本發(fā)明涉及水產(chǎn)品精深加工與品質(zhì)控制領(lǐng)域，特別是涉及一種鮑魚內(nèi)臟新鮮程度的指紋圖譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

魚油是來(lái)源于深海魚類脂肪的提取物，屬于魚脂類。魚油所含的磷脂是動(dòng)物腦、神經(jīng)組織、骨髓、心、肝、卵和脾中不可缺少的組成部分，同時(shí)有助于脂的消化吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和形成，又是生物膜的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)。魚油富含ω-3系多不飽和脂肪酸(DHA和EPA)，可以降低人體血液中的低密度脂蛋白膽固醇，減少血液的粘稠度，具有調(diào)節(jié)血脂，防止血液凝固，預(yù)防腦血栓、腦溢血及中風(fēng)，抗炎等健康益處。

鮑魚營(yíng)養(yǎng)豐富，位列“海產(chǎn)八珍”之一，素有“軟黃金”之美譽(yù)。我國(guó)鮑魚產(chǎn)量居世界第一，2011年，我國(guó)鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到76786噸，占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的86％，年產(chǎn)值100多億元。鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量增長(zhǎng)迅猛，2015年產(chǎn)量為127967噸。在鮑魚加工過(guò)程中，占其體重1/3的大量鮑魚內(nèi)臟被丟棄，或者簡(jiǎn)單加工成飼料，造成了非常大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。這些組織中富含具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤作用的脂類生物活性成分，如多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、性激素等。如能將這些產(chǎn)品的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值開發(fā)出來(lái)，轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)保健、皮膚護(hù)理甚至藥品等高利潤(rùn)產(chǎn)品，頗具市場(chǎng)潛力。

同時(shí)，鮑魚內(nèi)臟脂肪的劣變，如氧化、降解，氣味、風(fēng)味成分的變化等等，是鮑魚新鮮度的重要指標(biāo)。重金屬或賀爾蒙污染，很大部分是累積在內(nèi)臟里，在各種微生物以及酶，以及適宜的溫度和濕度環(huán)境中，內(nèi)臟極易發(fā)生腐敗，其脂肪成分以及蛋白質(zhì)成分發(fā)生降解，氧化，產(chǎn)生氨(NH)和胺(R-NH)等堿性含氮物，因而腐敗后的會(huì)產(chǎn)生腥臭味，微生物的代謝，可引起食品化學(xué)組成的變化，并產(chǎn)生多種腐敗性產(chǎn)物。例如，三甲胺有魚腥惡臭味。氧化三甲胺存在于鮑魚的體內(nèi)，在其活著的時(shí)候用于調(diào)節(jié)浸透平衡，死后，在厭氧微生物或酶的作用下，氧化三甲胺很容易降解生成三甲胺、二甲胺等脂肪族胺的衍生物，產(chǎn)生腥味；因不飽和脂肪酸含量高，更易發(fā)生氧化變腥；不飽和脂肪酸在發(fā)生酶促氧化或自動(dòng)氧化時(shí)產(chǎn)生氫過(guò)氧化物，氫過(guò)氧化物可以進(jìn)一步分解成許多揮發(fā)性的小分子醛、酮、酸等，而這些次級(jí)氧化產(chǎn)物的形成也是腥味產(chǎn)生的主要原因，高脂肪含量魚類在儲(chǔ)藏中比低脂肪魚類產(chǎn)生更多的腥味物質(zhì)，并且脂肪氧化程度越高，腥味越濃；當(dāng)內(nèi)臟新鮮度改變后，其風(fēng)味發(fā)生一系列變化，進(jìn)而影響了整個(gè)鮑魚的新鮮度以及風(fēng)味成分。

