本發(fā)明涉及一種大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇的免疫親和凈化-高效液相色譜檢測方法，屬于儀器檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)是一大族化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的真菌毒素，由鐮刀菌屬、漆斑霉屬、木霉屬、單端孢屬、頭孢霉屬、輪枝孢霉屬和黑色葡萄狀穗霉屬中的一些真菌產(chǎn)生。單端孢霉烯族毒素對真核細(xì)胞具有多重抑制作用，通過對蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成的抑制，以及對線粒體功能、細(xì)胞分裂和膜功能的抑制，從而對人類和動物的健康產(chǎn)生免疫抑制作用。
單端孢霉烯族毒素劃分為4種類型：A、B、C、D型，其中，B型單端孢霉烯族毒素比較常見。B型單端孢霉烯族毒素是由鐮刀菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，其基本結(jié)構(gòu)為四環(huán)的倍半萜，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)與雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)污染范圍較廣，污染水平較高，廣泛存在于多種谷物及其制品中。
DON又稱嘔吐毒素，對飼料的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首，可以抑制蛋白質(zhì)合成，破壞大腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，如果長期攝入，還會引起機體免疫能力降低。1998年，國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)公布的評估報告中，DON被列為第3類致癌物。近年來研究表明，DON與人類食管癌、IgA腎病、胃癌、骨關(guān)節(jié)病有關(guān)。NIV具有與前者相似的毒性，雖然其污染率與毒性相對較低，但也廣泛存在于多種農(nóng)作物中，危害性不容忽視。
在食品和飼料中，單端孢霉烯族毒素主要來源于被真菌污染的大米、小麥和玉米等糧食。由這些原料加工成的早餐麥片、焙烤制品、啤酒及配合飼料等產(chǎn)品中，往往含有單端孢霉烯族毒素。因此，對于大米等原料中DON和NIV的檢測對于防范毒素污染具有比較重要的意義。這些霉菌毒素可能正通過被污染的谷物、飼料和由這些飼料喂養(yǎng)的動物所提供的食品(奶、肉、蛋等)進(jìn)入食物鏈。
國際上對于DON的檢測方法研究進(jìn)展很快。Trucksess等先后提出了薄層色譜法(Thin Layer Chromatography，TLC)和高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)等檢測方法；Tacke等提出了采用柱凈化法結(jié)合電子捕獲檢測器的氣相色譜法(Gas Chromatography/Electron CapturedetectorGC/ECD)；Casale等提出了酶聯(lián)免疫吸附試驗法(Enzyme Linked Immunosorbent assay，ELISA)。而對于NIV的檢測方法，相關(guān)研究較少，目前也未有國家對該毒素提出限量標(biāo)準(zhǔn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇的免疫親和凈化-高效液相色譜檢測方法。
本發(fā)明提供的方法包括下列步驟：
(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置
將DON和NIV標(biāo)準(zhǔn)原液氮氣吹干，以空白大米基質(zhì)提取液分別配置成0、0.1、0.5、1.0、2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
(2)樣品前處理
取大米樣品500g，用粉碎機粉碎并通過2.0mm圓孔篩，混勻，裝入潔凈容器內(nèi)，密封4℃保存。
稱取3g試樣于50mL離心管中，加入30mL 60％乙腈水溶液、2-8g氯化鈉和2-8g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用；在離心管中繼續(xù)加入30mL30％乙醇水溶液和2-8g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用。
將兩次上清液合并，取10mL上清液于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻3min，5000r/min離心2min，棄去上層正己烷層，于45℃氮氣吹干，加5mL水充分溶解殘渣，待凈化。
將提取液全部緩慢通過免疫親和柱，流速2～3mL/min，此過程中不要吹干免疫親和柱，隨后以10mL超純水淋洗免疫親和柱，吹干免疫親和組30s，最后以4mL甲醇乙腈溶液(1:3)洗脫DON和NIV，洗脫液氮氣吹干，以1mL10％乙腈水溶液定容。
(3)液相色譜檢測
條件是：流動相：10％乙腈水溶液，流速：0.9mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：218nm，進(jìn)樣量：50μL。
上述方法中，60％乙腈水溶液、10％乙腈水溶液都是體積分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明采用免疫親和柱(Immunoaffinity Column，IAC)凈化結(jié)合高效液相色譜法對大米中的DON、NIV同時進(jìn)行檢測，該方法操作簡便、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好。而且，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過改進(jìn)樣品前處理工藝，在提取液中加入萃取劑-氯化鈉和氯化鈣，同時，對第一次提取后的殘渣用乙醇進(jìn)行二次提取，回收率大大提高。
