本發(fā)明屬于中藥分析領(lǐng)域，具體涉及達(dá)原飲組合物的指紋圖譜。

背景技術(shù)：

達(dá)原飲組合物由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味中藥組成的中藥制劑，主治瘟疫或瘧疾，邪伏膜原證，現(xiàn)代臨床常用瘧疾、流行性感冒、病毒性腦炎，病毒性肝炎等屬溫?zé)嵋叨痉谀ぴ?，濕熱雍盛者等。為了更全面、有效的控制本中藥組合物的質(zhì)量控制水平，和國際接軌，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，需要對本中藥組合物采用更為先進(jìn)的質(zhì)量控制手段。

由于中藥及其復(fù)方制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都不足以解決這一問題。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥剖劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)，成分的種類與數(shù)量進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)。所以，中藥指紋圖譜已經(jīng)成為目前國際上較為先進(jìn)的中藥質(zhì)量控制手段。本中藥組合物還沒有作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的指紋圖譜公開報(bào)道。

美國食品藥品管理局(FDA)植物藥產(chǎn)品工業(yè)指南、WHO草藥評價(jià)指南中均指出，如果草藥制劑的活性成分不能鑒別，可以通過指紋圖譜(fingerprint spectrum)證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。歐共體在草藥質(zhì)量指南注釋中也指出，草藥及其制劑是以整體作為有效物質(zhì)，因此，草藥的質(zhì)量穩(wěn)定性僅靠測定己知的有效成分是不夠的，應(yīng)該通過指紋圖譜顯示其所含的各種成分。印度草藥典、英國草藥典、德國藥用植物協(xié)會、加拿大藥用及芳香植物協(xié)會等，也接受用指紋圖譜來保證有效成分未明的草藥產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。目前國家藥品監(jiān)督管理局對中藥注射劑己要求具有相關(guān)的指紋圖譜，對提高中藥注射劑的質(zhì)量起到了關(guān)鍵作用，但對其他劑型的中藥尚沒有強(qiáng)制性要求。

中藥指紋圖譜包括中藥化學(xué)指紋圖譜、蛋白指紋圖譜、DNA指紋圖譜及生物效應(yīng)指紋圖譜等。通常說的指紋圖譜是指化學(xué)指紋圖譜，是中藥材、中藥提取物或中成藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥主要化學(xué)成分特性的色譜或光譜。

中藥化學(xué)指紋圖譜可以分為中藥光譜指紋圖譜，如紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、X射線衍射圖譜等；色譜指紋圖譜，如薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳圖譜(CE)等；波譜指紋圖譜，如質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)等；DNA指紋圖圖譜；以及采用多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用得到的多維多息特征譜(characteristic fingerprint of muhrdimension andmuhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。

中藥指紋圖譜研究方法雖然較多，但色譜學(xué)方法應(yīng)是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色譜技術(shù)，已經(jīng)成為大家所公認(rèn)的三種常規(guī)的分析手段，是目前研究中藥指紋圖譜應(yīng)優(yōu)先考慮的方法。

中藥指紋圖譜有兩個作用：一是通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別中藥材的真?zhèn)位虍a(chǎn)地：二是通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的相對一致。

中藥指紋圖譜的制作和應(yīng)用常包括：(1)采集具有代表性的中藥樣品，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽涔┰嚻啡芤海⑦x用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(參照物)，進(jìn)行分析方法的優(yōu)選；(2)根據(jù)確定的分析方法，對一定批次的中藥樣品進(jìn)干了分離分析，將所得的多批次數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(3)將樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜制作相同的方法進(jìn)行樣品處理、分離分析后，將所得的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，一般相以度達(dá)到80％以上即可視為該樣品為合格。相似度的計(jì)算和評價(jià)方法通常采用相關(guān)系數(shù)與相合系數(shù)或夾角余弦法。我國中南大學(xué)、浙江大學(xué)等單位提據(jù)以上方法，編制了相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件用于完成相假度評價(jià)，其中以國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”應(yīng)用較多。因此采用指紋圖譜技術(shù)全面反映教材的整體特征，并進(jìn)一步與其活性相關(guān)聯(lián)，對于完善目前的質(zhì)量控制方法，保證臨床用藥的安全有效是十分必要的。目前，關(guān)于達(dá)原飲組合物的指紋圖譜的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道更沒有建立達(dá)原飲組合物的指紋圖譜，從質(zhì)量控制方面，有關(guān)達(dá)原飲組合物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜亦沒有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的沒有關(guān)于達(dá)原飲組合物的指紋圖譜以及建立達(dá)原飲組合物的指紋圖譜的文獻(xiàn)報(bào)道的缺陷，從而提供一種達(dá)原飲組合物指紋圖譜的建立方法及指紋圖譜。

