本發(fā)明屬于采用現(xiàn)代分析檢測手段對藏藥材的質量進行檢測的技術領域，更具體的說是利用多波長切換測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法。

背景技術：

珠芽蓼是蓼科植物珠芽蓼(Polygonum Viviparum L)的干燥根莖，《晶珠本草》中記載，然布(珠芽蓼)味甘、澀、酸，有止瀉，鎮(zhèn)腸寒痛的功效?？捎糜谥物L熱，除時疫熱，能調(diào)和和合紊亂，治衰老病，風濕病，亦能退燒、調(diào)經(jīng)、收斂、止血等?！吨袊厮帯酚涊d，珠芽蓼主含蒽醌、鞣質、多糖、黃酮苷、香豆精、有機酸、脂肪酸等成分，現(xiàn)有研究亦表明珠芽蓼中含有揮發(fā)油、鞣質、黃酮、多糖等多種成分，其中沒食子酸和綠原酸等有機酸類成分具有抗氧化等作用，黃酮類成分具有較強的抗自由基作用和抗氧化能力。

珠芽蓼記載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準藏藥(第一冊)》，其中僅有對藥材進行顯微鑒別沒有含量測定指標，不利于有效控制珠芽蓼的質量。目前有續(xù)艷麗等報道的《RP-HPLC法同時測定藏藥珠芽蓼中牡荊素、槲皮苷和槲皮素的含量》和李居安等報道的《HPLC法同時測定珠芽蓼中沒食子酸、綠原酸和槲皮素成分的含量》對珠芽蓼中的有機酸和黃酮類成分進行定量研究，都僅能對3種物質進行測定，不能全面反映藥材的質量，無法實現(xiàn)對珠芽蓼藥材進行全面和整體評價。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對以上缺陷和不足，建立一種不同時段多波長切換的LC-MS/MS圖譜技術同時檢測珠芽蓼中多種有機酸和黃酮類成分的方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一方面，本發(fā)明提供了一種測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1)供試品溶液的制備：將珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制備成供試品溶液；

2)高效液相色譜-質譜聯(lián)用分析條件：

高效液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱，其尺寸為150mm×4.6mm×5μm，流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為0.8mL·min^-1，DAD檢測器檢測波長：272nm、325nm、360nm，在不同時段切換，柱溫30℃；進樣量10μL；

流動相梯度洗脫程序為：

不同時段波長切換程序為：

質譜條件：四級桿質譜，離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子模式；離子掃描范圍：100-1000m/z；碰撞誘導解離電壓Fragmentor：70V；霧化壓力：50psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12L/min；毛細管電壓：3000V；

3)成分分析：通過化學工作站檢索NIST標準質譜圖庫，同時結合有關質譜圖文獻解析，定性分析確認珠芽蓼中有機酸類和黃酮類成分。

在一些實施例中，供試品溶液的制備步驟包括：精密稱取過3號篩的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇溶液30mL，稱定重量，超聲提取，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

在一些實施例中，所述成分分析還包括定量分析，按如下步驟進行：

(a)對照品溶液的制備：取需要定量測定成分的對照品加甲醇溶劑制成對照品溶液；

(b)標準曲線繪制：取對照品溶液稀釋多個濃度，以對照品質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得出回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍；

(c)樣品含量測定：應用不同時段多波長測定后的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，按標準曲線法以峰面積計算樣品中需要測定成分的含量。

在一些實施例中，所述成分分析為對樣品中沒食子酸和綠原酸進行定量分析測定，按如下步驟進行：

(a)對照品溶液的制備：

混合對照品：取沒食子酸和綠原酸對照品加甲醇溶液制成沒食子酸、綠原酸的混合對照品溶液；

沒食子酸對照品溶液：取沒食子酸加甲醇溶液制成沒食子酸對照品溶液；

綠原酸對照品溶液：取綠原酸加甲醇溶液制成綠原酸對照品溶液；

(b)標準曲線繪制：取混合對照品溶液稀釋，以沒食子酸和綠原酸信噪比大于10的稀釋液為定量限溶液。分別精密吸取定量限溶液10μL、混合對照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色譜儀，以對照品質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得出回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍；

