本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域,具體為應(yīng)用LGR4基因/蛋白作為藥物靶點(diǎn),篩選治療高膽固醇血癥的藥物。
背景技術(shù):
WHO最新公布的調(diào)查資料顯示,全球缺血性心臟病和中風(fēng)引起的死亡占死亡總數(shù)的四分之一,是目前多數(shù)國(guó)家最主要的死亡原因。高膽固醇血癥是缺血性心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,TC≥5.72mmol/L時(shí),急性冠心病發(fā)病危險(xiǎn)增加74%,在缺血性心血管病事件中,5.9%可歸因于高膽固醇血癥。因此,對(duì)降低血膽固醇水平的藥物的研究顯得尤為重要。
LGR4系G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員,位于染色體11p14區(qū)段,全長(zhǎng)約106Kb,含18個(gè)外顯子,編碼951個(gè)氨基酸,其中胞外548個(gè)氨基酸殘基,富含亮氨酸,有5個(gè)糖基化位點(diǎn),又屬于糖蛋白激素受體。近年研究將糖蛋白激素受體分為三類:第一類為經(jīng)典糖蛋白激素受體,包括FSHR(LGR1)、LHR(LGR2)、TSHR(LGR3);第二類包括LGR4、LGR5和LGR6,目前對(duì)這類受體的功能所知甚少;第三類包括LGR7(relaxin/insulin-like family peptide receptor 1,RXFP1)和LGR8(RXFP2)。前期研究認(rèn)為糖蛋白激素受體類的主要功能參與機(jī)體發(fā)育和生殖功能,但是最近幾年隨著干細(xì)胞及相關(guān)領(lǐng)域的不斷進(jìn)展,對(duì)LGR4-6的認(rèn)識(shí)亦日益深入全面。研究表明,LGR4可通過(guò)cAMP/PKA通路調(diào)控下游基因Atf4表達(dá)從而參與骨形成與重建;另外,LGR4敲除后下調(diào)靶基因Pitx2的表達(dá),導(dǎo)致小鼠眼前段發(fā)育不良;LGR4還可通過(guò)激活Gs亞單位,增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,激活PKA信號(hào)通路,從而調(diào)控雌激素受體(ER)表達(dá),進(jìn)而參與附睪和曲細(xì)精管的發(fā)育。上述相關(guān)研究都著重闡述了LGR4對(duì)機(jī)體發(fā)育過(guò)程的影響,近年來(lái)則有研究表明了其與能量代謝的關(guān)聯(lián),LGR4全身敲除小鼠體重明顯減輕,糖耐量改善,并能抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和遺傳性肥胖,揭示了LGR4對(duì)脂肪組織的調(diào)控作用,并未深入探究LGR4對(duì)其他代謝相關(guān)器官的具體作用。
近年來(lái),臨床研究均已證實(shí)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與冠心病存在密切相關(guān)性,血液中大部分的LDL-c是依賴肝臟表面的LDL受體清除,因此血膽固醇水平與肝臟的代謝功能密切相關(guān),而目前尚未有研究揭示LGR4對(duì)肝臟的影響,及其在肝臟膽固醇代謝中發(fā)揮的作用。
本研究中首次構(gòu)建了LGR4肝臟特異性敲除小鼠模型,對(duì)于探究LGR4在肝臟的膽固醇代謝功能中發(fā)揮的作用具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供LGR4基因的新用途,具體為提供一種LGR4基因/蛋白用于篩選治療高膽固醇血癥的藥物中的用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
第一方面,本發(fā)明涉及LGR4基因及其蛋白在篩選治療高膽固醇血癥的藥物中的用途。
第二方面,本發(fā)明涉及LGR4基因及其蛋白在制備治療高膽固醇血癥的藥物中的用途。
第三方面,本發(fā)明涉及LGR4基因及其蛋白在篩選降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的藥物中的用途。
第四方面,本發(fā)明涉及LGR4基因及其蛋白在制備降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的藥物中的用途。
優(yōu)選的,所述的LGR4基因是人或小鼠的LGR4基因。
優(yōu)選的,所述LGR4基因作為分子靶點(diǎn)或藥物作用靶點(diǎn)。
優(yōu)選的,所述藥物包含以LGR4基因作為分子靶點(diǎn)或藥物作用靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的植物提取物、化學(xué)結(jié)構(gòu)明晰的化合物、肽類物質(zhì)、核酸類物質(zhì)、多糖類物質(zhì)、病毒載體、脂質(zhì)體載體或納米顆粒載體。
本發(fā)明建立腺病毒介導(dǎo)的肝臟特異性LGR4基因敲除的小鼠模型以及Lgr4;Leptin(Lgr4m/m;ob/ob)雙基因突變小鼠模型,通過(guò)表型觀察,發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠血膽固醇水平改善,總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低。
在不同的小鼠模型中,攝入同樣食物的情況下,LGR4基因敲除小鼠總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平比對(duì)照組降低很多。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
1)本發(fā)明將LGR4基因作為分子靶點(diǎn)和藥物研發(fā)靶點(diǎn),用于篩選和制備治療高膽固醇血癥的藥物,這些藥物可降低血膽固醇水平,減少缺血性心血管病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