為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

達(dá)原飲組合物指紋圖譜的建立方法包括采用高效液相色譜法建立指紋圖譜，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.8ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外-可見分光檢測器，指紋圖譜的檢測波長為215nm～240nm；

理論板數(shù)按參照物黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；

參照物溶液為黃芩苷的甲醇溶液；

流動相以乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

所述指紋圖譜包括20個共有峰：各峰的相對保留時(shí)間分別為：1號峰相對保留時(shí)間RRT為11.554,2號峰相對保留時(shí)間RRT為20.589,3號峰相對保留時(shí)間RRT為24.434，4號峰相對保留時(shí)間RRT為26.558，5號峰相對保留時(shí)間RRT為29.776，6號峰相對保留時(shí)間RRT為31.082，7號峰相對保留時(shí)間RRT為34.114，8號峰相對保留時(shí)間RRT為37.788，9號峰相對保留時(shí)間RRT為38.742，10號峰相對保留時(shí)間RRT為39.778，11號峰相對保留時(shí)間RRT為40.583，S峰相對保留時(shí)間RRT為50.099，13號峰相對保留時(shí)間RRT為53.925，14號峰相對保留時(shí)間RRT為54.927，15號峰相對保留時(shí)間RRT為57.315，16號峰相對保留時(shí)間RRT為61.652，17號峰相對保留時(shí)間RRT為68.702，18號峰相對保留時(shí)間RRT為72.735，19號峰相對保留時(shí)間RRT為84.317，20號峰相對保留時(shí)間RRT為86.291，其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

用于高效液相色譜測定的供試品溶液采用水作為溶劑，參照物溶液采用甲醇作溶劑。

參照物溶液的制備過程為：取黃芩苷對照品，加甲醇配制成80μg/ml的參照物溶液，即得。

所述達(dá)原飲組合物按如下兩種方法制備：

(1)按重量份計(jì)稱取如下飲片：檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，武火加熱煮沸，文火保持微沸至藥材藥液為150-170ml，濾除藥渣，放冷，即得第一達(dá)原飲組合物；

(2)按重量份計(jì)稱取如下飲片：檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過，得濾液；減壓濃縮至相對密度1.10-1.30的稠膏，加入麥芽糊精，干燥；混勻，加硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得第二達(dá)原飲組合物。

測定達(dá)原飲組合物指紋圖譜時(shí)的供試品溶液與和參照物溶液按如下方法制得：

(1)供試品溶液的制備：取第一達(dá)原飲組合物5ml，離心，取上清液，即得；

或取第二達(dá)原飲組合物1.7g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液適量，離心，取上清液，即得。

(2)參照物溶液的制備：

取黃芩苷對照品，加甲醇配制成80μg/ml的參照物溶液，即得。

進(jìn)樣量為10μl。

檢測波長表如下：

采用高效液相色譜法，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.8ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外-可見分光檢測器，指紋圖譜的檢測波長為215nm～240nm；

理論板數(shù)按參照物黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；

參照物溶液為黃芩苷的甲醇溶液；

流動相以乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)采用如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

包括20個共有峰，各峰的相對保留時(shí)間分別為：1號峰相對保留時(shí)間RRT為11.554，2號峰相對保留時(shí)間RRT為20.589，3號峰相對保留時(shí)間RRT為24.434，4號峰相對保留時(shí)間RRT為26.558，5號峰相對保留時(shí)間RRT為29.776，6號峰相對保留時(shí)間RRT為31.082，7號峰相對保留時(shí)間RRT為34.114，8號峰相對保留時(shí)間RRT為37.788，9號峰相對保留時(shí)間RRT為38.742，10號峰相對保留時(shí)間RRT為39.778，11號峰相對保留時(shí)間RRT為40.583，S峰相對保留時(shí)間RRT為50.099，13號峰相對保留時(shí)間RRT為53.925，14號峰相對保留時(shí)間RRT為54.927，15號峰相對保留時(shí)間RRT為57.315，16號峰相對保留時(shí)間RRT為61.652，17號峰相對保留時(shí)間RRT為68.702，18號峰相對保留時(shí)間RRT為72.735，19號峰相對保留時(shí)間RRT為84.317，20號峰相對保留時(shí)間RRT為86.291；其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物指紋圖譜，全面反映出達(dá)原飲組合物的質(zhì)量信息，從而能夠達(dá)到更加全面、有效地控制達(dá)原飲組合物制劑產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