(c)樣品含量測定：應用不同時段多波長測定后的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，按標準曲線法以峰面積計算樣品中沒食子酸和綠原酸成分的含量。

在一些實施例中，所述成分分析還包括對定量分析后進行有效性評價，其中包括系統(tǒng)適用性、專屬性、定量限與線性、重復性、穩(wěn)定性以及加樣回收率。

在一些實施例中，所述甲醇溶液為50％甲醇水溶液。

在一些實施例中，步驟1)所述供試品溶液的制備中的超聲提取溫度為55℃，超聲時間為15min。

在一些實施例中，所述有機酸類和黃酮類成分包括沒食子酸、異綠原酸、表兒茶素二聚體、表兒茶素/兒茶素、紫丁香苷、綠原酸、異槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷異構體、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

本發(fā)明所述的多波長切換同時測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法所具有的積極效果在于：

①本發(fā)明首次對珠芽蓼中有機酸和黃酮兩類活性成分中的10種物質同時進行測定，完善了珠芽蓼藥材質量控制方法。

②本發(fā)明采用LC-MS/MS分析檢測方法具有簡便、穩(wěn)定、快速、高效、靈敏度高、重復性好、干擾小的優(yōu)點，能夠在1小時內(nèi)完成10種物質的檢測，且分離度良好。在建立對照品標準曲線的基礎上，還能夠對其進行定量分析檢測，從而獲得極其豐富的信息量。

③本發(fā)明通過多波長切換程序，在保證數(shù)據(jù)信息損失最小的前提下，獲得一張能夠同時包含多個波長信息的色譜圖。

④本發(fā)明的中供試品用50％甲醇為提取溶劑，料液比1:30，采用55℃超聲15min提取后過濾即可直接檢測，樣品前處理步驟簡單，提取效率也較高，無需過柱純化，且液相色譜分離過程中干擾雜質少。

⑤本發(fā)明采用以乙腈-水為流動相，加入0.1％的甲酸調(diào)節(jié)pH，使得各峰的峰形較好，分離時間適中且分離度良好，也達到了增加各成分的離子化效果。

附圖說明

圖1不同時段多波長切換珠芽蓼成分的HPLC圖譜，1-10分別為沒食子酸、異綠原酸、表兒茶素二聚體、表兒茶素/兒茶素、紫丁香苷、綠原酸、異槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷異構體、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

圖2沒食子酸和綠原酸混合對照品溶液的HPLC色譜圖。

圖3沒食子酸和綠原酸對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液HPLC圖譜的比較圖。

圖4沒食子酸對照品溶液的標準曲線。

圖5綠原酸對照品溶液的標準曲線。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

實施例1

1.試劑、藥材、標準品和儀器

1.1 試劑和藥材

1.2 標準品

1.3 儀器

2.供試品溶液的制備

精密稱取過3號篩的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞錐形瓶中，精密量取30mL50％甲醇，稱定重量，置于55℃超聲儀中超聲15min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.LC-MS/MS的液相色譜及質譜條件

3.1 LC-MS/MS的液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，按表1進行梯度洗脫，流速：0.8mL·min^-1，檢測波長：272nm、325nm、360nm在不同時段的切換程序按表2進行。DAD檢測器在不同時段進行多波長切換；柱溫30℃；進樣量10μL；

表1 流動相梯度洗脫表

3.2 LC-MS/MS的質譜條件

檢測條件：四級桿質譜，離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子模式；離子掃描范圍：100-1000m/z；碰撞誘導解離電壓Fragmentor：70V；霧化壓力：50psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12L/min；毛細管電壓：3000V；

