本發(fā)明涉及端粒酶抑制劑篩選系統(tǒng)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種基于SPR技術(shù)的端粒酶抑制劑篩選系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

端粒酶(telomerase)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，是一種真核生物線性染色體末端的能夠以端粒DNA為底物，對(duì)端粒DNA末端進(jìn)行重復(fù)DNA擴(kuò)增的一種RNA核糖--蛋白復(fù)合體。端粒酶對(duì)端粒DNA的擴(kuò)增能夠使得細(xì)胞無(wú)限分裂而不會(huì)自然凋亡，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。目前，在85％以上的癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了端粒酶的過(guò)量表達(dá)，研究表明對(duì)端粒酶活性進(jìn)行抑制能夠達(dá)到殺死癌細(xì)胞的作用，所以以端粒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選成為癌癥研究治療的熱點(diǎn)。從龐大的化合物庫(kù)中篩選出能夠抑制端粒酶活性的物質(zhì)，為開發(fā)新型治療癌癥藥劑提供幫助具有重要的意義。目前，端粒酶抑制劑的篩選主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性平衡透析等方法發(fā)現(xiàn)能特異性結(jié)合端粒DNA的物質(zhì)，通過(guò)一系列體外方法驗(yàn)證其選擇性結(jié)合效果，然后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)該物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的抑制效果。首先，研究人員將選中的化合物溶于緩沖溶液中，然后選擇不同的DNA序列分別放入透析袋，在溶液中平衡24小時(shí)以上，然后取出通過(guò)紫外等方法檢測(cè)該物質(zhì)對(duì)各DNA序列不同的結(jié)合量。第二步，在得到對(duì)端粒DNA有良好選擇性結(jié)合的物質(zhì)后，通過(guò)熒光、紫外、質(zhì)譜等手段研究其與DNA結(jié)合的信息。最后，選擇具有良好抑制端粒酶活性潛力的物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，考察體內(nèi)抑制效果。上述方法是存在工作量大，時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高昂的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

作為各種廣泛且細(xì)致的研究和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將基于表面等離子共振(SPR)生物傳感芯片應(yīng)用于端粒酶抑制劑的篩選系統(tǒng)中，可實(shí)現(xiàn)端粒酶抑制劑的高效篩選，為新型抗癌藥物的研發(fā)開辟新途徑。基于這種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題和/或缺陷，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種基于SPR技術(shù)的端粒酶抑制劑篩選系統(tǒng)，其能夠配合市場(chǎng)上成熟的SPR儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單、快速且穩(wěn)定可靠的端粒酶抑制劑的篩選工作。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種基于SPR技術(shù)的端粒酶抑制劑篩選系統(tǒng)，其包括：

試劑盒，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含100～120mmol/L的dNTP和dNTP儲(chǔ)備液；所述第二反應(yīng)液包含端粒酶及端粒酶儲(chǔ)備液；所述稀釋液為pH7.3的10～200mmol/L PB或PBS緩沖液；為保持端粒酶活性及dNTP的穩(wěn)定性，端粒酶和DNTP平時(shí)分別儲(chǔ)存于各自的儲(chǔ)備液中，當(dāng)進(jìn)行測(cè)試工作時(shí)，試劑盒中的第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液均采用稀釋液稀釋成所需的濃度；