我國(guó)魚油的生產(chǎn)要符合很多標(biāo)準(zhǔn)，才能進(jìn)行推廣，特別是多烯魚油，在符合SC/T 3502-2000中魚油的基本理化性質(zhì)外，必須要符合ST/T3503-2000中EPA、DHA的含量要求。因此，必須對(duì)鮑魚內(nèi)臟新鮮度進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)，才能確保生產(chǎn)的魚油的安全健康性，因此本專利針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，對(duì)其原料鮑魚內(nèi)臟的新鮮度的檢測(cè)方法進(jìn)行探究，確保其最安全有效的儲(chǔ)藏期。

指紋圖譜檢測(cè)是指某種備檢物質(zhì)經(jīng)制樣處理后，使用的分析手段，得到能夠標(biāo)志被檢測(cè)物質(zhì)特征的色譜圖的方法，指紋圖譜既具有能判斷該油脂本質(zhì)的真?zhèn)?，又能反映出同種油料的不同產(chǎn)地、不同采收期和使用不同生產(chǎn)工藝的生產(chǎn)出的油脂的特性，從而能夠從整體上控制被檢測(cè)油脂的質(zhì)量。油脂指紋圖譜一般常用的算法有相關(guān)系數(shù)法、夾角余弦法、距離法，其算法一般都直接引用的是成熟的中藥指紋圖譜的算法。對(duì)油脂指紋圖譜算法進(jìn)行獨(dú)立研究、比較性研究、權(quán)重分配研究及各算法的適應(yīng)性研究較少。因此，有必要在現(xiàn)有的技術(shù)水平之上，研究涉及一種操作便捷，能準(zhǔn)確快速、全面通過(guò)鮑魚內(nèi)臟由腐化程度不同引起的成分的差異來(lái)鑒定鮑魚內(nèi)臟腐化程度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供明一種鮑魚內(nèi)臟新鮮程度的指紋圖譜檢測(cè)方法，基于HS-SPME-GC-MS和PLS-DA法對(duì)鮑魚內(nèi)臟腐化程度的研究并運(yùn)用到保藏期的應(yīng)用上，該方法準(zhǔn)確、快速、高效地對(duì)鮑魚內(nèi)臟腐化程度的進(jìn)行鑒別。

本發(fā)明采用以下方案實(shí)現(xiàn)：一種鮑魚內(nèi)臟新鮮程度的指紋圖譜檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟S1：對(duì)鮑魚內(nèi)臟進(jìn)行基于HS-SPME的處理得到鮑魚內(nèi)臟樣品；

步驟S2：對(duì)氣相和質(zhì)譜儀的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，采集所述鮑魚內(nèi)臟樣品的GC-MS譜圖信息；

步驟S3：采用PLS-DA法分析所述鮑魚內(nèi)臟樣品的GC-MS譜圖信息，得出檢測(cè)結(jié)果。

進(jìn)一步地，所述步驟S1中，對(duì)鮑魚內(nèi)臟依次進(jìn)行提取、富集、濃縮和解吸四個(gè)處理過(guò)程，具體為：將清洗干凈的放置不同時(shí)間條件的鮑魚內(nèi)臟利用高速攪拌機(jī)打成漿狀，稱取一定的質(zhì)量，在頂空瓶中按2:7-4:7的料液比加入飽和氯化鈉溶液，于一定預(yù)熱溫度T下預(yù)熱一段時(shí)間t，推動(dòng)SPME手柄將萃取纖維頭伸入頂空瓶中，然后置于磁力攪拌加熱器中，在固定平衡溫度T₁下，在一定轉(zhuǎn)速R下保持一定的時(shí)間t₁，收回萃取纖維頭，從頂空瓶中取出SPME手柄，并插入到GC-MS的進(jìn)樣口中，在氣相色譜進(jìn)樣口解析一段時(shí)間t₂。