2)本發(fā)明將LGR4基因作為分子靶點(diǎn)和藥物研發(fā)靶點(diǎn),用于篩選和制備降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的藥物,這些藥物可顯著降低低密度脂蛋白膽固醇水平。
3)本發(fā)明為高膽固醇血癥治療以及高低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)適應(yīng)癥的治療提供了一個(gè)新靶點(diǎn),有良好的應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
圖1為db/db小鼠及高脂小鼠中,肝臟特異性LGR4基因敲除小鼠(Ad-sh-LGR4)與對(duì)照組小鼠(Ad-sh-CTRL)的血清總膽固醇及血清低密度脂蛋白膽固醇水平比較示意圖,其中,A為db/db小鼠血清總膽固醇水平,B為高脂小鼠血清總膽固醇水平,C為db/db小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇水平,D為高脂小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇水平;
圖2為L(zhǎng)gr4;Leptin雙基因突變小鼠(Lgr4m/m;ob/ob)與對(duì)照組小鼠(ob/ob)的血清總膽固醇及血清低密度脂蛋白膽固醇水平比較示意圖,其中,A為各組小鼠血清總膽固醇水平的比較,B為各組小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇水平比較。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明,但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是,對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1、建立腺病毒介導(dǎo)的肝臟特異性LGR4基因敲除小鼠
20只db/db小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌研究所動(dòng)物房,環(huán)境溫度為22℃,12小時(shí)/12小時(shí)明暗交替,db/db小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分組,并按體重校準(zhǔn),分別為對(duì)照組(Ad-sh-CTRL)和LGR4敲除組(Ad-sh-LGR4)兩組。分組后給予腺病毒尾靜脈注射,對(duì)照組給予2*109pfu shNT腺病毒注射,LGR4敲除組給予2*109pfu shLGR4腺病毒注射。
24只高脂小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌研究所動(dòng)物房,環(huán)境溫度為22℃,12小時(shí)/12小時(shí)明暗交替,用高脂飼料飼養(yǎng)4個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分組及后續(xù)處理同db/db小鼠。
實(shí)施例2、建立Lgr4;Leptin(Lgr4m/m;ob/ob)雙基因突變小鼠
Lgr4雜合小鼠同C57BL/6小鼠回交至少6代,獲得C57BL/6背景的Lgr4雜合小鼠。這些Lgr4雜合小鼠同ob小鼠交配得到的小鼠記為F2,F(xiàn)2代小鼠雜交得到的后代中Lgr4和Leptin雙突變小鼠用于實(shí)驗(yàn),ob小鼠用于對(duì)照。三月齡雄鼠和雌鼠按1:1和1:2比例合籠交配。三周幼鼠離乳、標(biāo)記、分籠、基因型鑒定。
實(shí)施例3
飼養(yǎng)條件:小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)條件下,飼養(yǎng)密度為5只每籠,在標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠中按以下條件分籠喂養(yǎng):標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)小鼠飼料(4.5%脂肪,4.0%纖維素,21.0%蛋白質(zhì)、1.404千卡/克),高脂喂養(yǎng)飼料購(gòu)于Research Diet(60.0%脂肪),根據(jù)每只小鼠攝食量隔日更換飼料,保證飼料的新鮮性。室溫20-22攝氏度,自由攝食和飲水,穩(wěn)定的人工光照周期(6:00到18:00光照,18:00到6:00黑暗)。
兩種腺病毒注射小鼠模型于注射腺病毒10天后進(jìn)行取材,Lgr4;Leptin(Lgr4m/m;ob/ob)雙基因突變小鼠模型于4月齡時(shí)進(jìn)行取材,取材前一天下午于17點(diǎn)撤去各組動(dòng)物的飼料,使動(dòng)物禁食16小時(shí),于9點(diǎn)使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠,麻醉后處死小鼠,收集全血,采血約0.6-0.8ml,放入EP管中,室溫放置2-4小時(shí)后,在低溫離心機(jī)上用4攝氏度3000轉(zhuǎn)每分鐘的條件離心10分鐘。以100μl/管進(jìn)行分裝血清,之后置于-80攝氏度冰箱備用;采血完畢后,快速剪取肝臟、附睪脂肪、皮下脂肪、腓腸肌等組織,并在液氮中預(yù)冷,之后放于液氮或-80攝氏度冰箱備用。
結(jié)果:
一、結(jié)果顯示,db/db小鼠及高脂小鼠中,肝臟特異性LGR4基因敲除小鼠(Ad-sh-LGR4)的血清總膽固醇水平明顯低于對(duì)照組小鼠(Ad-sh-CTRL)(如圖1A和B),血清低密度脂蛋白膽固醇水平亦顯著低于對(duì)照組(如圖1C和D)。
二、Lgr4;Leptin雙基因突變小鼠(Lgr4m/m;ob/ob)的血清總膽固醇水平明顯低于對(duì)照組小鼠(ob/ob)(如圖2A),血清低密度脂蛋白膽固醇水平亦顯著低于對(duì)照組(如圖2B)。
根據(jù)上述結(jié)果,LGR4基因參與膽固醇代謝過(guò)程,與高膽固醇血癥有關(guān)聯(lián)性。LGR4基因缺失可降低血膽固醇水平,可作為一個(gè)藥物靶點(diǎn),用于篩選或制備用于治療高膽固醇血癥、降低缺血性心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的藥物。