表2 不同時段多波長檢測表

4.多波長切換珠芽蓼的HPLC圖譜的成分鑒定

實驗結果見圖1，定性分析通過化學工作站檢索NIST標準質譜圖庫，同時結合有關質譜圖文獻解析，確認珠芽蓼中有機酸類和黃酮類成分如表3所示：

表3 珠芽蓼中成分鑒定結果

實施例2 沒食子酸和綠原酸的定量分析

在實施例1的基礎上，還可對沒食子酸和綠原酸進行定量分析。

1.對照品溶液的制備：

混合對照品：取沒食子酸和綠原酸對照品適量，精密稱定，加50％甲醇溶液制成每1mL含沒食子酸0.086mg、綠原酸0.173mg的混合對照品溶液，即得；

沒食子酸對照品溶液：取沒食子酸適量，精密稱定，加50％甲醇溶液制成每1mL含沒食子酸0.0216mg的對照品溶液；

綠原酸對照品溶液：去綠原酸適量，精密稱定，加50％甲醇溶液制成每1mL含綠原酸0.945mg的對照品溶液。

2.含量測定

本發(fā)明所述的珠芽蓼藥材質量控制方法，將4份不同來源的珠芽蓼樣品分別按照實施例1中“2.供試品溶液的制備”方法進行樣品制備，依次測定計算沒食子酸和綠原酸的含量(n＝3)。其結果見表4；

表4 四批珠芽蓼樣品含量測定結果，mg/g，n＝3，x±s

3.含量測定方法的有效性評價

本發(fā)明所述的含量測定方法進行有效性評價，其中包括系統(tǒng)適用性、專屬性、定量限與線性、重復性、穩(wěn)定性以及加樣回收率。

3.1 系統(tǒng)適用性實驗

精密吸取混合對照品溶液適量，按前述色譜條件，連續(xù)進樣6針，測定峰面積，計算沒食子酸的峰面積RSD為0.22％(n＝6)，綠原酸的峰面積RSD為0.67％(n＝6)。2種成分分離度均大于1.5，拖尾因子在0.8-1.2，理論塔板數(shù)大于5000，說明系統(tǒng)適應性良好。

3.2 專屬性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液(50％甲醇)適量，按前述色譜條件，分別進樣1針，記錄對照品溶液的色譜圖以及對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液三者的疊加圖，見圖2和圖3。結果顯示，對照品中沒食子酸和綠原酸與供試品中各峰的保留時間一致，且空白對照溶液沒有干擾。

3.3 定量限與線性

取混合對照品溶液稀釋，以沒食子酸和綠原酸信噪比大于10的稀釋液為定量限溶液。分別精密吸取定量限溶液10μL、混合對照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色譜儀，以對照品質量(μg)為橫坐標，峰面積(10⁵)為縱坐標，作出標準曲線，分別見圖4和圖5。得出回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍，見表5。

表5 線性方程

3.4 穩(wěn)定性

取珠芽蓼按前述方法制備成供試品溶液，分別于0、4、8、12、24h注入HPLC儀，記錄兩種成分的峰面積并計算RSD，均小于2.0％，結果表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 重復性

精密稱取同批次樣品6份，按前述方法制備供試品溶液，測得峰面積，計算2種成分的含量，其RSD均小于2.0％，說明方法重復性好。

3.6 加樣回收率試驗

取已知含量的珠芽蓼0.25g，精密吸取濃度為0.02161mg·mL^-1沒食子酸對照品溶液1mL，濃度為0.9454mg·mL^-1的綠原酸對照品1mL加入到6份樣品中，按前述方法進行樣品制備，測定分析，計算平均回收率，結果見表6。

表6 加樣回收率試驗結果(n＝6)

最后應當說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，所屬領域的普通技術人員應當理解：依然可以對本發(fā)明的具體實施方式進行修改或者對部分技術特征進行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術方案的精神，其均應涵蓋在本發(fā)明請求保護的技術方案范圍當中。