進(jìn)一步地，所述頂空瓶中內(nèi)置有磁力轉(zhuǎn)子。

進(jìn)一步地，所述步驟S3中，采用PLS-DA法分析鮑魚內(nèi)臟樣品的GC-MS譜圖信息，得出結(jié)果，具體包括以下步驟：

步驟S3-1：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)對(duì)不同腐化程度的鮑魚內(nèi)臟樣品的GC-MS圖譜的成分進(jìn)行檢索定性，采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析，提取樣品組分的共有信息，用共有化學(xué)成分的峰面積為指標(biāo)，以不同腐化程度的鮑魚內(nèi)臟樣品為類別對(duì)象，構(gòu)建訓(xùn)練樣本的自變量矩陣X，并設(shè)定分類變量矩陣Y；

步驟S3-2：用PLS回歸方法對(duì)訓(xùn)練樣本的自變量矩陣X和分類變量矩陣Y進(jìn)行分解，并使得X和Y的主成分最大程度的線性相關(guān)，其模型表示為：

X＝TP^T+E

Y＝UQ^T+F

其中，T和U分別為X和Y的得分矩陣，P和Q分別為X和Y的載荷矩陣，E和F分別為X和Y的殘差矩陣，上標(biāo)T表示轉(zhuǎn)置運(yùn)算；

步驟S3-3：將T和U作線性回歸：U＝TB，預(yù)測(cè)待測(cè)樣本時(shí)，根據(jù)P求出待測(cè)樣本x的得分向量t，最終求得預(yù)測(cè)值y＝tBQ，根據(jù)y的值對(duì)待測(cè)樣本的分類進(jìn)行判定，其中，回歸因子B＝(T^TT)^-1T^TU。

進(jìn)一步地，所述萃取纖維頭采用50/30μm的DVB/CAR/PDMS纖維頭，且所述萃取纖維頭在使用之前在進(jìn)樣口溫度250℃的條件下老化1h。

進(jìn)一步地，所述預(yù)熱溫度T為25–35℃，平衡溫度T₁為65–80℃，轉(zhuǎn)速R為75–100rad/min，時(shí)間t為10–20min，t₁為40–60min，t₂為5min。

進(jìn)一步地，所述步驟S2中，采集鮑魚內(nèi)臟樣品GC-MS譜圖信息時(shí)，色譜條件包括：30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛細(xì)柱；升溫程序?yàn)橄纫?5℃的溫度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，繼續(xù)以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；He載氣的流速為1–1.2mL/min；分流比為1:10–40。

進(jìn)一步地，所述步驟S2中，采集鮑魚內(nèi)臟樣品GC-MS譜圖信息時(shí)，質(zhì)譜條件包括：EI離子源；碰撞池能量設(shè)為40～80eV；傳輸線溫度為200～250℃；離子源溫度為200℃；質(zhì)量掃描范圍為35～500。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將油脂指紋圖譜技術(shù)直接應(yīng)用于魚油生產(chǎn)過(guò)程中，且具有檢測(cè)速度快，可重復(fù)性好，靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)魚油的生產(chǎn)安全具有很大意義。鮑魚內(nèi)臟因保藏條件的不同其成分具有很大差異，本發(fā)明通過(guò)氣相色譜分析手段，結(jié)合成分含量與指紋圖譜技術(shù)研究，能夠告訴有效地對(duì)不同腐化程度的鮑魚內(nèi)臟進(jìn)行鑒別分析，并將其充分運(yùn)用到保藏中。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的方法流程示意圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中0h檢測(cè)得到GC-MS譜圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中12h檢測(cè)得到GC-MS譜圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中24h檢測(cè)得到GC-MS譜圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例中48h檢測(cè)得到GC-MS譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

本實(shí)施采用兩組對(duì)照組，分別為組一：常溫(25℃)組，組二：冷藏(4℃)組。其中，常溫組包括八個(gè)樣品：0h，3h，6h，12h，24h，36h，48h，72h；冷藏組與其對(duì)應(yīng)。