2、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物指紋圖譜，采用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對所測指紋圖譜的辨認(rèn)所得；而且結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

3、提供的達(dá)原飲組合物指紋圖譜的建立方法參照中藥注射劑指紋圖譜的要求，對本發(fā)明涉及的指紋圖譜進(jìn)行了研究，經(jīng)過對供試品制備方法的考察及測定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動相、檢測波長等條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)選，建立了指紋圖譜測定條件并進(jìn)行了方法學(xué)考察，在對多批本中藥組合物指紋圖譜檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，逐漸積累數(shù)據(jù)，提出了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，作為本品指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到能夠更全面、有效地控制制劑質(zhì)量的目的。

4、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物指紋圖譜的建立方法采用國家藥典委員會提供中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)作為本中藥組合物指紋圖譜相似度計(jì)算軟件對指紋圖譜的辨認(rèn)，經(jīng)多次試驗(yàn)研究，通過與計(jì)算相對保留時(shí)間及相對峰面積的方法相比較，所得出的評價(jià)結(jié)論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)評價(jià)指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結(jié)果，對制劑指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為多波長檢測結(jié)果圖；

圖2為200～400nm掃描光譜3D圖；

圖3為210、215、220nm檢測波長的考察色譜對比圖；

圖4為流動相1供試品溶液色譜對比圖；

圖5為流動相2供試品溶液色譜對比圖；

圖6-1為流動相3供試品溶液色譜圖(完整圖)；

圖6-2為流動相3供試品溶液色譜圖(縮放圖)；

圖7為流動相4混合對照品與供試品溶液色譜對比圖；

圖8為指紋圖譜混合對照品溶液3D掃描圖；

圖9為指紋圖譜供試品溶液3D掃描圖；

圖10為流動相5混合對照品與供試品溶液色譜對比圖；

圖11為流動相6色譜圖；

圖12為不同濃度溶劑(甲醇)色譜對比圖；

圖13為不同濃度溶劑(乙醇、乙腈、甲醇)色譜對比圖；

圖14為指紋圖譜黃芩苷對照品溶液(參照物)色譜圖；

圖15為第一達(dá)原飲組合物對照指紋圖譜；

圖16為第二達(dá)原飲組合物連續(xù)三批次達(dá)原飲組合物②指紋對比圖；

圖17為空白溶劑色譜圖。

具體實(shí)施方式

提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實(shí)施方式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟的操作或條件即可進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。

本發(fā)明試藥及儀器：

試藥：

氫溴酸檳榔堿(批號：111684-200401，中國藥品生物制品檢定研究院)，

厚樸酚(批號：1100729-201513，中國藥品生物制品檢定研究院)，

和厚樸酚(批號：110730-200402，中國藥品生物制品檢定研究院)，

黃芩苷(批號：110715-201318，中國藥品生物制品檢定研究院)，

芍藥苷(批號：110736-201136，中國藥品生物制品檢定研究院)，

芒果苷(批號：110607-200402，中國藥品生物制品檢定研究院)，

甘草酸銨(批號：110731-201116，中國藥品生物制品檢定研究院)，

甲醇(色譜純，Thermo Fisher)

甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)

乙睛(色譜純，Thermo Fisher)

其余試劑為分析純，水為超純水。

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測器)

Waters E2695高效液相色譜儀(2998DAD檢測器)

實(shí)施例1.配制對照品溶液

氫溴酸檳榔堿對照品溶液：取氫溴酸檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得(檳榔堿重量＝氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)；

芒果苷對照品溶液：取芒果苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

芍藥苷對照品溶液：取芍藥苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液：取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1ml含厚樸酚40μg、和厚樸酚24μg的溶液，即得。