SPR芯片，其具有玻璃片、覆蓋于所述玻璃片上的金屬鍍膜、連接于所述鍍膜的端粒DNA。

利用現(xiàn)有SPR儀器，將上述篩選系統(tǒng)應(yīng)用于端粒酶抑制劑篩選的具體過(guò)程如下：

試劑盒中的第一反應(yīng)液使用稀釋液配制成所需的濃度后，作為檢測(cè)過(guò)程中的流動(dòng)液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入流通池，由于稀釋液中鈉離子或鉀離子的引入，芯片上的端粒DNA在鈉離子或鉀離子的存在條件下易形成分子內(nèi)四股螺旋結(jié)構(gòu)，并形成動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)SPR儀器自帶的控溫模塊控制溫度為37℃，保證流通池內(nèi)的端粒酶活性在最佳狀態(tài)。待穩(wěn)定后，使用試劑盒中的稀釋液將第二反應(yīng)液稀釋成所需濃度的端粒酶測(cè)試液加入體系中。由于端粒酶只能作用于單鏈狀態(tài)的端粒DNA，如果目標(biāo)分子能夠穩(wěn)定端粒DNA形成的四股螺旋結(jié)構(gòu)，就能夠有效阻止端粒酶對(duì)端粒DNA的延長(zhǎng)，從而達(dá)到抑制端粒酶活性的目的。根據(jù)SPR工作原理，其共振角的變化與芯片上質(zhì)量的改變直接相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)SPR信號(hào)改變情況，就能檢測(cè)到芯片上修飾的端粒DNA是否有延長(zhǎng)，從而得到該目標(biāo)分子對(duì)端粒酶活性的抑制效率。

優(yōu)選的是，其中，所述SPR芯片的構(gòu)建步驟為：

步驟一，將所述玻璃片鍍覆一層金屬薄膜后，得到第一芯片；

步驟二，將所述第一芯片置于5～15μmol/L的所述端粒DNA溶液中，0～10℃溫度條件下保持10～24h，得到第二芯片；

步驟三，將所述第二芯片置于1～3mmol/L的巰基醇類的磷酸緩沖液中封閉2～6h，得到SPR芯片。

優(yōu)選的是，其中，所述所述dNTP具有等摩爾比的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以確保端粒DNA的正確擴(kuò)增。

優(yōu)選的是，所述dNTP儲(chǔ)備液為10～200mmol/L的Tris-HCl緩沖液，所述端粒酶儲(chǔ)備液包括10～200mmol/L的PB或PBS緩沖液、3～15mmol/L的MgCl₂以及8～10wt％的甘油，所述dNTP儲(chǔ)備液和端粒酶儲(chǔ)備液的pH均為7.3，所述dNTP儲(chǔ)備液和端粒酶儲(chǔ)備液分別用以保證dNTP在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程的穩(wěn)定性和端粒酶在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中的活性。

優(yōu)選的是，其中，所述鍍膜為金膜或銀膜，金屬元素的性質(zhì)各不相同，對(duì)SPR光譜也將產(chǎn)生較大的影響。金屬材料的選擇需要綜合考慮其反射率及穩(wěn)定性，金、銀、銅、鋁的反射率均較高，但鋁和銅的穩(wěn)定性較差，易被氧化形成氧化層，影響SPR的產(chǎn)生，金和銀較為適合。

優(yōu)選的是，所述鍍膜為金膜，其具有更強(qiáng)的化學(xué)惰性，確保芯片的長(zhǎng)期使用，所述端粒DNA的5’端修飾有巰基，巰基-SH和金Au之間具有較強(qiáng)的相互作用，所述端粒DNA通過(guò)巰基連接于金膜可自發(fā)的形成有序結(jié)構(gòu)，且穩(wěn)定性非常高。

優(yōu)選的是，其中，所述端粒DNA通過(guò)三硫代金剛烷衍生物連接于所述金膜，三硫代金剛烷衍生物具有良好的穩(wěn)定性，通過(guò)三個(gè)硫?qū)鹉け砻孢M(jìn)行鰲合，可獲得極高的金膜表面包被的穩(wěn)定性，從而顯著提高了端粒DNA與金膜連接的穩(wěn)定性。

優(yōu)選的是，其中，所述鍍膜的厚度為43～46nm，，金屬鍍膜的厚度直接影響共振深度，直接影響SPR信號(hào)的靈敏度。

優(yōu)選的是，所述巰基醇類選自巰基乙醇、巰基己醇、巰基十一醇的任意一種。

優(yōu)選的是，所述巰基醇類為巰基乙醇，巰基乙醇優(yōu)異的還原性可保證最佳的封閉效果，避免非特異性吸附的產(chǎn)生。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