具體實施方式
實施例1
本實施例提供的方法包括下列步驟：
(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置
將DON和NIV標(biāo)準(zhǔn)原液氮氣吹干，以空白大米基質(zhì)提取液分別配置成0、0.1、0.5、1.0、2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
(2)樣品前處理
取大米樣品500g，用粉碎機粉碎并通過2.0mm圓孔篩，混勻，裝入潔凈容器內(nèi)，密封4℃保存。
稱取3g試樣于50mL離心管中，加入30mL 60％乙腈水溶液、5g氯化鈉和5g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用；在離心管中繼續(xù)加入30mL 30％乙醇水溶液和5g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用。
將兩次上清液合并，取10mL上清液于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻3min，5000r/min離心2min，棄去上層正己烷層，于45℃氮氣吹干，加5mL水充分溶解殘渣，待凈化。
將提取液全部緩慢通過免疫親和柱，流速3mL/min，此過程中不要吹干免疫親和柱，隨后以10mL超純水淋洗免疫親和柱，吹干免疫親和組30s，最后以4mL甲醇乙腈溶液(1:3)洗脫DON和NIV，洗脫液氮氣吹干，以1mL10％乙腈水溶液定容。
(3)液相色譜檢測
條件是：流動相：10％乙腈水溶液，流速：0.9mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：218nm，進(jìn)樣量：50μL。
實施例2
本實施例提供的方法包括下列步驟：
(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置
將DON和NIV標(biāo)準(zhǔn)原液氮氣吹干，以空白大米基質(zhì)提取液分別配置成0、0.1、0.5、1.0、2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
(2)樣品前處理
取大米樣品500g，用粉碎機粉碎并通過2.0mm圓孔篩，混勻，裝入潔凈容器內(nèi)，密封4℃保存。
稱取3g試樣于50mL離心管中，加入30mL 60％乙腈水溶液、8g氯化鈉和8g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用；在離心管中繼續(xù)加入30mL 30％乙醇水溶液和8g氯化鈣，振蕩提取30min，以5000r/min離心5min，取上清液備用。
將兩次上清液合并，取10mL上清液于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻3min，5000r/min離心2min，棄去上層正己烷層，于45℃氮氣吹干，加5mL水充分溶解殘渣，待凈化。
將提取液全部緩慢通過免疫親和柱，流速2mL/min，此過程中不要吹干免疫親和柱，隨后以10mL超純水淋洗免疫親和柱，吹干免疫親和組30s，最后以4mL甲醇乙腈溶液(1:3)洗脫DON和NIV，洗脫液氮氣吹干，以1mL10％乙腈水溶液定容。
(3)液相色譜檢測
條件是：流動相：10％乙腈水溶液，流速：0.9mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：218nm，進(jìn)樣量：50μL。
實施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測低限
按照實施例1公開的步驟進(jìn)行檢測。以空白基質(zhì)提取液配置脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0.1～2.0mg/kg范圍內(nèi)，對所得峰面積與濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。
表1脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇線性范圍和相關(guān)系數(shù)
該方法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇的檢測低限皆為0.1mg/kg，該濃度水平下的色譜峰可以達(dá)到10倍信噪比要求，同時滿足國際限量要求。
實施例4回收率實驗
按照實施例1公開的步驟進(jìn)行檢測。以空白基質(zhì)提取液配置脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白大米基質(zhì)中。
在0.1～2.0mg/kg范圍內(nèi)，大米基質(zhì)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回收率為95.7％～103.48％，說明該方法性能滿足要求，尤其是改進(jìn)的前處理的工藝，可以最大限度的將樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提取出來。室內(nèi)重復(fù)性RSDr全部小于10％，說明該方法的重復(fù)性良好。HorRat值全部小于0.5，說明該方法在相應(yīng)的測定濃度下有很好的重現(xiàn)性。具體數(shù)據(jù)如下：
表2大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測方法評價數(shù)據(jù)
注：HorRat(r)＝RSD(r)/PRSD(R)，PRSD(R)＝2*C^(-0.15)
在0.1～2.0mg/kg范圍內(nèi)，大米基質(zhì)中雪腐鐮刀菌烯醇的回收率為96.08％～101.68％，說明該方法性能滿足要求。室內(nèi)重復(fù)性RSDr全部小于10％，說明該方法的重復(fù)性良好。HorRat值全部小于0.5，說明該方法在相應(yīng)的測定濃度下有很好的重現(xiàn)性。
表3大米中雪腐鐮刀菌烯醇檢測方法評價數(shù)據(jù)
注：HorRat(r)＝RSD(r)/PRSD(R)，PRSD(R)＝2*C^(-0.15)。