黃芩苷對照品溶液：取在黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

甘草苷、甘草酸銨對照品溶液：取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70％乙醇分別制成每1ml含甘草苷20μg、甘草酸銨0.2mg的溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸銨重量/1.0207)。

混合對照品溶液：分別取上述對照品溶液1ml，混勻，即得。

實(shí)施例2.達(dá)原飲組合物的制備

第一達(dá)原飲組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，砂鍋置于電加熱板上，武火(電壓值220V)加熱煮沸(約13分鐘)，文火(電壓值約170V)保持微沸至藥材藥液約160ml(約40分鐘)，采用兩層醫(yī)用紗布濾除藥渣，放冷，即得。

第二達(dá)原飲組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過，得濾液；減壓濃縮至相對密度為1.10-1.30優(yōu)選1.20(60℃～70℃)的稠膏，加入適量麥芽糊精，干燥；混勻，加適量硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得。第二達(dá)原飲組合物采用聚酯鍍鋁/聚乙烯復(fù)合膜，包裝規(guī)格為5.0g/袋。

實(shí)施例3.指紋圖譜色譜條件的確定

(1)檢測波長的選擇

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以甲醇為流動相A，0.05mol/L磷酸(pH約3.5)為流動相B，按照下表進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量10μl，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。梯度程序如下：

梯度洗脫程序1

根據(jù)藥典藥材含量指標(biāo)檢測波長主要有λ＝215(氫溴酸檳榔堿)、λ＝237(甘草苷)，λ＝280(黃芩苷)，λ＝294(厚樸酚、和厚樸酚)，λ＝258(芒果苷)、λ＝230(芍藥苷)，因此對同一份樣品，采用多波長檢測手段對五個波長進(jìn)行考察，以色譜峰數(shù)、分離度等評價(jià)，所得結(jié)果見圖1-2。

由3D光譜掃描圖可知，達(dá)原飲組合物中所含大部分物質(zhì)處于末端吸收，其在290nm附近有強(qiáng)吸收，分析應(yīng)為厚樸酚類木質(zhì)素物質(zhì)，結(jié)合圖1所考察的波長可知，在盡可能的選擇紫外末端波長能較全面的反應(yīng)組合物的指紋信息。因此對210～220之間進(jìn)行不同檢測波長的再次考察，結(jié)果見圖3。

從色譜圖可以看出，三者色譜峰基本一致，考慮到210nm過于靠近紫外末端，在甲醇或乙腈—水系統(tǒng)下會存在一定溶劑干擾，綜合考慮選擇λ＝215作為指紋圖譜研究的波長。

(2)流動相選擇及梯度條件的確定

由于達(dá)原飲組合物采用水提取，浸出成分往往極性較大，且成分多為生物堿類、苷類、酚類等，極性亦較大。結(jié)合HPLC采用的常用流動相組成，分別采用甲醇—水、乙腈—水系統(tǒng)進(jìn)行考察。

流動相1：甲醇—水系統(tǒng)，甲醇-乙腈(50：50)—水系統(tǒng)，乙腈—水系統(tǒng)；色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm三種不同有機(jī)相色譜對比圖表明：甲醇或甲醇：乙腈在色譜圖末端均存在一定基線不平，且色譜峰分離沒有乙腈系統(tǒng)好，因此選擇乙腈—水系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果見圖4.

流動相2：(A)乙腈—0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.8)，(B)乙腈—0.1％磷酸溶液；色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm。結(jié)果表明：水相為磷酸緩沖鹽時(shí)與0.1％磷酸溶液色譜圖基本一致，考慮到磷酸溶液配置更便捷，因此選定水相為0.1％磷酸系統(tǒng)。結(jié)果見圖5.

流動相3：在選定的流動相組成(乙腈—0.1％磷酸溶液)基礎(chǔ)上，對流動相梯度系統(tǒng)進(jìn)行不斷的調(diào)整和優(yōu)化，色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm。初步確定以下色譜梯度系統(tǒng)作為指紋圖譜檢測流動相之一。結(jié)果見圖6-1、6-2.

