)含量的 50%、100%和150%三個水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。稱樣后添加上定量的標(biāo)準(zhǔn)品，渦旋混勻后室溫放置8min，之后按上面的提取、檢測方法進(jìn)行含量測定。每個添加水平重復(fù)三次試驗(yàn)。

由表6得螻蛄蟲草-蟲粉中肌苷、鳥苷、腺苷和尿苷的平均回收率在86.5～99.7%之間，RDS在1.0～6.4%之間。該方法下的回收率效果較好，能夠滿足分析要求。因此表明該方法的準(zhǔn)確度可靠。

5、精密度試驗(yàn)

取螻蛄蟲草-蟲粉提取液和螻蛄蟲草-草粉提取液連續(xù)進(jìn)樣 5 次，考察標(biāo)準(zhǔn)品和提取液中各目標(biāo)物在出峰時(shí)間、峰面積上的差異性。

由表7可知，樣品提取液在進(jìn)行 HPLC 測定時(shí)，無論出峰時(shí)間還是峰面積的精密度都很好，蟲粉和草粉中四種核苷的出峰時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別在0.05～0.14%之間和0.09～0.23%之間，峰面積的RSD在0.12～0.84%之間和0.11～0.93%之間，說明該方法下測定蟲草中蟲粉和草粉中核苷類物質(zhì)的精密度都很好。

6、樣品測定

取步驟二制備的樣品儲備液，將儲備液分別稀釋10倍、100倍。再將原儲備液和稀釋后儲備液分別過0.45μm微孔濾膜，置于2mL進(jìn)樣瓶中，各做3個平行，上機(jī)分析。

通過計(jì)算得出螻蛄蟲草-蟲粉含有尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷分別為2.862、0.431、2.117、0.1729 mg/g，草粉含有尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷分別為3.532、0.891、3.512、1.39 mg/g。結(jié)果顯示的最終含量是樣品濕重時(shí)含量。通過比較可以看出草粉中四種核苷的含量明顯高出蟲粉中四種核苷的含量。其中腺苷含量高出近10倍（表8）。從HPLC圖譜可以看出，樣品分離效果良好（圖6和圖7）。

實(shí)施例4 氨基酸測定

17種氨基酸測定：按照GB/T 5009.124-2003的方法進(jìn)行測定。

通過分析得螻蛄蟲草-蟲粉含粗蛋白為50.51%。螻蛄蟲草-草粉含粗蛋白為18.92%。都含有天門冬、蘇、絲、谷、脯、甘、纈、蛋、異亮、亮、苯丙、酪、賴、組、胱、半胱、精等17種氨基酸，其中以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、組氨酸含量最高，同時(shí)均含有8種人體必須氨基酸。且蟲粉中氨基酸各指標(biāo)都明顯高于草粉中含量。

通過以上對螻蛄蟲草蟲體和草體中的蟲草酸、四種核苷以及氨基酸的定量和定性的分析，可以得知螻蛄蟲草蟲體和草體中均含大量的核苷，其中草體中的核苷含量要高于蟲體。同時(shí)蟲體和草體中還含有大量種類豐富的氨基酸，蟲體中氨基酸含量要高于草體。蟲草酸（D-甘露醇）的含量在蟲體和草體也含量較高。因此螻蛄蟲草是具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值。

通過計(jì)算得出螻蛄蟲草-蟲體中蟲草酸含量為10.96%，草體中蟲草酸含量為12.75%。處于一個較高水平。