如圖1所示，步驟1：對(duì)組一、組二樣品分別進(jìn)行基于HS-SPME的前處理。

取組一、組二樣品各10組，打勻成漿，各取0.3g左右于4mL頂空瓶中，加入一定體積的飽和食鹽水(m：v＝2:7–4:7)，于25–35℃預(yù)熱10–20min，推SPME手柄將萃取頭纖維頭伸入頂空瓶中，然后置于平衡溫度為65–80℃轉(zhuǎn)速為75–100rad/min的磁力攪拌加熱器上，保持40–60min后收回萃取纖維頭，取出固相手柄，插入到GC-MS的進(jìn)樣口，在氣相色譜進(jìn)樣口解吸5min。

步驟2：分別進(jìn)行組一、組二樣品的GC-MS譜圖信息采集。

設(shè)置氣相和質(zhì)譜儀的參數(shù)，具體參數(shù)如下：

色譜條件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛細(xì)柱；(2)升溫程序：先以35℃的溫度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，繼續(xù)以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He載氣的流速為1–1.2mL/min；(4)分流比：1:10–40。

質(zhì)譜條件：EI離子源；電子能量設(shè)為40～80eV；傳輸線溫度200～250℃；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍在35～500之間。

待儀器穩(wěn)定后，將步驟1中經(jīng)過(guò)處理前處理得到的160個(gè)樣品進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣分析。

步驟3：采用PLS-DA法對(duì)所有樣品的GC-MS譜圖信息進(jìn)行分析，得出結(jié)果，包括以下步驟：

(1)對(duì)GC-MS圖譜的成分依據(jù)NIST和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索定性，采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析。提取160個(gè)樣品組分的共有信息，用共有化學(xué)成分的峰面積為指標(biāo)，以16小組的160個(gè)樣本為類別對(duì)象，構(gòu)建訓(xùn)練樣本的自變量矩陣X，并設(shè)定分類變量矩陣Y，由于本例實(shí)施的樣品來(lái)自兩類程度，因此矩陣Y為二維向量。

(2)用PLS回歸方法對(duì)訓(xùn)練樣本的自變量矩陣X和分類變量矩陣Y進(jìn)行分解，并使

得X和Y的主成分最大程度的線性相關(guān)，其模型表示為：

X＝TP^T+E

Y＝UQ^T+F

其中，T和U分別為X和Y的得分矩陣，P和Q分別為X和Y的載荷矩陣，E和F分別為X和Y的殘差矩陣；

(3)將T和U作線性回歸：U＝TB，預(yù)測(cè)待測(cè)樣本時(shí)，根據(jù)P求出待測(cè)樣本x的得分向量t，最終求得預(yù)測(cè)值y＝tBQ，根據(jù)y的值對(duì)待測(cè)樣本的分類進(jìn)行判定，其中，回歸因子B＝(T^TT)^-1T^TU。

對(duì)于n類樣本的類別分類問(wèn)題，可利用n-1個(gè)PLS-DA子分類器串聯(lián)實(shí)現(xiàn)完整的分類。基本思路是，第1個(gè)分類器將第1類和2,3...n類樣本分開，第2個(gè)分類器將第2個(gè)類別和3,4...n類別分開，以此類推，一直到將所有的類別分開。在本實(shí)施例中，就需要利用1個(gè)PLS-DA子分類器串聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)分類。

實(shí)施例1

一種鮑魚內(nèi)臟新鮮程度的指紋圖譜檢測(cè)方法，包括以下步驟(同批次進(jìn)行10組進(jìn)行處理檢測(cè))：

(1)對(duì)鮑魚內(nèi)臟樣品進(jìn)行基于HS-SPME的前處理：將新鮮買回的鮑魚進(jìn)行除內(nèi)臟，將內(nèi)臟進(jìn)行勻漿稱量，每0.3g左右為一份于自封袋中，吹入氮?dú)?，共稱取15個(gè)樣，1號(hào)先進(jìn)行0h的檢測(cè)，其余的每7個(gè)為一組，分為兩組，進(jìn)行不同組別的儲(chǔ)藏，分別于4℃冷藏，另一組于25℃恒溫箱。先進(jìn)行0h的檢測(cè)：稱取0.3217g內(nèi)臟勻漿于4mL頂空瓶中，加入1.4mL的飽和食鹽水，于30℃預(yù)熱10min，推SPME手柄將萃取頭纖維頭伸入頂空瓶中，然后置于平衡溫度為80℃轉(zhuǎn)速為90rad/min的磁力攪拌加熱器上，保持40min后收回萃取纖維頭，取出固相手柄，插入到GC-MS的進(jìn)樣口，在氣相色譜進(jìn)樣口解吸5min。