梯度洗脫程序2

流動相4:在流動相3系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過色譜峰的歸屬發(fā)現(xiàn)，在芒果苷，芍藥苷，甘草苷的色譜峰位上分離度均較差(見圖8)，在兼顧分離效果、梯度洗脫時(shí)間情況下，進(jìn)一步重點(diǎn)對流動相梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)考慮到200mm的色譜柱在分離效能上存在一定不足，因此選擇用碳載量較高的250mm的色譜柱用于其分離，色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm。其流速調(diào)整為0.8ml/min。梯度程序見下表，圖7。

梯度洗脫程序3

由圖9-2可知：供試品色譜圖大部分色譜峰分離良好，色譜圖中對照品對應(yīng)色譜峰均得到較好分離，其中芒果苷、芍藥苷、甘草苷三個色譜峰均較流動相5有較大的改善，但由于黃芩苷在此波長下吸收強(qiáng)度較大，導(dǎo)致色譜圖大部分峰被壓低；根據(jù)指紋圖譜的完整性原則以及相似度的計(jì)算方法，若色譜圖中某一個峰峰面積過大，會對相似度計(jì)算值貢獻(xiàn)較大，導(dǎo)致其余色譜峰峰面積發(fā)生變化時(shí)難以被較準(zhǔn)確通過相似度反應(yīng)，因此應(yīng)該對色譜圖中黃芩苷色譜峰以切換波長的方式使其峰面積保持一定的大小。另外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)某些樣品黃芩苷色譜峰存在裂峰的情況，分析與達(dá)原飲組合物中黃芩苷濃度過高造成溶劑效應(yīng)有關(guān)。

流動相5：在流動性4的基礎(chǔ)上，結(jié)合對照品與供試品DAD光譜掃描圖(見圖8、9)，黃芩苷吸收強(qiáng)度較低的吸收波長在230nm～250nm，315nm左右，為兼顧切換波長后其余色譜峰的檢測，選擇240nm；色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm，同時(shí)結(jié)合其保留時(shí)間下確定以下波長切換的方法，結(jié)果見圖10。

檢測波長表

由圖10可知，通過切換波長的方式使得色譜圖整體形態(tài)較好，在芒果苷、甘草苷的位置上，色譜峰分離較好，芍藥苷略有拖尾；供試品溶液黃芩苷色譜峰峰面積適中。

流動相6：流動相5所確定的指紋圖譜檢測條件雖能較好的使的峰分離，但因120min檢測時(shí)間較長，且10min～20min，55min～65min，105min～120min的運(yùn)行時(shí)間下基本檢測不到色譜峰，為提高指紋圖譜檢測效率，減少有機(jī)溶劑使用量，在不影響色譜峰分離的情況下，進(jìn)一步重點(diǎn)對檢測梯度程序進(jìn)行了壓縮，以減少檢測時(shí)間，色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm，所得結(jié)果見圖11。結(jié)果表明該色譜條件各色譜峰分離好，保留時(shí)間緊湊，檢測時(shí)間適宜。因此確定達(dá)原飲組合物指紋圖譜的色譜條件如下：

檢測波長：215nm，流速：0.8ml/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量:5～10μl。

梯度洗脫程序4

檢測波長表

實(shí)施例4.達(dá)原飲組合物供試品溶劑的選擇

溶劑、溫度是影響物質(zhì)溶解度的重要因素，相同的物質(zhì)在不同溶劑中溶解度存在差異，相同溶劑中物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增大。第一達(dá)原飲組合物在提取過程中溫度較高，物質(zhì)的溶解度相對較高，當(dāng)冷卻至室溫后，部分物質(zhì)因溶解度減少將析出，造成第一達(dá)原飲組合物呈現(xiàn)一定的沉淀或混懸物，此沉淀或混懸物作為組合物組成的一部分，應(yīng)該對其質(zhì)量進(jìn)行相應(yīng)的研究，同時(shí)供試品溶液的制備過程應(yīng)該考慮此部分物質(zhì)的保留。

將實(shí)施例2方法制備的達(dá)原飲組合物水溶液，分別按照以下方式制備供試品溶液：①直接離心進(jìn)樣(原液)：取組合物水溶液適量，12000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μl，即得。②不同濃度甲醇作溶劑：分別精密量取5ml組合物水溶液置于10ml容量瓶中，分別加入甲醇1ml、2ml、3ml、4ml，5ml，搖勻，加水至刻度，取適量，12000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣，進(jìn)樣量20μl，即得。③30％乙腈、30％乙醇作溶劑：分別精密量取5ml組合物水溶液置于10ml容量瓶中，一式兩份，一份加入3ml乙腈，另外一份加入3ml的乙醇，搖勻，加水至刻度，取適量，12000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣，進(jìn)樣量20μl，即得。試驗(yàn)結(jié)果見圖12、13。