(1)不需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的透析、分析、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，能夠快速高效的篩選出對(duì)端粒酶有抑制效果的物質(zhì)，顯著加快端粒酶抑制劑的篩選研制工作；

(2)根據(jù)SPR信號(hào)的響應(yīng)速度以及強(qiáng)度，還能直接比較各種端粒酶抑制劑抑制端粒酶活性的效果；

(3)通過(guò)改變緩沖液的條件，如離子種類、濃度、分子擁擠試劑等，本端粒酶抑制劑篩選系統(tǒng)可成為研究多種因素對(duì)端粒酶活性影響的平臺(tái)。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中端粒酶延長(zhǎng)單鏈狀態(tài)端粒DNA的過(guò)程；

圖2為本發(fā)明另一實(shí)中抑制劑通過(guò)穩(wěn)定端粒DNA分子內(nèi)四股螺旋結(jié)構(gòu)阻止端粒DNA延長(zhǎng)的過(guò)程。

圖中：1、金屬鍍膜，2、帶有巰基的端粒DNA，3、端粒酶，4、延長(zhǎng)后的端粒DNA，5、端粒DNA分子內(nèi)四股螺旋結(jié)構(gòu)，6、端粒酶抑制劑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

參照?qǐng)D1，SPR芯片的金屬鍍膜1表面連有一層端粒DNA分子2，第二反應(yīng)液中的端粒酶3能夠以芯片上的端粒DNA為底物，以第一反應(yīng)液中的dNTP為原料進(jìn)行擴(kuò)增，使結(jié)合在金屬鍍膜表面的端粒DNA延長(zhǎng)，從而質(zhì)量增加。

參照?qǐng)D2，在一定濃度鈉離子或鉀離子的環(huán)境中，端粒DNA可自組裝形成分子內(nèi)四股螺旋結(jié)構(gòu)，既保持四股螺旋狀態(tài)的存在，又使其不是特別穩(wěn)定，形成動(dòng)態(tài)平衡。端粒酶只能作用于單鏈狀態(tài)的端粒DNA，若添加的抑制劑能夠穩(wěn)定端粒DNA形成的四股螺旋結(jié)構(gòu)，就能夠有效阻止端粒酶對(duì)端粒DNA的延長(zhǎng)，從而達(dá)到抑制端粒酶活性的目的。

SPR芯片上端粒DNA的質(zhì)量與端粒酶的活性直接相關(guān)，SPR芯片共振角的變化又與芯片表面質(zhì)量的改變具有直接相關(guān)性，通過(guò)SPR儀器檢測(cè)SPR信號(hào)改變情況，就能檢測(cè)到芯片上修飾的端粒DNA是否有延長(zhǎng)，從而得到抑制劑對(duì)端粒酶活性的抑制效果。

<實(shí)例1>

1)試劑盒的制備，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含10mmol/L的磷酸鹽緩沖液和100mmol/L的dNTP，所述緩沖液的pH為7.3；所述第二反應(yīng)液包含100000U/ml的端粒酶及pH為7.3的端粒酶儲(chǔ)備液，端粒酶儲(chǔ)備液包含10mmol/L PB緩沖液、3mmol/L的MgCl₂以及8wt％的甘油，所述穩(wěn)定液的pH為7.3；所述稀釋液為pH7.3的10mmol/L PB緩沖液，用以在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分別稀釋成合適濃度的dNTP和端粒酶測(cè)試工作液；

2)芯片的構(gòu)建：玻璃片上鍍覆一層厚度為43nm的銀膜后，置于5μmol/L的修飾有巰基的端粒DNA溶液中0℃孵育10小時(shí)，將端粒DNA通過(guò)巰基連接于銀膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修飾完成后用1mmol/L的巰基乙醇的磷酸緩沖液封閉2小時(shí)，最后將制備好的芯片真空干燥，氮?dú)獗Ｗo(hù)封存，能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存，測(cè)試時(shí)直接使用；

