本發(fā)明屬于生物分析領域，尤其是涉及一種血漿中乙酰膽堿的濃度的UPLC-MS/MS檢測方法。
背景技術：
：神經(jīng)遞質(zhì)是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中擔當信使的特定的化學物質(zhì)，在生命活動中起著非常重要的調(diào)控作用。乙酰膽堿是一種膽堿類的神經(jīng)遞質(zhì)，對反應的警戒性，大腦的記憶力，以及學習能力都會產(chǎn)生影響。對乙酰膽堿的測定多采用電化學檢測法，但其步驟十分繁雜。因此，在實際復雜的樣品以及醫(yī)學臨床診斷中需要發(fā)展一種高專屬性、簡單、快速、靈敏的檢測方法。自從色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術發(fā)展以來，人們利用該技術在化學物質(zhì)定性定量分析、臨床醫(yī)藥檢測、以及生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、糖類等方面進行了廣泛和深入的研究。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、檢測效率高、成本低的血漿中乙酰膽堿的濃度檢測方法。本發(fā)明公開了利用液質(zhì)聯(lián)用技術建立了血漿中乙酰膽堿一種新的檢測技術方法，并為醫(yī)學研究及臨床診斷提供準確、快速、靈敏的分析方法。本發(fā)明的技術方案是：血漿中乙酰膽堿的濃度檢測方法的UPLC-MS/MS檢測方法，包括以下步驟：1)血漿樣品預處理方法：取人空白血漿，加入膽堿酯酶抑制劑，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min，使膽堿酯酶抑制劑與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，再加入CH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。2)樣品HPLC-MS/MS檢測條件為：液相條件流動相：A:0.1％甲酸水溶液B:0.1％甲酸的乙腈溶液流速：0.5ml/min進樣量：5ul色譜柱：安捷倫ZORBAXSB-Aq4.6*150mm,5um梯度洗脫程序Time/minA％B％09553.59555.077235.195510.0955質(zhì)譜條件毛細管電壓(kV):3.2kV源溫度(℃):120脫溶劑氣溫度(℃):300脫溶劑氣流量(L/Hr)600氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時間(s):0.023)制作標準曲線：選取乙酰膽堿濃度為2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml按照以上方法處理后，進樣檢測，其數(shù)據(jù)制備標準曲線。4)根據(jù)樣品的峰面積和標準曲線的回歸方程中，計算血漿中乙酰膽堿的濃度進一步，所述膽堿酯酶抑制劑為小檗堿。進一步，小檗堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度為0.5mg/ml。處理方法為：取人空白血漿50ul，加入5ul5mg/ml小檗堿溶液(即小檗堿在血漿的終濃度為0.5mg/ml)，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min,使小檗堿與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。進一步，乙酰膽堿的保留時間為3.43min。進一步，用小檗堿抑制乙酰膽堿酯酶后在測定血漿中乙酰膽堿，最低檢測限為0.5ng/ml。進一步，該檢測方法中，定量限為2ng/ml，線性范圍為2-200ng/ml。進一步，所述膽堿酯酶抑制劑為石杉堿甲或毒扁豆堿。血漿中的乙酰膽堿酯酶會快速將乙酰膽堿水解，因此難檢測到血漿中的Ach，以此為依據(jù)，在血漿中加入乙酰膽堿酯酶抑制劑，抑制乙酰膽堿的快速水解。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：UPLC-MS/MS檢測方法檢測血漿中乙酰膽堿濃度，簡單快捷，靈敏度高，抗干擾能力強，適合多種情況下乙酰膽堿的定性定量檢測，為生物檢測行業(yè)中血漿中乙酰膽堿的檢測提供了指導方法。附圖說明圖1是血漿中小檗堿濃度依次為0.01、0.1、0.5、1mg/ml時，Ach為50ng/ml的色譜圖。圖2是為空白血漿色譜圖，在保留時間為3.24min和3.64min處有兩個干擾色譜峰。圖3是加0.5mg/ml小檗堿后血漿中Ach濃度依次為1，5，50，100ng/ml時的色譜圖。圖4是乙酰膽堿制備得到的標準曲線。具體實施方式實施例1不同濃度小檗堿試驗：取人空白血漿50ul，加入不同濃度的小檗堿溶液(即小檗堿在血漿的終濃度分別為0.01、0.1、0.5、1mg/ml)，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min,使小檗堿與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。圖1為血漿中小檗堿濃度依次為0.01、0.1、0.5、1mg/ml時，血漿中Ach為50ng/ml的色譜圖，有圖可見，但血漿中小檗堿濃度為0.5mg/ml和1mg/ml時，保留時間為3.44min處的Ach色譜峰強度基本相當，而血漿中小檗堿濃度為0.1mg/ml和0.01mg/ml時，保留時間為3.44min處的Ach色譜峰強度依次減弱。因此血漿中0.5mg/ml的小檗堿即可對血漿中乙酰膽堿酯酶達到完全抑制，故后續(xù)試驗中選擇0.5mg/ml的小檗堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑。實施例2最低檢出限實驗：分別取含1ng/ml、5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml血漿50ul和50ul空白血漿，加入小檗堿溶液使小檗堿在血漿的終濃度為0.5mg/ml，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min,使小檗堿與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min。再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。圖2為空白血漿色譜圖，在保留時間為3.24min和3.64min處有兩個干擾色譜峰。圖3與圖2比，Ach濃度為50ng/ml和100ng/ml時，保留時間在3.43處的Ach色譜峰明顯，Ach濃度為1ng/ml時，Ach的色譜峰不明顯，5ng/ml可見明顯Ach峰，信噪比為20。檢測限為0.5ng/ml。所以用小檗堿抑制乙酰膽堿酯酶后在測定血漿中乙酰膽堿的方法，最低定量限在2ng/ml。實施例3標準曲線的制備：選取乙酰膽堿濃度為2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，加入小檗堿溶液使小檗堿在血漿的終濃度為0.5mg/ml，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min,使小檗堿與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。圖4為制備得到的標準曲線。實施例4回收率與基質(zhì)效應試驗：選取乙酰膽堿濃度為2ng/ml，50ng/ml，1600ng/ml，加入小檗堿溶液使小檗堿在血漿的終濃度為0.5mg/ml，渦旋混勻后，4℃冰箱中放置20min,使小檗堿與乙酰膽堿酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，渦旋混勻后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，渦旋1min后，15000r/min離心10min,取上清150ul進樣測定。通過QC樣品平均峰面積比相應濃度的回收率樣品的峰面積，計算每個濃度樣品和內(nèi)標的回收率。通過各濃度回收率樣品的峰面積比相應基質(zhì)效應樣品的峰面積，計算每個濃度樣品和內(nèi)標的基質(zhì)效應。表1Ach回收率和基質(zhì)效應(n＝3)表2Ach回收率和基質(zhì)效應數(shù)據(jù)血漿中Ach檢測樣品處理中，需加入足夠的小檗堿(0.5mg/ml)以抑制血漿中的乙酰膽堿酯酶，然后再結(jié)合PPT法處理樣品。此方法回收率為80％，但基質(zhì)效應偏低(30％)，可能是高濃度的小檗堿所致，可試驗選擇其他高抑制活性的化合物作為抑制劑，如石杉堿甲、毒扁豆堿等，這樣可以降低抑制劑的濃度，減小基質(zhì)效應。以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3