試驗(yàn)結(jié)果表明：不同濃度甲醇作為溶劑時(shí)，在指紋圖譜上與原液相比均有一定差別，其中在1號、2號峰位置上，均出現(xiàn)了原液才能具備的特征峰，3號峰位置上原液的色譜峰均較其余色譜峰大，10％、20％甲醇做溶劑時(shí)色譜峰峰高均較小，4號峰位置上30％甲醇、50％甲醇相對比原液色譜峰大，分析可能與相應(yīng)色譜峰代表的成分在一定濃度的甲醇中溶解度偏低有關(guān)。采用一定比例的乙腈或乙醇做為溶劑時(shí)，基準(zhǔn)湯劑色譜峰與原液相比，在1、2號峰位置上亦存在不出峰的情況，分析可能與達(dá)原飲組合物采用水提取工藝有關(guān)。因此從指紋圖譜的整體性考慮，為盡可能的兼顧混懸液和沉淀的質(zhì)量，供試品的制備所選溶劑為水。確定達(dá)原飲組合物供試品溶液制備方法如下：

達(dá)原飲組合物供試品溶液制備：取第一達(dá)原飲組合物5ml，12000r/min離心10min，取上清液，即得?；蛉〉诙_(dá)原飲組合物1.7g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液適量，12000r/min離心10min，取上清液，即得。

實(shí)施例5.參照物的選擇

參照物在指紋圖譜中主要用于辨認(rèn)和評價(jià)指紋圖譜特征的指引，不等同于含量測定的對照品。按照《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求》指紋圖譜的參照物一般選取容易獲取的一個或一個以上制劑中的主要活性成分或指標(biāo)成分，用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性。中藥復(fù)方制劑的參照物首選君藥的活性成分或指標(biāo)成分，而參照物應(yīng)為保留時(shí)間適中、峰面積大小合適、分離穩(wěn)定的色譜峰。

參照物溶液的制備：取氫溴酸檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芍藥苷、知母皂苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸銨適量，加入甲醇配制成每ml含有氫溴酸檳榔堿0.1mg，厚樸酚40μg、和厚樸酚24μg，芍藥苷50μg，芒果苷50μg，黃芩苷60μg，甘草苷20μg，甘草酸銨0.2mg，即得。

結(jié)果表明：在供試品溶液中芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、和厚樸酚、厚樸酚色譜峰均能良好分離、芍藥苷色譜峰略有拖尾，且有一定干擾，檳榔堿無對應(yīng)色譜峰，分析由于檳榔堿為小分子生物堿，在普通C18柱上難以保留，而正文擬定的指紋圖譜方法為反相高效液相色譜法，因此檳榔堿不適合作為參照物；草果、厚樸為臣藥，草果主含揮發(fā)油，厚樸指標(biāo)成分為厚樸酚、和厚樸酚，兩者在圖譜中保留時(shí)間過長，不適合作為參照物，黃芩、白芍、知母為佐，指標(biāo)成分黃芩苷、芍藥苷、知母皂苷、芒果苷，其中黃芩苷在色譜圖中位置適中，峰面積穩(wěn)定，符合參照物的選擇要求，最終確定黃芩苷作為指紋圖譜參照物。

實(shí)施例6：共有峰的確定及對照指紋圖譜的建立

采用同一批次飲片，分別制備10份第一達(dá)原飲組合物，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定，根據(jù)10批次供試品溶液色譜圖各色譜峰的情況，確定共有峰應(yīng)20個，各共有峰依次標(biāo)號為1,2，……，N，其中參照峰標(biāo)記為12(S)，通過分析，確定其共有特征峰為20個，所述的20個共有特征峰的相對保留時(shí)間偏差RSD均小于2％，即：