3)使用：將修飾好的芯片放入雙通道SPR儀，測(cè)試流動(dòng)液為配置好的dNTP測(cè)試工作液，在一個(gè)通道的流動(dòng)液中加入一定濃度的待測(cè)抑制劑，另一通道中不加入抑制劑作為參照。當(dāng)基線穩(wěn)定后，通過(guò)六元閥在兩個(gè)通道中加入等量配制好的端粒酶測(cè)試溶液，通過(guò)對(duì)比不同通道的信號(hào)能夠得到端粒酶抑制劑的效果。

<實(shí)例2>

1)試劑盒的制備，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含200mmol/L的磷酸鹽緩沖液和120mmol/L的dNTP，所述緩沖液的pH為7.3；所述第二反應(yīng)液包含100000U/ml的端粒酶及pH為7.3的端粒酶儲(chǔ)備液，端粒酶儲(chǔ)備液包含200mmol/L PBS緩沖液、15mmol/L的MgCl₂以及10wt％的甘油，所述穩(wěn)定液的pH為7.3；所述稀釋液為pH7.3的200mmol/L PBS緩沖液，用以在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分別稀釋成合適濃度的dNTP和端粒酶測(cè)試工作液；

2)芯片的構(gòu)建：玻璃片上鍍覆一層厚度為46nm的金膜后，置于15μmol/L的修飾有三硫代金剛烷衍生物的端粒DNA溶液中10℃孵育24小時(shí)，三硫代金剛烷衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R表示三硫代金剛烷衍生物的功能基團(tuán)，

端粒DNA的序列為：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X為三硫代金剛烷衍生物，將端粒DNA通過(guò)三巰基連接于金膜表面。修飾完成后用3mmol/L的巰基乙醇的磷酸緩沖液封閉6小時(shí)，最后將制備好的芯片真空干燥，氮?dú)獗Ｗo(hù)封存，能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存，測(cè)試時(shí)直接使用；

3)使用：將修飾好的芯片放入雙通道SPR儀，測(cè)試流動(dòng)液為配置好的dNTP測(cè)試工作液，在一個(gè)通道的流動(dòng)液中加入一定濃度的待測(cè)抑制劑，另一通道中不加入抑制劑作為參照。當(dāng)基線穩(wěn)定后，通過(guò)六元閥在兩個(gè)通道中加入等量配制好的端粒酶測(cè)試溶液，通過(guò)對(duì)比不同通道的信號(hào)能夠得到端粒酶抑制劑的效果。

<實(shí)例3>

1)試劑盒的制備，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含100mmol/L的磷酸鹽緩沖液和110mmol/L的dNTP，所述緩沖液的pH為7.3；所述第二反應(yīng)液包含100000U/ml的端粒酶及pH為7.3的端粒酶儲(chǔ)備液，端粒酶儲(chǔ)備液包含100mmol/L PB緩沖液、10mmol/L的MgCl₂以及9wt％的甘油，所述穩(wěn)定液的pH為7.3；所述稀釋液為pH7.3的100mmol/L PBS緩沖液，用以在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分別稀釋成合適濃度的dNTP和端粒酶測(cè)試工作液；

2)芯片的構(gòu)建：玻璃片上鍍覆一層厚度為44nm的金膜后，置于10μmol/L的修飾有巰基的端粒DNA溶液中5℃孵育18小時(shí)，將端粒DNA通過(guò)巰基連接于金膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修飾完成后用2mmol/L的巰基己醇的磷酸緩沖液封閉4小時(shí)，最后將制備好的芯片真空干燥，氮?dú)獗Ｗo(hù)封存，能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存，測(cè)試時(shí)直接使用；

3)使用：將修飾好的芯片放入雙通道SPR儀，測(cè)試流動(dòng)液為配置好的dNTP測(cè)試工作液，在一個(gè)通道的流動(dòng)液中加入一定濃度的待測(cè)抑制劑，另一通道中不加入抑制劑作為參照。當(dāng)基線穩(wěn)定后，通過(guò)六元閥在兩個(gè)通道中加入等量配制好的端粒酶測(cè)試溶液，通過(guò)對(duì)比不同通道的信號(hào)能夠得到端粒酶抑制劑的效果。

