本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是指植物病理血清學(xué)測定方法。

背景技術(shù)：

近年來，廣東省部分煙草生產(chǎn)地區(qū)出現(xiàn)煙草畸形生長現(xiàn)象，大田表現(xiàn)為整塊田發(fā)生，卻畸形癥狀整齊一致。廣東煙區(qū)、湖南煙區(qū)及江西煙區(qū)相繼出現(xiàn)煙葉畸形現(xiàn)象，且有進一步擴展蔓延的趨勢，嚴重影響烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量以及煙農(nóng)的經(jīng)濟收入。

解決煙草畸形生長的問題，首先要解決的，即是了解導(dǎo)致煙草畸形的原因，這需要科學(xué)，準確，可靠的研究分析方法進行確定，在現(xiàn)有的一些測定方法中，如血清學(xué)測定方法，一般為囊括范圍較大的統(tǒng)一性的測定方法，雖然具有一定的指導(dǎo)意義，但在對具體的種類操作中，則可能會出現(xiàn)一定的差異，導(dǎo)致測定結(jié)果不準確，甚至不可行，而測定結(jié)果的不準，直接對治理煙草畸形將產(chǎn)生非常大的影響，因此，如何針對煙草進一步提高檢測的準確度，如何根據(jù)煙草的特性進行測定方法的優(yōu)化，成為解決問題的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種植物病理血清學(xué)測定方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中針對煙草畸形的病因測定方法中，常規(guī)血清學(xué)測定方法針對性不強，導(dǎo)致結(jié)果不準的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：植物病理血清學(xué)測定方法，包括以下步驟：

(1)取煙草畸形葉樣品0.1g，用研杵搗碎，加入1mL的抗原包被緩沖液，轉(zhuǎn)入離心管中離心；

(2)加入200uL酶聯(lián)板包被抗原，37℃下，2h；

(3)倒掉包被緩沖液，用PBST。洗板3次，每次3min；

(4)在不同酶標板上分別加入黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、煙草曲葉病毒的抗血清特異性IgG，每孔150ul,37℃，溫育2h；

(5)倒掉溶液，用PBST。洗板3次，每次3min；

(6)加入酶標樣抗兔IgG，每孔100ul，37℃下溫育2h；

(7)倒掉溶液，用PBST。洗板3次，每次3min；

(8)加入底物浴液，每孔150ul,室溫20～30min，每孔加1滴2mol/L的H₂SO₄終止反應(yīng)；

(9)用450型酶標儀測OD495值，重復(fù)三次。

進一步，所述包被緩沖液為采用每1000mL中含1.59g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃，0.2gNaN₃，調(diào)節(jié)pH值至9.6，這些參數(shù)的設(shè)置，為發(fā)明人根據(jù)血清學(xué)的檢測理論，結(jié)合多年的煙草種植經(jīng)驗，以及多次的實驗結(jié)果，設(shè)定的適用于煙草血清學(xué)檢測的被緩沖液。

進一步，所述PBST采用1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20，同理所述PBST參數(shù)的設(shè)定，也是根據(jù)理論與實踐的結(jié)合，以及反復(fù)的實驗驗證得到的最佳參數(shù)設(shè)置。

本發(fā)明的所述植物病理血清學(xué)測定方法，在常規(guī)的血清學(xué)測定的基礎(chǔ)上，結(jié)合煙草種植與染病的實際情況，進行了創(chuàng)新性的調(diào)整，使測定的過程，采用的實際，參數(shù)的控制等，更加適合煙草染病原因的測定，提高了測定結(jié)果的準確性與可靠性。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

廣東梅州五華煙田進行植物病理血清學(xué)測定，過程如下：

(1)取煙草畸形葉樣品0.1g，用研杵搗碎，加入1mL的抗原包被緩沖液(每1000mL中含1.59g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃，0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH值至9.6)，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，2700g離心；

(2)加入200uL酶聯(lián)板包被抗原，37℃下，2h；

(3)倒掉包被緩沖液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(4)在不同酶標板上分別加入黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、煙草曲葉病毒的抗血清特異性IgG，每孔150ul,37℃，溫育2h；

(5)倒掉溶液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(6)加入酶標樣抗兔IgG，每孔100ul(工作濃度1：1000)，37℃下溫育2h；

(7)倒掉溶液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(8)加入底物浴液，每孔150ul,室溫20～30min，每孔加1滴2mol/L的H₂SO₄終止反應(yīng)；

(9)用450型酶標儀測OD495值，重復(fù)三次。

測定結(jié)果：采用三種病毒(黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、煙草曲葉病毒)的抗血清對煙草畸形葉標樣進行血清學(xué)測定實驗。結(jié)果顯示畸形葉標樣的OD值與健康煙草標樣的OD值都在0.045～0.056間，二者之間沒有超過2倍。這表明煙草畸形葉標樣與上述三種病毒沒有血清學(xué)反應(yīng)，即畸形葉標樣體內(nèi)不含有上述三種病毒。

實施例2

河南內(nèi)鄉(xiāng)縣煙田進行植物病理血清學(xué)測定，過程如下：

(1)取煙草畸形葉樣品0.1g，用研杵搗碎，加入1mL的抗原包被緩沖液(每1000mL中含1.59g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃，0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH值至9.6)，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，2700g離心；

(2)加入200uL酶聯(lián)板包被抗原，37℃下，2h；

(3)倒掉包被緩沖液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(4)在不同酶標板上分別加入黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、煙草曲葉病毒的抗血清特異性IgG，每孔150ul,37℃，溫育2h；

(5)倒掉溶液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(6)加入酶標樣抗兔IgG，每孔100ul(工作濃度1：1000)，37℃下溫育2h；

(7)倒掉溶液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HPO₄.12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，調(diào)節(jié)pH至7.3；加0.5mL Tween-20)。洗板3次，每次3min；

(8)加入底物浴液，每孔150ul,室溫20～30min，每孔加1滴2mol/L的H₂SO₄終止反應(yīng)；

(9)用450型酶標儀測OD495值，重復(fù)三次。

測定結(jié)果：采用三種病毒(黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、煙草曲葉病毒)的抗血清對煙草畸形葉標樣進行血清學(xué)測定實驗。結(jié)果顯示畸形葉標樣的OD值與健康煙草標樣的OD值都在0.086～0.103間，二者之間超過2倍。這表明煙草畸形葉標樣與上述三種病毒有血清學(xué)反應(yīng)，即畸形葉標樣體內(nèi)含有上述三種病毒。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。