1號峰平均保留時(shí)間RRT為11.554，RSD％為0.18％；

2號峰平均保留時(shí)間RRT為20.589，RSD％為0.03％；

3號峰平均保留時(shí)間RRT為24.434，RSD％為0.15％；

4號峰平均保留時(shí)間RRT為26.558，RSD％為0.14％；

5號峰平均保留時(shí)間RRT為29.776，RSD％為0.12％；

6號峰平均保留時(shí)間RRT為31.082，RSD％為0.10％；

7號峰平均保留時(shí)間RRT為34.114，RSD％為0.08％；

8號峰平均保留時(shí)間RRT為37.788，RSD％為0.11％；

9號峰平均保留時(shí)間RRT為38.742，RSD％為0.07％；

10號峰平均保留時(shí)間RRT為39.778，RSD％為0.07％；

11號峰平均保留時(shí)間RRT為40.583，RSD％為0.08％；

12(S)峰平均保留時(shí)間RRT為50.099，RSD％為0.07％；

13號峰平均保留時(shí)間RRT為53.925，RSD％為0.09％；

14號峰平均保留時(shí)間RRT為54.927，RSD％為0.11％；

15號峰平均保留時(shí)間RRT為57.315，RSD％為0.17％；

16號峰平均保留時(shí)間RRT為61.652，RSD％為0.18％；

17號峰平均保留時(shí)間RRT為68.702，RSD％為0.14％；

18號峰平均保留時(shí)間RRT為72.735，RSD％為0.05％；

19號峰平均保留時(shí)間RRT為84.317，RSD％為0.01％；

20號峰平均保留時(shí)間RRT為86.291，RSD％為0.01％；

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012年版)處理圖譜，以160504-1作為參照圖譜，扣除0min～5min，90min～95min的溶劑峰，進(jìn)行多點(diǎn)校正，匹配20個共有峰，并生成對照指紋圖譜(見圖14-15)，得到第一達(dá)原飲組合物對照指紋圖譜。計(jì)算樣品相似度，結(jié)果表明，采用不同產(chǎn)地飲片組合煎煮的10份第一達(dá)原飲組合物相似度在0.983～1.000之間(見表1)，相似度較高。

表1 10份第一達(dá)原飲組合物相似度評價(jià)結(jié)果

根據(jù)10批供試品溶液色譜圖所給出的相關(guān)參數(shù)，選擇具有特征性的20共有峰，以12號參照峰峰面積作為1，計(jì)算其他各共有特征指紋峰峰面積的比值，結(jié)果見表2。

表2 10份第一達(dá)原飲組合物共有峰面積比值結(jié)果

取第一達(dá)原飲組合物所對應(yīng)的飲片，制備連續(xù)三批次第二達(dá)原飲組合物樣品，按指紋圖譜測定方法測定，記錄色譜圖(見附圖16)，以第一達(dá)原飲組合物生成的對照指紋圖譜作為隨行對照圖譜，計(jì)算3批次第二達(dá)原飲組合物的相似度。結(jié)果見下表。

第二達(dá)原飲組合物相似度計(jì)算結(jié)果

實(shí)施例7.指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證.

(1)空白試驗(yàn)

為考察空白溶劑對指紋圖譜中各色譜峰的干擾，進(jìn)行空白試驗(yàn)。按擬定方法，進(jìn)樣10μl超純水運(yùn)行梯度，記錄色譜圖(圖17)，結(jié)果表明空白樣品基線平穩(wěn)、基本無干擾。

(2)指紋圖譜精密度試驗(yàn)

按照指紋圖譜精密度規(guī)定方法操作，取第二達(dá)原飲組合物(編號：1509002S-2)，依法制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，計(jì)算RSD值，所得結(jié)果見下表.

表3精密度試驗(yàn)相似度結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明：連續(xù)進(jìn)樣6次相似度結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，儀器精密度良好。

(3)指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)

按照指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)規(guī)定方法操作，取同一批達(dá)原飲組合物(批號1509003S-2)6份，依法制備，分別進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，計(jì)算RSD值，所得結(jié)果見表4.

表4重復(fù)性試驗(yàn)相似度結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明：指紋圖譜檢測方法重復(fù)性良好。

(4)指紋圖譜供試品溶液穩(wěn)定性

按照指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)規(guī)定方法操作，取同一供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算相似度及RSD值，所得結(jié)果見表5。

表5供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在36h以內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，穩(wěn)定性良好。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。