<實(shí)例4>

1)試劑盒的制備，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含50mmol/L的磷酸鹽緩沖液和105mmol/L的dNTP，所述緩沖液的pH為7.3；所述第二反應(yīng)液包含100000U/ml的端粒酶及pH為7.3的端粒酶儲(chǔ)備液，端粒酶儲(chǔ)備液包含150mmol/L PBS緩沖液、5mmol/L的MgCl₂以及8wt％的甘油，所述穩(wěn)定液的pH為7.3；所述稀釋液為pH7.3的150mmol/L PB緩沖液，用以在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分別稀釋成合適濃度的dNTP和端粒酶測(cè)試工作液；

2)芯片的構(gòu)建：玻璃片上鍍覆一層厚度為44nm的銀膜后，置于12μmol/L的修飾有巰基的端粒DNA溶液中4℃孵12小時(shí)，將端粒DNA通過(guò)巰基連接于銀膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修飾完成后用1mmol/L的巰基乙醇的磷酸緩沖液封閉3小時(shí)，最后將制備好的芯片真空干燥，氮?dú)獗Ｗo(hù)封存，能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存，測(cè)試時(shí)直接使用；

3)使用：將修飾好的芯片放入雙通道SPR儀，測(cè)試流動(dòng)液為配置好的dNTP測(cè)試工作液，在一個(gè)通道的流動(dòng)液中加入一定濃度的待測(cè)抑制劑，另一通道中不加入抑制劑作為參照。當(dāng)基線穩(wěn)定后，通過(guò)六元閥在兩個(gè)通道中加入等量配制好的端粒酶測(cè)試溶液，通過(guò)對(duì)比不同通道的信號(hào)能夠得到端粒酶抑制劑的效果。

<實(shí)例5>

1)試劑盒的制備，其具有第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和稀釋液，所述第一反應(yīng)液包含150mmol/L的磷酸鹽緩沖液和115mmol/L的dNTP，所述緩沖液的pH為7.3；所述第二反應(yīng)液包含100000U/ml的端粒酶及pH為7.3的端粒酶儲(chǔ)備液，端粒酶儲(chǔ)備液包含150mmol/L PB緩沖液、12mmol/L的MgCl₂以及8wt％的甘油，所述穩(wěn)定液的pH為7.3；所述稀釋液為pH7.3的150mmol/L PB緩沖液，用以在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分別稀釋成合適濃度的dNTP和端粒酶測(cè)試工作液；

2)芯片的構(gòu)建：玻璃片上鍍覆一層厚度為45nm的金膜后，置于7μmol/L的修飾有三硫代金剛烷衍生物的端粒DNA溶液中8℃孵20小時(shí)，三硫代金剛烷衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R表示三硫代金剛烷衍生物的功能基團(tuán)，

端粒DNA的序列為：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X為三硫代金剛烷衍生物，將端粒DNA通過(guò)三巰基連接于金膜表面。修飾完成后用3mmol/L的巰基十一醇的磷酸緩沖液封閉5小時(shí)，最后將制備好的芯片真空干燥，氮?dú)獗Ｗo(hù)封存，能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存，測(cè)試時(shí)直接使用；

3)使用：將修飾好的芯片放入雙通道SPR儀，測(cè)試流動(dòng)液為配置好的dNTP測(cè)試工作液，在一個(gè)通道的流動(dòng)液中加入一定濃度的待測(cè)抑制劑，另一通道中不加入抑制劑作為參照。當(dāng)基線穩(wěn)定后，通過(guò)六元閥在兩個(gè)通道中加入等量配制好的端粒酶測(cè)試溶液，通過(guò)對(duì)比不同通道的信號(hào)能夠得到端粒酶抑制劑的效果。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。