(2)分別進(jìn)行組一、組二樣品的GC-MS譜圖信息采集。

設(shè)置氣相和質(zhì)譜儀的參數(shù)，具體參數(shù)如下：

色譜條件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛細(xì)柱；(2)升溫程序：先以35℃的溫度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，繼續(xù)以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He載氣的流速為1mL/min；(4)分流比：1:10。

質(zhì)譜條件：EI離子源；電子能量設(shè)為70eV；傳輸線溫度230℃；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍在35～500之間。

(3)采用PLS-DA法對(duì)所有樣品的GC-MS譜圖信息進(jìn)行分析，得出結(jié)果。

實(shí)施例2

一種鮑魚內(nèi)臟新鮮程度的指紋圖譜檢測(cè)方法，包括以下步驟(同批次進(jìn)行10組進(jìn)行處理檢測(cè))：

(1)對(duì)鮑魚內(nèi)臟樣品進(jìn)行基于HS-SPME的前處理：將新鮮買回的鮑魚進(jìn)行除內(nèi)臟，將內(nèi)臟進(jìn)行勻漿稱量，每0.3g左右為一份于自封袋中，吹入氮?dú)?，共稱取15個(gè)樣，1號(hào)先進(jìn)行0h的檢測(cè)，其余的每7個(gè)為一組，分為兩組，進(jìn)行不同組別的儲(chǔ)藏，分別于4℃冷藏，另一組于25℃恒溫箱。先進(jìn)行0h的檢測(cè)：稱取0.4112g內(nèi)臟勻漿于4mL頂空瓶中，加入1.5mL的飽和食鹽水，于35℃預(yù)熱15min，推SPME手柄將萃取頭纖維頭伸入頂空瓶中，然后置于平衡溫度為70℃轉(zhuǎn)速為85rad/min的磁力攪拌加熱器上，保持60min后收回萃取纖維頭，取出固相手柄，插入到GC-MS的進(jìn)樣口，在氣相色譜進(jìn)樣口解吸5min。

(2)分別進(jìn)行組一、組二樣品的GC-MS譜圖信息采集，設(shè)置氣相和質(zhì)譜儀的參數(shù)，具體參數(shù)如下：

色譜條件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛細(xì)柱；(2)升溫程序：先以35℃的溫度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，繼續(xù)以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He載氣的流速為1mL/min；(4)分流比：1:40。

質(zhì)譜條件：EI離子源；電子能量設(shè)為70eV；傳輸線溫度230℃；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍在35～500之間。

常溫組如圖2、3、4、5，其中，冷藏組在3天內(nèi)成分均變化不明顯，故以常溫組的圖譜作為最佳案例。

(3)采用PLS-DA法對(duì)所有樣品的GC-MS譜圖信息進(jìn)行分析:依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)(NIST)對(duì)不同腐化程度的鮑魚內(nèi)臟樣品的GC-MS圖譜的成分進(jìn)行檢索定性，采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析，提取樣品組分的共有信息，用共有化學(xué)成分的峰面積為指標(biāo)，由圖2、3、4、5可知，通過(guò)其中標(biāo)志性成分的變化，例如隨著儲(chǔ)藏期變化，氨(NH)和胺(R-NH)等堿性含氮物的峰高以及面積顯著增加等變化，以及一些風(fēng)味成分醇、酮、萘等的顯著減少，利用PLS-DA法即可將其結(jié)果進(jìn)行推斷，判定其新鮮度。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。